Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Разработка терапевтических средств, направленных на 9
тир03инкиназные рецепторы egfr и erbb2
Общие сведения о тирозинкиназных рецепторах 9
Разработка антител, направленных на EGFR и ERBB2 15
Антитела для направленной доставки токсинов к з2 опухолям
Использование рибонуклеаз для создания 41 противоопухолевых средств
Рибонуклеазы как противоопухолевые агенты 41
Механизмы цитотоксического действия рибонуклеаз 43
Причины избирательного действия рибонуклеаз на 49 опухолевые клетки
Рибонуклеазы, чувствительные к ингибитору рибонуклеаз 50
Бычья панкреатическая РНКаза А 50
Человеческие рибонуклеазы 52
1.3.5 Рибонуклеазы, нечувствительные к ингибитору рибонуклеаз 53
Рибонуклеазы земноводных 53
РНКаза из семенников быка 56
Бактериальные рибонуклеазы 57
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 68
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 88
3.1 Получение барназы и иммуыобарназных конъюгатов и 88
их анализ in vitro
Получение рекомбинантных белков в E.coli 88
Рибонуклеазная активность барназы и иммунобарназных 91 конъюгатов
3.2 Взаимодействие барназы с клетками 93
Связывание барназы с клетками 93
Интернализация барназы клетками 94
3.3 Взаимодействие иммунобарназных конъюгатов с 96
клетками
Иммуноцитохимический анализ уровня рецептора ERBB2 на 96 клетках
Связывание иммунобарназных конъюгатов с клетками 96 (флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия)
Взаимодействие scFv 405-дибарназы с клетками 99 (конфокальная микроскопия)
3.3.4 Интернализация scFv 4Б5-дибарназы КВВ2-позитивными 100 опухолевыми клетками (электронная микроскопия)
3.4 Детекция человеческих опухолевых клеток с помощью юз
ИММУНОРНКАЗ SCFV 4Б5-ДИБАРНАЗА, SCFV 4D5-BAPHA3A, SCFV 425-БАРНАЗА И БЕЛКА EGFP-БАРСТАР
Конструирование слитого белка EGFP-барстар и 103 определение его функциональной активности
Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия 106 барназы и барстара методом проточной цитометрии
Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия Ю7 барназы и барстара методом флуоресцентной микроскопии
Возможность изучения интернализации иммуноРНКазы 113 scFv 4Б5-дибарназа с помощью белка EGFP-барстар
3.5 ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА 115 ОПУХОЛЕВЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
Цитотоксическое действие барназы на человеческие 115 опухолевые клетки и нормальные мононуклеарные клетки периферической крови
Нацеливание барназы на опухолевые маркеры ERBB2 и 118 EGFR с помощью специфических антител
Сравнительный анализ влияния барназы и scFv 4D5- 119 дибарназы на жизнеспособность клеток
Доказательства специфичности действия scFv 4D5- 120 дибарназы на ЕКВВ2-гиперэкспрессирующие клетки
Зависимость цитотоксического действия scFv 4D5- 120 дибарназы от количества рецепторов ERBB2 на поверхности человеческих клеток
Конкурентное ингибирование токсического действия 121 scFv 4D5-du6apHa3bi мини-ашпителом scFv 4D5
Цитотоксичностъ scFv 405-дибарназы обусловлена 123 РНКазной активностью барназы
Зависимость токсического эффекта scFv 405-дибарназы на 124 ЕКВВ2-гиперэкспрессирующие клетки от времени воздействия
Цитотоксическое действие scFv 425-барназы на 128 человеческие опухолевые клетки
3.6 Механизмы токсического действия барназы и і 29
иммуноРНКазы scFv 4Б5-дибарназа на раковые клетки
Деградация РНК в клетках, обработанных барназой или scFvi29 4Б5-дибарназой
Морфологические изменения клеток под действием барназы 131 и scFv 4Б5-дибарназы
Цитометрический анализ повреждения ДНК в клетках, ]_32 обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой
Анализ геномной ДНК клеток, обработанных барназой или 135 scFv 4Б5-дибарназой
Пикнозис ядер в клетках, обработанных scFv 4D5- 137 дибарназой
Детекция фосфатидилсерина и активации каспазы-3 в 138 клетках, обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой
Схема взаимодействия барназы и иммунобарназных 139 конъюгатов с опухолевой клеткой
3.7 Создание генетической конструкции для і 41
эукариотическойтетрациклин-контролируемой
ЭКСПРЕССИИ иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-
БАРНАЗА
Субклонирование гена иммуноРНКазы scFv 4Б5-барназа в 143 плазмиду для эукариотической экспрессии
Влияние тетрациклина на интенсивность флуоресценции 145 клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими гены белков scFv 4Б5-барназа и EGFP
Оценка интенсивности флуоресценции белка EGFP в 147 трансфицированных клетках НЕК293 методом проточной цитометрии
Очистка белка scFv 4Б5-барназа из трансфицированных 148 клеток НЕК293 и культуральной среды
Жизнеспособность трансфицированных клеток НЕК293 150 определяли в тесте с трипановым синим
3.8 Определение системной токсичности белка scFv 4D5- 152
ДИБАРНАЗА НА МЫШАХ BDF1 И BALB/C NUDE
Биохимический анализ крови мышей BDF1 152
Определение содержания форменных элементов крови у 154 мышей
Гистологическое исследование действия иммуноРНКазы 154 scFv 4Б5-дибарназа на внутренние органы мышей
3.9 Определение противоопухолевой активности scFv 4D5-159
ДИБАРНАЗЫ В МЫШАХ BALB/C NUDE
Определение уровня экспрессии ERBB2 в перевиваемых 159 человеческих опухолях молочной железы
Противоопухолевый эффект scFv 4Б5-дибарназы в мышах 160 BALB/c nude, несущих человеческие опухоли молочной железы SKBR-3
ВЫВОДЫ 162
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
Введение к работе
Ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, являющихся причиной смерти 250 из 100000 человек [1]. Более чем у половины больных злокачественные опухоли удается обнаружить на поздних стадиях развития, когда общепринятые методы лечения оказываются уже неэффективными. Эти факты обусловливают актуальность разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения рака. Онкологические заболевания остаются острой проблемой современной медицины и биологии, и для их лечения в настоящее время применяются различные методы: хирургический, лучевой, химиотерапевтический, гормональный, иммунологический. В данной работе будут рассмотрены лишь некоторые подходы, касающиеся разработки средств для специфической терапии опухолей.
