Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Основные типы биологических ритмов и систем их контроля.. 10
1.1.1. Осциллятор и наблюдаемые ритмы 13
1.1.2. Кривая подстройки фазы: почему она важна? 18
1.1.3 .Генетический анализ циркадианного осциллятора 20
1.1.4. Околоприливный осциллятор 25
1.2. Основные черты экологии и биологии размножения береговых крабов рода Sesarma 26
1.2.1. Репродуктивная система береговых крабов 27
1.2.2. Синхронизация нереста крабов с циклами внешней среды 30
1.2.3. Синхронизация хатчинга эмбрионов 33
1.3. Нерестовые протеиназы: структура и биологические функции 38
1.4. Белки теплового шока и их роль в эмбриогенезе 41
2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Животные и микроорганизмы для экспериментов 45
2.2. Реактивы и среды 47
2.3. Очистка протеиназы хроматографическими методами 50
2.4. Электрофорез белков 51
2.5. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся в программе нереста крабов 51
2.6. Скрининг библиотеки кДНК и клонирование гена, кодирующего OHSS 57
2.7. Статистическая обработка данных 60
3. Результаты исследований 61
3.1 Выделение и очистка нерестовой протеиназы 61
3.1.1. Биологическая активность OHSS 61
3.1.2. Очистка и выделение нерестовой протеиназы методами хроматографии 63
3.1.3. Устойчивость биологической активности OHSS 64
3.1.4. Реципрокный анализ эффекта нерестовой воды береговых крабов 66
3.1.5. Очистка OHSS методом RP-HPLC 67
3.1.6. Частичное аминокислотное сиквенирование OHSS 68
3.1.7. Клонирование гена кодирующего OHSS 70
3.1.8. Анализ аминокислотной последовательности OHHS 72
3.1.9. Поиск последовательностей, гомологичных гену OHSS с использованием базы данных международного банка генов 72
3.1.10. Анализ структуры гена кодирующего OHSS и его активности 74
3.1.11. Пострансляционная модификация и активация OHSS 77
3.1.12. Использование поликлональных антител для детекции OHSS в тотальном белке эмбрионов 80
3.1.13. Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей OHSS и множественность локусов гена 81
3.1.14. Морфологические изменения в абдоменальных волоска: под дейтвием OHSS 83
3.1.15. Межвидовые различия в структуре OHSS 85
3.2. Инициация хатчинга эмбрионов в лаборатории и применение вычитающей гибридизации на модели программы нереста крабов 87
3.2.1. Инициация хатчинга эмбрионов - эффект органических соединений 87
3.2.2. Поиск генов специфичных для программы хатчинга с использованием вычитающей гибридизации 91
3.2.3. Анализ экспрессии и структуры гена кодирующего HSP-90 94
Обсуждение результатов 97
Выводы 107
Список литературы 109
- Синхронизация нереста крабов с циклами внешней среды
- Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся в программе нереста крабов
- Частичное аминокислотное сиквенирование OHSS
- Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей OHSS и множественность локусов гена
Введение к работе
Феномен биологических ритмов в живых системах — одно из самых загадочных и малоизученных явлений в природе. Внутренние часы организмов разных уровней организации демонстрируют удивительную стабильность и, в то же время, достаточную пластичность для подстраивания фазы активности под изменяющиеся внешние циклы среды. Многочисленными экспериментами было показано, что даже в отсутствии регулярной внешней стимуляции, биологические ритмы самоподдерживаются в организме на продолжении длительного времени (Enright, 1980 и др.).
Современные методы исследований позволили выявить и охарактеризовать основные механизмы молекулярного контроля циркадианных ритмов у ряда видов беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека. Были установлены группы генов, экспрессирующихся лишь в определенный период светового цикла (Chen et al., 1991; и др.). На основании этих экспериментальных данных проведено генетическое исследование «clock-мутантов» дрозофилы и была построена детальная модель циркадианного осциллятора (Helfrich-Forster, 1996). Понимание биохимических механизмов, лежащих в основе функционирования околосуточных биологических часов, было успешно применено в фармацевтике для создания ряда лекарственных препаратов (Kondo et al., 1994; и др.).
