Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний Сыркина, Марина Сергеевна

Введение к работе

Актуальность проблемы

Учитывая уровень смертности от рака в мире (свыше 7,5 млн. человек в год, по данным ВОЗ, что составляет более 13 % всех случаев смерти), в последнее время все острее чувствуется потребность в эффективных противораковых препаратах и диагностических средствах. Накопленные к настоящему времени знания о механизмах злокачественной трансформации, функционировании и молекулярном составе клеток, претерпевших такую трансформацию, а также определенные успехи в исследовании онкомаркеров - молекул, позволяющих различить нормальные и опухолевые клетки, - формируют прочную теоретическую базу для создания агентов, способных к селективному воздействию на раковые клетки.

Для отработки схемы получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы при создании бинарных противоопухолевых препаратов и диагностических средств, в качестве моделей нами были выбраны рак железистых органов и метастазирующая меланома человека. Эти два типа онкологических заболеваний обладают высоким метастатическим потенциалом и являются причиной летального исхода.

Терапия рака железистых органов при помощи методов, реализуемых в клинической практике, не всегда проходит успешно: в частности, гиперэкспрессирующиеся на поверхности раковых клеток муциновые гликопротеиды создают гидрофильный барьер для многих химиотерапевтических препаратов. Успехи в области таргетной терапии, в основном, связаны с использованием препарата Herceptin (Герцептин) производства Roche (Швейцария), представляющего собой антитело, специфически узнающее маркер рака молочной железы Her-2/neu. Однако данный онкомаркер присутствует только у 25-30 % больных раком молочной железы, что указывает на необходимость дополнительного поиска маркеров для клеток данного типа злокачественного новообразования.

Установлено, что при раке железистых органов в опухолевых клетках наблюдается гиперэкспрессия муцина MUC1. Кроме того, опухолевый MUC1 характеризуется нарушением апикальной локализации и аберрантным гликозилированием, приводящим к обнажению белкового кора в области тандемных повторов (VNTR) экстрацеллюлярного домена, в норме экранированного разветвленными олигосахаридами. Учитывая тот факт, что VNTR опухоль- ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка, можно было предположить, что VNTR, частично или полностью лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин.

В настоящее время продемонстрирована эффективность вакцин, содержащих пептиды из области VNTR муцина MUC1 человека. В частности, липосомальная вакцина Stimuvax (Стимувакс) производства Merck KGaA (Германия) проходит клинические испытания как препарат для активной специфической иммунотерапии немелкоклеточного рака легкого.

Однако при получении вакцин часто используют короткие пептиды, содержащие около 1,5 повторов из области VNTR. Во многом это обусловлено возможностями и особенностями химического синтеза пептидов. Тем не менее, в ряде работ было показано усиление иммунного ответа на вводимый антиген при полимеризации антигенных детерминант. В связи с этим, получение белков, содержащих не менее пяти повторов из области VNTR муцина MUC1 человека является весьма существенным для разработки противораковых вакцин.

Для усиления индукции иммунного ответа на вакцинирующий препарат применимы белки, обладающие характеристиками суперантигенов. С этой целью могут быть использованы бактериальные энтеротоксины, для которых продемонстрирована высокая способность к активации Т-лимфоцитов. В настоящее время достаточно подробно изучены энтеротоксины Staphylococcus aureus - определена их структура, функции и механизм активации иммунной системы. В экспериментах на мышах слитые бели, содержащие энтеротоксин А (SEA), продемонстрировали высокую эффективность при терапии солидных опухолей. Результаты этих экспериментов позволяют рассматривать энтеротоксины из S. aureus как перспективный иммуностимулирующий компонент вакцин, позволяющий существенно увеличить их эффективность.

Одной из основных проблем терапии онкологических заболеваний является метастазирование, т.к. метастазы и микрометастазы трудноидентифицируемы. Тем не менее, существует ряд молекулярных маркеров, позволяющих выявить опухолевые клетки, приобретшие способность к метастазированию. Одним из таких маркеров является маркер агрессивной фазы развития меланомы - интегрин av^3. Было продемонстрировано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина av^3 увеличена в 50100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом.

Исследования взаимодействия интегрина av^3 с внеклеточными лигандами позволили установить, что к высокоаффинному связыванию с экстрацеллюлярным доменом рецептора обладает трипептид Arg-Gly-Asp (RGD).

На данный момент существует ряд противоопухолевых препаратов на основе RGD, некоторые из них уже проходят клинические испытания.

Однако экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, выявили ряд требований к пространственной организации и аминокислотному окружению RGD-мотива, выполнение которых обеспечивает высокую эффективность и селективность связывания агента на основе RGD с мишенью. Кроме того, необходимо подчеркнуть положительную роль «поливалентности» меланома-узнающего адреса в увеличении эффективности связывания RGD- содержащего агента.