Идею о специфическом нацеливании терапевтических агентов на больные клетки впервые сформулировал Пауль Эрлих - основоположник химиотерапии, иммунолог, лауреат Нобелевской премии в области физиологии и медицины 1908 года. Эрлих объяснил возможность специфического нацеливания тем фактом, что некоторые красители обладают разным сродством к опухолевым и нормальным клеткам [2]. Однако метаболические пути опухолевых и нормальных клеток во многом совпадают, имея больше сходств, чем различий. Поэтому разработка средств, специфически удаляющих опухолевые клетки и не повреждающих нормальные клетки, остается актуальной проблемой современной медицины. Едва различимая разница между опухолевыми и нормальными клетками в использовании урацила для поддержания своего роста привела к открытию противоопухолевого средства флуороурацила [3]. Флуороурацил является антиметаболитом урацила, конкурирует с ним за тимидилатсинтетазу, блокирует синтез ДНК, вызывает образование структурно несовершенной РНК путем внедрения в ее синтез. Тимидилатсинтетаза экспрессируется больше в опухолевых, чем в нормальных клетках. Как результат, нормальные клетки, в целом, менее чувствительны к цитотоксическим эффектам флуороурацила [4, 5], чем опухолевые. Также было замечено, что опухолевые клетки, в отличие от нормальных клеток, находятся в большей зависимости от метаболизма глюкозы, а не от цикла лимонной кислоты, для образования аденозин трифосфата [6]. Сахар, манноза-6-фосфат, был присоединен к сильному растительному токсину рицину [7]. Таким образом, рицин специфически был доставлен к клеткам, несущим рецептор, связывающий манноза-6-фосфат, и селективно убивал эти клетки. Разработка и использование флуороурацила и конъюгата сахара с токсином - одни из ранних
примеров реализации идеи "магической пули". Термин "магическая пуля" был использован Эрлихом в 1908 году в "Нобелевской лекции" [8]. И сегодня, спустя 100 лет, не утихают споры, какой именно смысл ученый вкладывал в этот термин. В словах Эрлиха, «анти-токсины и анти-бактериальные субстанции являются, так сказать, магическими пулями, которые ударяют только по тем объектам, для разрушения которых они были продуцированы данным организмом» одни исследователи находят указание на иммунотоксины, в то время как другие настаивают, что термин "магическая пуля" обозначает только антитела [9]. Ключевыми событиями, повлиявшими на развитие специфической терапии, явились идентификация опухолеассоциированных антигенов, а также открытие способа получения моноклональных антител Жоржем Кёлером и Сезаром Милыптейном в 1975 году [10]. Эти события быстро привлекли внимание ученых, занимающихся разработкой противоопухолевых препаратов, к антителам для нацеливания токсинов на опухолевые клетки, и в 1980 году были одновременно опубликованы две работы о создании токсинов, связанных с антителами [11, 12]. Неологизм "иммунотоксин" появился несколькими годами позже [13]. Открытие вирусных онкогенов, кодирующих тирозинкиназы, и последующее обнаружение того, что мутации в некоторых нормальных генах тирозинкиназ могут трансформировать их в онкогены и вызывать клеточную трансформацию (иммортализацию, субстрат-независимый рост, способность формировать опухоли в иммунодефицитных мышах), предоставили основу для использования антител, направленных на человеческие рецепторы эпидермального фактора роста [14, 15]. Открытия и фармакологические исследования, которые привели к разработке антител, направленных на тирозинкиназные рецепторы EGFR и ERBB2, и к разрешению использовать в клинике Герцептин -гуманизированное моноклональное антитело, направленное на внеклеточный домен рецептора ERBB2, описаны в первом разделе обзора литературы данного исследования.