Наряду с этими, достаточно хорошо изученными, механизмами молекулярного контроля существуют уникальные примеры синхронизации биологической активности с внешними циклами среды. Одним из них является нерестовое поведение некоторых видов крабов семейства Grapsidae. Взрослые особи крабов ведут полусухопутный образ жизни, возвращаясь на берег для нереста лишь один-два раза в год.
Там, после месячной инкубации, на абдоменальных придатках икра стряхивается в морской воду, и личинки краба переходят к планктонному образу жизни. Уникальность этого события в том, что нерест крабов строго ассоциирован с ночными приливами и не происходит в другое время (Saigusa, 2000). Другая особенность поведения крабов в том, что в течение получаса после попадания в морскую воду эмбрионы прорывают яйцевые оболочки и переходят к свободноплавающему личиночному образу жизни. Выклев эмбрионов крабов (хатчинг — от англ. hatching) находится в непосредственной зависимости от поведения самки. В лабораторных условиях выклев также высоко синхронизирован среди эмбрионов. Однако, отделенные от абдомена самки более чем за 48 часов до ожидаемого момента хатчинга эмбрионы не способны завершить развитие. А эмбрионы, изолированные от самки менее чем за 48 часов до момента нереста, способны самостоятельно завершить эмбриогенез и перейти в личиночную стадию. Молекулярные основы контроля биологических часов такого типа к настоящему времени не были известны. Лишь для некоторых десятиногих ракообразных установлено существование гомологов clock-локусов, но косвенное участие этих генов было продемонстрировано в контроле циркадианной структуры только для локомоторной активности (Naylor, 1985, 1997). Между тем, контроль времени хатчинга эмбрионов Grapsidae представляет собой, по видимому, совершенно иную структуру, независимую от циклического изменения уровня РНК отдельных генов под влиянием светового режима. Другой сложностью изучения механизмов хатчинг-программы (термин Saigusa, 2000) у крабов является отсутствие информации о нерестовых ферментах ракообразных. Эта группа ферментов ответственна за полное или частичное растворение яйцевых оболочек у многих рыб, морских ежей и амфибий (Lepage et al., 1990; Lin et al., 2000). Как было показано,
экспрессия этих белков непосредственно связана со временем предполагаемого нереста.
Таким образом, три аспекта изучения нереста полусухопутных крабов на наш взгляд представляют особый интерес. Это — механизмы контроля времени хатчинга, идентификация генов, экспрессия которых непосредственно связана с хатчинг-программой, а также выявление и характеристика активных веществ, вовлеченных в процессы морфологических и физиологических изменений, сопровождающих хатчинг.
Цель исследования. Идентификация генов и многофакторный анализ активных веществ, участвующих в регулировании времени хатчинга развивающихся эмбрионов у берегового краба Sesarma haematocheir, а также попытка инициации хатчинга in vitro.
В ходе иследования нами решались следующие задачи:
1. Идентифицировать и проанализировать гены, которые
экспрессируются избирательно лишь в эмбрионах, находящихся в
программе хатчинга.
2. Выделить соединения, являющиеся аналогами или гомологами
нерестовых ферментов у крабов и участвующие в частичном или полном
растворении яйцевых оболочек, которое является условием успешного
хатчинга.
3. Разработать способ искусственной инициации хатчинг-
программы эмбрионов в лабораторных условиях воздействием
химических соединений или физических факторов.
Научная новизна. Идентифицирована и выделена новая сериновая протеиназа, а также клонирован кодирующий ее ген. Было показано, что данный фермент частично растворяет яйцевые оболочки, а также способствует удалению остающихся после хатчинга эмбрионов яйцевых
оболочек с плеопод самки, подготавливая тем самым их к новой кладке икры. Наличие такого фермента является эволюционным преимуществом крабов, так как позволяет начинать инкубацию новой партии икры без линьки, тогда как для других десятиногих раков линька является необходимым условием очистки плеопод и подготовки для новой инкубации яиц.
В ходе экспериментов по сравнению библиотек генов,
экспрессирующихся в эмбрионах на разных этапах хатчинг-программы,
методом супрессионной вычитающей гибридизации был
идентифицирован и клонирован новый ген, по структуре схожий с генами кодирующими белки теплового шока (HSP-90). Показано, что экспрессия этого гена многократно усиливается в эмбрионах, находящихся в хатчинг-программе. Предложена гипотеза о возможной схеме участия стрессовых белков в инициации программы хатчинга в эмбрионах крабов Grapsidae.