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что к настоящему времени при разработке противоопухолевых препаратов были достигнуты определенные успехи. Однако, результаты последних исследований открывают новые перспективы для создания эффективных терапевтических препаратов и диагностических средств, что определяет актуальность настоящей работы.

Цель работы:

1. Конструирование генов и экспрессионных плазмид для микробиологического синтеза в клетках E. coli рекомбинантных белков, применимых в диагностике и терапии онкологических заболеваний человека.

2. Отработка методов выделения и очистки рекомбинантных белков.

3. Исследование биологических свойств и оценка терапевтического потенциала полученных рекомбинантных белков.

Экспериментальные задачи:

3. 1. создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli рекомбинантного белка His₁O-VNTR₂₂, содержащего опухоль-ассоциированные антигенные эпитопы муцина MUC1 человека;

   2. создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli энтеротоксинов из Staphylococcus aureus H (SEH) и B (SEB), слитого со стрептавидином (SAV-SEB), отработка метода выделения данных белков и исследование их иммуностимулирующей способности;

   3. создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli слитых со стрептавидином белков (SdR), содержащих меланома-адресующие RGD- пептиды, отработка метода выделения и очистки таких рекомбинантных белков, а также оценка их селективности по отношению к клеткам меланомных линий человека и мыши.

   Научная новизна и практическая ценность работы

   3. 3. 1. Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках E. coli нового слитого белка His₁O-VNTR₂₂- С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к природному дегликозилированному VNTR муцина MUC1, способны к связыванию рекомбинантного His₁₀-VNTR₂₂. Полученные данные указывают на подобие структуры и конформации данного белка опухоль-ассоциированному VNTR муцина MUC1 человека. Это дает возможность использования данного рекомбинантного белка при создании онковакцины.

         2. Созданы экспрессионные конструкции для получения в клетках E. coli новых синтетических гибридных белков SdR, содержащих RGD-пептид, слитой со стрептавидином. Продемонстрировано селективное связывание таких гибридных белков с меланомными клетками человека и мыши. Этот факт позволяет предложить данные гибридные белки в качестве адресующих агентов при создании противомеланомных препаратов и диагностических средств.

         3. Создана конструкция для гетерологичной экспрессии в клетках E. coli предшественника энтеротоксина H из S. aureus (SEH). Продемонстрировано, что лидерный пептид SEH обеспечивает транслокацию рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток E. coli. Отработана методика хроматографической очистки рекомбинантного SEH.

         4. Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках E. coli энтеротоксина стафилококка B, слитого со стрептавидином (SAV-SEB). Структурное подобие SEB-компонента в составе химерного белка SAV-SEB природному SEB подтверждено результатами конкурентного связывания с антителами, полученными на природный SEB. Продемонстрировано, что белок SAV-SEB проявляет митогенную активность, характерную для природных энтеротоксинов из S. aureus. Этот факт позволяет предложить данный гибридный белок в качестве иммуностимулирующего агента при создании препаратов для адресной иммунотерапии рака, в том числе, двухфазной.

         Предложенные схемы выделения и очистки вышеупомянутых рекомбинантных белков могут послужить основой для разработки способов получения противораковых терапевтических агентов и диагностических средств.
         

         Структура диссертации

         Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы». Работа содержит список

         цитируемой литературы ( ссылок), 45 рисунков, 8 таблиц. Общий объем

         диссертации страниц.

         Апробация работы и публикации

         Таргетные молекулы, как правило, представляют собой бинарные агенты, состоящие из адресующей части, узнающей онкомаркер на поверхности раковой

         Диссертационная работа была представлена на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 5 марта 2012 г. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007), VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, Россия, 2010). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественном журнале, входящем в перечень ВАК РФ.

         Похожие диссертации на Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний

         

         Генетические факторы при сердечно-сосудистых заболеваниях: идентификация генов кандидатов и фармакогенетика терапии бетаксололомБровкин, Алексей Николаевич

         Особенности иммунного ответа при кожных заболеваниях, ассоциированных с герпетической инфекцией, и разработка подходов к их терапииПотапова Людмила Анатольевна

         Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свинейКазакова, Анна Сергеевна

         Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцинБлохина, Елена Александровна

         

         Конструирование и иммунологическая характеристика рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков вируса гепатита СГринев Андриян Анатольевич

         

         Значение измерения авидности антител класса IgG к отдельным белкам вируса гепатита С для диагностики различных форм инфекцийМукомолова Анна Львовна

         

         Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии ракаЭдельвейс Эвелина Федоровна

         

         Современная методология диагностики и терапии аллергических и аллергопаразитарных заболеваний.Дрынов, Георгий Игоревич

         

         Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс]Белова Ирина Викторовна

         Радиобиологическое и дозиметрическое обоснование радионуклидной терапии заболеваний щитовидной железыЛипанова, Наталья Николаевна