Герцептин - одно из наиболее успешных антител, использующихся в настоящее время в клинической практике. Результаты его клинического применения демонстрируют терапевтическую значимость нацеливания на тирозинкиназы для лечения рака. В то же время использование Герцептина в клиниках указало на ряд проблем, решение которых требует новых подходов к разработке противоопухолевых средств. В частности, чтобы избежать развития вторичной устойчивости опухолей к обработке моноклональными антителами, обладающими цитостатическим действием, необходимо нацеливать на опухоли токсины. Однако сильные бактериальные и растительные токсины и созданные
7 на их основе противоопухолевые средства при введении пациентам вызывают у них гепатотоксичность, а также синдром повышенной проницаемости капилляров. Описанию способов оптимизации антител для нацеливания на опухолевые клетки токсических агентов посвящен второй раздел обзора литературы.
Одним из возможных решений проблемы системной токсичности является использование в качестве токсина рибонуклеазы, которая не является мутагенной, не вызывает сильного побочного токсического действия и, проникнув в опухолевую клетку, расщепляет РНК, приводя к гибели клетки. Иммуноконъюгат, сконструированный на основе антитела и рибонуклеазы, получил название иммуноРНКаза. Стратегия использования РНКаз в качестве токсинов, а также созданные на сегодняшний день иммуноРНКазы, специфически направленные и селективно токсичные для различных видов опухолей, рассмотрены в третьем разделе обзора литературы.
Данная работа посвящена разработке и исследованию иммуноРНКаз, состоящих из мини-антител — одноцепочечных антиген-связывающих фрагментов антител (scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciem - барназы. В работе использованы мини-антитела к тирозинкиназному рецептору эпидермального фактора роста EGFR и его гомологу ERBB2. ИммуноРНКазы, направленные на опухолевые маркеры, представляют собой новое поколение противоопухолевых препаратов, разработка и использование которых, возможно, позволят решить проблемы острой системной токсичности противоопухолевых лекарств.
Цель настоящей работы состояла в изучении действия рибонуклеазы барназы и иммунобарназных конъюгатов — слитых белков, состоящих из барназы и мини-антител к рецепторам EGFR и ERBB2, на человеческие опухолевые клетки in vitro и in vivo, а также в разработке подхода для детекции опухолевых клеток, основанного на взаимодействии барназы с ее природным ингибитором — барстаром.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Оценить токсическое действие барназы и созданных на ее основе
иммунобарназных конъюгатов (scFv 425-барназа и scFv 4Э5-дибарназа)
на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров и
линии опухолевых клеток человека.
2. Определить механизмы цитотоксического действия барназы и
иммунобарназного конъюгата scFv 4В5-дибарназа на человеческие
опухолевые клетки.
Разработать подход для флуоресцентной детекции опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих EGFR и ERBB2, с использованием иммунобарназных конъюгатов, содержащих мини-антитела scFv 425 и scFv 4D5, и барстара, слитого с зеленым флуоресцентным белком EGFP.
Создать генетическую конструкцию для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа.
Исследовать противоопухолевую активность и системную токсичность иммунобарназного конъюгата scFv 405-дибарназа в мышах.
В настоящей работе впервые показано, что рибонуклеазная активность барназы не подавляется человеческим ингибитором рибонуклеаз, и барназа оказывает токсическое действие на человеческие опухолевые клетки, проникая в них, расщепляя клеточную РНК и индуцируя апоптоз. На основе барназы и мини-антител к опухолевым маркерам EGFR и ERBB2 были созданы иммуноРНКазы, которым мы дали название иммунобарназные конъюгаты. Иммунобарназные конъюгаты scFv 425-барназа и scFv 4Б5-дибарназа специфически связывались, соответственно, с рецепторами EGFR или ERBB2 на поверхности опухолевых клеток, интернализовались рецептор-опосредованным эндоцитозом и убивали клетки, вызывая в них апоптоз.
Создана конструкция для тетрациклин-контролируемой экспрессии в клетках млекопитающих гена, кодирующего слитый белок scFv 4D5-6apHa3a, состоящий из лидерного пептида, aHTH-ERBB2-MHHH-aHTHTena и барназы. Трансфицированные этой конструкцией человеческие клетки эмбрионального почечного эпителия НЕК293 продуцировали белок scFv 4D5-6apHa3a и секретировали его в культуральную среду. Показана возможность детекции in vitro опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецептор ERBB2, на основе взаимодействия барназы с ее природным ингибитором барстаром.
Показано также, что scFv 4В5-дибарназа ингибировала в мышах BALB/c nude рост привитых человеческих опухолей молочной железы, гиперэкспрессирующих ERBB2, и не оказывала серьезных побочных токсических эффектов на мышей BDF1 и BALB/c nude. Высокая эффективность рецептор-опосредованного действия на клетки человеческих карцином молочной железы, яичника, эпидермоидной карциномы in vitro и in vivo и отсутствие побочного токсического действия на мышей позволяет рассматривать иммунобарназные конъюгаты, в частности, scFv 4В5-дибарназу, как перспективные противоопухолевые средства для дальнейших доклинических исследований.