Установлена возможность искусственной инициации хатчинга эмбрионов при воздействии ряда химических веществ. В этом случае хатчинг также был высоко синхронизирован среди эмбрионов. Проведен сравнительный анализ возможности изменения временного механизма в эмбрионах крабов и полученных ранее данных о структуре захватывания ритмов активности некоторых видов обитателей беломорской литорали.
Практическая значимость работы. Разведение десятиногих раков является на сегодняшний день одним из перспективных направлений морской биотехнологии. Один из ключевых моментов в этом направлении - эффективный мониторинг и возможность контроля репродуктивных циклов промысловых видов этой группы. Данное исследование является первой попыткой выявления молекулярных механизмов временной упорядоченности выклева эмбрионов крабов и сопутствующих ему морфологических изменений. Результаты работы
могут послужить основой разработки комплексных подходов к искусственному контролю репродуктивных циклов десятиногих раков в аквакультуре.
Апробация работы. Результаты основных этапов диссертационной работы были доложены и обсуждались на Научных ассамблеях Международного комитета «COSPAR» (Нагойя, Япония, 1998; Варшава, Польша, 2000; Хьюстон, США, 2002; Париж, Франция, 2004), на Международной конференции «Белое море: фауна и экология» (Петрозаводск, 1999), на Ежегодном симпозиуме Зоологического общества Японии (Фукуока, 2001; Каназава, 2002; Хакодате, 2003; Кобе, 2004), на Ежегодных заседаниях Японского общества эмбриологии членистоногих (Сунадайра, 2002; Итако, 2003); на XIX Международном генетическом конгрессе (Мельбурн, Австралия, 2003), на итоговых научных конференциях Казанского университета в 2001, 2002, 2003; на международной конференции «Геон-2003» (Казань, 2003), на XIX Международном зоологическом конгрессе (Пекин, Китай, 2004). Заявлено участие в Международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004).
Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 10 научных работ в зарубежных журналах и изданиях трудов российских и зарубежных конференций.
Положения, выносимые на защиту:
1. Частичное растворение яйцевых оболочек при нересте крабов происходит при участии сериновой протеиназы пострансляционно принимающей двухдоменную форму. Протеиназа обладает высокой стрессовой устойчивостью и является первым выделенным представителем нерестовых протеиназ в ракообразных.
2. Выклев эмбрионов крабов может быть направленно инициирован
кратковременным воздействием растворов ряда кетонов.
3. Инициация выклева (хатчинга) эмбрионов крабов происходит
при участии стрессового белка HSP-90, экспрессия которого в
развивающихся эмбрионах многократно возрастает за 40-45 часов до
хатчинга.
Синхронизация нереста крабов с циклами внешней среды
Временная упорядоченность репродуктивного цикла у береговых крабов подвержена влиянию множества факторов окружающей среды. При этом большинство авторов рассматривают изменение температуры, как основной стимул к началу репродуктивного сезона (Naylor, 1997). Однако, температурный эффект у морских беспозвоночных имеет большую вариабельность среди близкородственных видов и даже отдельных популяций, адаптирующихся к различным климатическим режимам. Начало сезона размножения может совпадать с увеличением количества пищи пригодной для личинок (зоопланктон) синхронизированным с общей продуктивностью в прибрежных водах. Так популяции крабов Sesarma reticulata начинают репродуктивный цикл в период, когда температура и общая продуктивность биомассы прибрежных вод резко возрастают. Оогенез у крабов Sesarma начинается в самом начале года при повышении температуры воздуха, но максимальный рост яичников, ведущий к появлению неоплодотворенных яиц, наблюдается лишь незадолго перед повышением биопродуктивности прибрежной зоны. Это предполагает, что кроме температуры присутствуют и другие факторы критичные для начала инкубации яиц (световой цикл и др.) Репродуктивный период заканчивается в конце августа - начале сентября, когда яичники становятся неактивными после откладки последней партии икры. В это время температура воды все еще высока, но общая биопродуктивность прибрежной зоны начинает снижаться (Sklar and Turner, 1981).
Большинство крабов в лабораторных условиях откладывают последнюю партию яиц и линяют позже своих собратьев в природе, что подразумевает сбивание естественного природного ритма при содержании в неволе. Если снижение продолжительности светлого периода суток является ключевым сигналом для завершения репродуктивного периода в естественных популяциях крабов, то постоянный фотопериод в лаборатории мог являться причиной увеличения продолжительности репродуктивного периода (Zimmerman andFelder, 1991).
В естественных условиях линька крабов происходит вскоре после первого нереста весной и после последнего осенью. В это время наблюдается практически полное отсутствие оогенеза. Максимальное количество откладываемых яиц наблюдается в весенний период, и постепенно снижается после весенней линьки. Продолжительность репродуктивности цикла, возможно, не позволяет береговым крабам получить достаточно питательных веществ необходимых для продукции максимального количества яиц позволяемого размерами тела. Весенняя кладка икры более «благополучна» для крабов с более длинным периодом оогенеза: отсутствие соматического роста, сопровождающего линьку, позволяет тратить больше энергии на воспроизводство желтка. Другое возможное объяснение этому феномену - повышение смертности эмбрионов в летний период. Количество яиц пораженных паразитическими простейшими и нематодами повышается в летний период. Многие десятиногие раки характеризуются груминг-поведением, следя за чистотой кладки икры, но этот феномен практически не встречается у береговых крабов (Palmer, 1997).
Структура репродуктивного цикла ряда береговых крабов также отражает адаптацию к пониженной солености эстуарийной зоны. Так, по сравнению с обитающим в более солоноватой воде Sesarma cinereum, большинство представителей рода Sesarma характеризуются более продолжительным эмбриогенезом, увеличением среднего размера икринки, снижением количества стадий зоеа и общим снижением продолжительности личиночных стадий. Уменьшение числа личиночных стадий с 5 до 2-х у некоторых видов Grapsidae, рассматривается как адаптация к сухопутному и полу-пресноводному образу жизни, которая возможно способствует развитию устойчивой осморегуляции (Palmer , 1997). 1.2.3. Синхронизация выклева эмбрионов
Самым удивительным, на наш взгляд, является феномен синхронизации времени выклева (или хатчинга от английского «hatching») крабов со временем сизигийных приливов. Такой окололунный ритм, синхронизирующий время нереста крабов с весенними приливами, по мнению ряда авторов, является адаптацией крабов позволяющей повысить шанс выживаемости личинок путем более интенсивного транспорта их из эстуарийной зоны в море (Christy 1982), хотя личинки крабов Sesarma после нереста держатся у дна, что способствует их более длительному нахождению в эстуарийной зоне. Таким образом, период высоких приливов позволяет самкам крабов нереститься в зонах не подверженных влиянию обычных приливов и способствует более интенсивной транспортировке личинок из болотистых зон и мелководья в более глубокие прибрежные воды. Для того чтобы время хатчинга эмбрионов совпало с оптимальными для их выживания условиями окружающей среды (например, временем сизигиев), икра должна быть отложена в определенный период, который, учитывая длительность эмбрионального развития, варьирует в зависимости от различных эндогенных факторов (температуры и т.д.).
Длительность эмбрионального развития крабов Sesarma reticulatum в лабораторных условиях составляет в среднем 17-18 дней, и нерест практически всегда совпадает по времени с фазами новой и полной лун в естественной среде обитания. В то же время, в начале репродуктивного периода, время нереста ряда береговых крабов не совпадает с лунными фазами. Такая асинхрония репродуктивной фазы была показана для крабов обитающих на более высоких широтах и рассматривается рядом авторов как побочный эффект более холодной температуры в зимний период перед началом репродуктивного сезона (Christy, 1982). Резкое повышение температуры, ведущее к повышению активности яичников, рассматривается как стрессовый фактор, нарушающий синхронизацию репродуктивного цикла у самок, по-разному перенесших зимовку. В то же время береговые крабы, заселяющие более теплые регионы, характеризуются высоким уровнем синхронизации хатчинга со временем сизигиев даже в первый весенний нерест.
Общая схема репродуктивного сезона отдельно взятой самки краба рода Sesarma, представленная на рис. 8, дает представление о синхронизации хатчинга с наиболее благоприятными условиями для распространения и выживания личинок. Слегка отклоняющаяся от окололунной периодичности откладка яиц и последующая семнадцатидневная инкубация эмбрионов позволяют синхронизировать время хатчинга с сизигийными приливами. Шестнадцатидневный период позволяет личинкам легче освоить местообитания родителей в эстуарийной зоне, пользуясь высокими приливами. Следующий за созреванием неоплодотворенных яиц и ограниченный во времени период декальцификации половых придатков и копулятивной восприимчивости является, по-видимому, стимулом для самок крабов спариваться с как можно большим количеством самцов. Это является наиболее "репродуктивно выгодным" в случае, когда несколько поколений будут оплодотворены хранящимися сперматофорами.
Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся в программе нереста крабов
Выделение суммарной РНК. Для выделения суммарной РНК использовали модификацию гуанидин-тиоцианатного метода, предложенного Chomczynski и Sacchi. Ткани крабов и их эмбрионы гомогенизировали в 1 мл TRIzol реагента (Invitrogen). После полного растворения ткани инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли 200 мкл хлороформа и интенсивно встряхивали на вортексе 15-20 секунд. После интенсивного встряхивания смесь центрифугировали при 12000g 15 мин при 4С, переносили верхнюю фазу в новую пробирку и осаждали 500 мкл изопропанола. После центрифугирования осадок РНК промывали 80% этаноловым спиртом. Осадок растворяли в 20 мкл бидистиллированной воды и использовали для синтеза кДНК.
Синтез первой цепи кДНК и амплификацию библиотеки кДНК. Его проводили в соответствии со стандартным протоколом Marathon cDNA Synthesis Kit (Clontech) в объеме 10 мкл в присутствии 20 пмоль Т-праймера в качестве затравки. На реакцию брали по 1 мкг тотальной РНК. Обратную транскриптазу инактивировали нагреванием при 95 С в течение 5 минут.
Супрессионная гибридизация. Основные процедуры выполняли, как описано в протоколе PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech: http://www.clontech.com/techinfo/manuals/).
Зеркально ориентированная селекция. Суть процедуры MOS заключается в повторной гибридизации после изменения одного из адаптеров, фланкирующего молекулы обогащенных SSH-библиотек. Последовательность событий включает в себя удаление одного из адаптеров путем отщепления эндонуклеазой, далее тепловую денатурацию и реассоциацию образца SSH.
Образцы обогащенных кДНК библиотек амплифицировали, и полученный ПЦР продукт чистили путем экстракции смесью фенола с хлороформом. После чего водную фазу экстрагировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). Далее переосаждали этанолом и промывали 80% этаноловым спиртом. Осадок растворили в 20-40 мкл буфера NTE (10 mM NaCl, 10 тМ Tris-HCI, 0.1 тМ EDTA) до концентрации 20-30 нг/мкл ДНК. Франкционировали 2 мкл очищенного продукта третичной ПЦР в 2.0% агарозном геле с EtBr в IX ТАЕ буфере. В качестве контрольного образца 1 мкл очищенного продукта третичной ПНР растворили в 1.6 мкл Н20.
Адаптор удаляли в реакции расщепления с эндонуклеазой Хта І в течение 1 часа при 37С. Реакционная смесь состояла из следующих реагентов:
Переносили 2 мкл полученной смеси в новую 0.5 мл пробирку, добавили каплю минерального масла и инкубировали в программируемом термостате при 98С 1.5 мин. Не вынимая пробирки из термостата, переключали температуру блока на 68С и инкубировали 3 часа. Добавляли 200 мкл буфера для разведения и хорошо перемешали путем пипетирования. Далее прогревали в термостате при 70С 7 мин для денатурации неправильных дуплексов. Для амплификации MOS кДНК библиотек приготовляли три реакционных ПЦР смеси, как показано ниже: Добавляли no 2 мкл каждого разведенного образца ДНК (после гибридизации и соответствующие контроли). В каждую пробирку добавляли по капле минерального масла и инкубировали в программируемом термостате при 74 С 4 минуты для достройки адаптеров. (Не вынимайте образцы из программируемого термостата). На этом шаге происходит достройка недостающей цепи адаптеров, создавая, таким образом, сайт посадки ПЦР праймеров. Далее использовали следующую программу: 94С 30 сек 62С 30 сек 72С 1.5 мин, всего 19 циклов. Анализировали по 4 мкл из каждой реакции в 2.0% агарозном геле с EtBr в IX ТАЕ буфере.
Полученные образцы обогащенных кДНК библиотек клонировали в вектор pGEM (Promega) как после SSH, так и после MOS. Процедуры лигирования проводили в соответствии со стандартными методиками, либо методиками к соответствующим наборам реактивов
Дифференциальный скрининг обогащенной библиотеки. С полученных на предыдущем этапе чашек Петри, колонии со вставками пересевали в 96-луночные иммунологические планшеты с 200 мкл среды LB с ампицилином (на лунку). Клетки растили ночь при 37С на шейкере при 100 об/мин. С шейкера плашки снимали непосредственно перед постановкой ПЦР в плашках.
Частичное аминокислотное сиквенирование OHSS
Для определения N-концевой последовательности протеиназы, белок, содержащийся во фракциях 5 и 6, переносили на мембрану методом полусухого блоттинга и секвенировали на секвенаторе Applied Biosystems (USA). Кроме того, белок в данных фракциях подвергался частиному гидролизу с использованием лизил-эндопептидазы с последующей элюцией на RP-HPLC, после чего аминокислотная последовательность полученных полипептидов анализировалась на газовом аминокислотном сиквенаторе.
Результаты сиквенирования показали, что белок характеризуется присутствием двух N-концов, но достоверно удалось охарактеризовать лишь один из них. Ниже приведена N-концевая аминокислотная последовательность OHSS: Кроме того, были отсеквинерованы 3 полипептида, полученные в результате частичного гидролиза OHSS: 1. NNDVGVLWQ(Pep-l). 2. LWVIGWGATM (Рер-2). 3. LRDVEVTVLA (Рер-3). N-концевая последовательность OHSS характерна для типичных трипсиноподобных сериновых протеиназ. Аминокислотные последовательности полипептидов (Pep 1-3) также показали высокую степень гомологии с первичной структурой трипсина. На основе этого нами было сделано предположение о принадлежности OHSS к группе сериновых протеиназ .
Используя полученные аминокислотные последовательности, нами были синтезированы вырожденные нуклеотидные праймеры. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был применен для клонирования гена кодирующего OHSS с использованием библиотеки кДНК, созданной на основе тотальной РНК, извлеченной из эмбрионов крабов зафиксированных за 12 и 6 часов до предполагаемого момента нереста. Результатом данного эксперимента явилось успешное клонирование полноразмерной кДНК длиной 1759 п.н. и содержащей единственную открытую рамку считывания (ОРС) кодирующую 492 аминокислоты (нуклеотидная последовательность зарегистрирована в GenBank под номером AY306010). Структура и первичный анализ полученной кДНК представлен на рис. 15.
Рис. 15 Нуклеотидная последовательность кДНК и предсказанная аминокислотная последовательность OHSS. - предсказанные сайты N-гликозилирования, - сайт каталитической активации протеиназы. Int. 1-3 - положение интронов. Pep 1-3 -участки предсказанной аминокислотной последовательности соответствующие секвинированным полипептидам. Стартовый метионин и сигнальный пептид выделены жирным шрифтом. Заключенные в овалы аминокислоты (D, S и Н) соответствуют каталитической триаде характерной для сериновых протеиназ. Rl, R2, Dl, D2. - положение нуклеотидных праимеров использованных для клонирования и субклонирования гена OHSS; taataaa - сайт полидснилирования
Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей OHSS и множественность локусов гена
Одним из неразрешенных вопросов оставался факт различий аминокислотной последовательности отсеквинированных полипептидов (Pep 1-3) от предсказанной на основе нуклеотидной структуры гена кодирующего OHSS. Возможное объяснение этому, как и проявление специфичной активности OHSS сразу в нескольких белковых фракциях в процессе хроматографии, было найдено при более детальном анализе кДНК синтезированной на основе мРНК эмбрионов крабов. Как было показано выше, ПЦР-скрининг библиотеки кДНК из эмбрионов позволил нам клонировать последовательность гена кодирующего протеиназу. Более детальный анализ продуктов ПЦР с использованием специфичных к гену OHSS праймеров показал, что продукт реакции содержит две последовательности кДНК имеющих небольшие отличия в нуклеотидной последовательности (рис. 21). Отличия в структуре кДНК двух изоформ наблюдались в зоне соответствующей некаталитической цепи активной формы протеиназы. Два изоварианта были названы нами gOHSS-І и gOHSS-2. (рис. 21). В то время как некаталитическая цепь протеиназы демонстрировала различия в аминокислотной структуре, протеолитические домены обеих изоформ были полностью идентичны. ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК выявил наличие двух главных продуктов реакции, различающихся молекулярной массой. Последующее сиквенирование продуктов реакции показало, что оба фрагмента соответствуют изоформам OHSS и в gOHSS-1 присутствует дополнительный интрон размером 432 п.н. в позиции 456-457. В процессе сплайсинга этот интрон удаляется постранскрипционно, что приводит к сходности размеров gOHSS-І и gOHSS-2. Таким образом, было показано, что OHSS представлена в геноме краба, по крайней мере, двумя локусами.
Дополнительные данные о сплайсинговых изменениях в структуре кодирующей OHSS мРНК были получены при более детальном анализе gOHSS-1. Нами было показано, что транскрипт представлен двумя вариантами. Второй вариант отличался от первого делециеи двух коротких амикислотных последовательностей.
Проведен анализ морфологических изменений в структуре абдоминальных волосков до, и после инкубации их с OHSS (рис. 22). Как было показано, биологическая активность OHSS приводит к отслоению внутренней оболочки абдоменальных волосков в месте соединения их со стебельком икринки, но не расщепляет их полностью. Внешне это напоминает изменение в структуре внутреннего слоя оболочки икринки.
Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что присутствие второй полипептидной цепи, по-видимому, обуславливает такую специфичность действия фермента при базовом высоком уровне протеолитической активности трипсинового домена OHSS. Представляется вероятным, что протеиназа действует специфично лишь на один и структурных компонентов оболочки яйца, но механизм такой избирательности пока не известен. Рядом работ было показано, что экология различных видов береговых крабов отражается и на структуре яйцевых оболочек (Saigusa, 1982). Так, морфологически яйцевые оболочки краба Sesarma haematocheir, являющегося полу-сухопутным, отличаются по структуре и толщине слоев от Hemigrapsus sanguineus, ведущего сублиторальный образ жизни. Принимая во внимание высокую специфичность биологической активности OHSS, мы предположили, что объяснение уменьшения эффекта протеиназы на абдоминальные придатки других видов береговых крабов может быть объяснено на основе различий в структуре аминокислотной последовательности.
Путем гибридизационного анализа библиотеки кДНК, созданной с использованием мРНК из сублиторального краба Hemigrapsus sanguineus, нам удалось клонировать участок гена соответствующего гомологу OHSS в этом виде.
Прямое использование специфичных к OHSS нуклеотидных праймеров в ПЦР реакции с кДНК представителей основных групп десятиногих в качестве матрицы оказалось не эффективным. Нами было сделано предположение, что гомологи OHSS в других группах значимо отличаются по структуре нуклеотидной последовательности. Оно было подтверждено анализом частично клонированного из Hemigrapsus sanguineus гомолога гена кодирующего OHSS. Было выяснено, что гомология нуклеотидных последовательностей резко отличается по проценту идентичных оснований в каталитической и некаталитической части полипептидной цепи протеиназы (рис. 23). Так, аминокислотный состав каталитического домена был полностью идентичен в обоих белках, в то время как некаталитические части протеиназ значительно отличались друг от друга. На основе результатов нашей работы и литературных данных следует обозначить два возможных направления объяснения причины данного феномена:
1. Ключевую роль в определении субстратной специфичности играет лишь определенная аминокислотная последовательность (сайт связывания непосредственно с субстратом либо другими белками). В этом случае изменчивость в остальной части 23 kDa некаталитической цепи не ведет к критическим последствиям для активности протеиназы.
