Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Основные принципы структурной организации лейкоцитарных рецепторов . 15
1.1.1. Структура ИГ-домена 18
1.1.2. Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных молекул на клеточной мембране 20
1.1.3. Гликозилирование лейкоцитарных рецепторов 23
1.1.4. Сигнальные мотивы в цитоплазматических районах лейкоцитарных рецепторов 25
1.2. Fc-рецепторы млекопитающих . 28
1.2.1. Семейство лейкоцитарных FcR человека и мыши . 29
1.2.2. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека 35
1.2.3. Активация и инактивация клеток FcR-комплексами человека 37
1.3. Семейство лейкоцитарных FcR-подобных молекул – FCRL
(CD307) 41
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1. Материалы и реактивы 50
2.2. Биологический материал . 53
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 53
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК 53
2.3.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента – ЦТАБ 54
2.3.3. Удаление примесей бактериальной геномной ДНК из раствора плазмидной ДНК при помощи кислого фенола 54
2.4. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов. 55
2.4.1. Основные методы работы с рекомбинантной ДНК 55
2.4.2. Приготовление и трансформация химически компетентных клеток Е.coli 55
2.4.3. Приготовление и электропорация электрокомпетентных клеток Е. coli 56
2.5. Полимеразная цепная реакция и олигонуклеотиды 57
2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 60
2.7. Дот-гибридизация ДНК 60
2.7.1. Приготовление радиоактивно меченых зондов 60
2.7.2. Гибридизация мембран с радиоактивно мечеными зондами 61
2.8. Получение рекомбинантных конструкций 62
2.8.1. Создание рекомбинантных конструкций на основе pT7ZZ и pT7ABP векторов 62
2.8.2. Создание рекомбинантных конструкций на основе pET-21 вектора . 63
2.8.3. Создание рекомбинантных конструкций на основе pCI-neo вектора 65
2.8.4. Создание рекомбинантных конструкций на основе pAP-tag вектора . 66
2.9. Очистка рекомбинатных белков . 67
2.10. Иммунизация животных.. 69
2.10.1. Иммунизация кроликов 69
2.10.2. Иммунизация мышей ., 70
2.11. Иммуноферментный анализ 70
2.12. Иммуноблоттинг . 71
2.13. Получение моноклональных антител 72
2.14. Получение антипептидных антител 74
2.14.1. Получение конъюгата белок-пептид 74
2.14.2. Изготовление аффинного сорбента для очистки антител против FCRL1 74
2.14.3. Выделение антипептидных антител из антисыворотки кролика . 75
2.15. Транзитная трансфекция эукариотических клеток 75
2.16. Иммуноцитохимический анализ мазков клеток 76
2.17. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензий клеток 77
2.18. Иммуногистохимический анализ 77
2.19. Ферментативное дегликозилирование 78
2.20. Количественное измерение фосфатазной активности AP-содержащих белков 79
2.21. Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и е нормализация 79
2.22. Иммуноферментное окрашивание криосрезов миндалины человека и трансфицированных клеток при помощи AP-содержащих белков . 81
2.23. Метод скрининга антител к эпитопам нативных белков . 82
2.24. Компьютерный анализ последовательностей 83
Глава 3. Результаты и обсуждение . 84
3.1. Анализ экспрессии рецепторов человека - FCRL1, FCRL4 и FCRL6 84
3.1.1. FCRL1 84
3.1.1.1. Экспрессия FCRL1 в тканях человека . 84
3.1.1.2. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL1 . 92
3.1.1.3. Анализ экспрессии белка FCRL1 в клетках и тканях человека 99
3.1.2. FCRL4 105
3.1.2.1. Экспрессия FCRL4 в тканях человека 105
3.1.2.2. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL4 108
3.1.2.3. Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканяx человека 112
3.1.3. FCRL6 114
3.1.3.1. Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL6 114
3.1.3.2. Анализ экспрессии белка FCRL6 в клетках и тканях человека 118
3.2. Поиск лигандов к FCRL1 и FCRL4 122
3.2.1. Получение молекулярных зондов на основе FCRL и плацентарной щелочной фосфатазы 124
3.2.2. Выявление связывающих FCRL1 и FCRL4 клеток в миндалине человека и экспрессионное клонирование потенциального лиганда FCRL4 127
3.3. Разработка метода скрининга антител к эпитопам нативных белков 133
Заключение 144
Выводы 147
Список литературы 149
- Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных молекул на клеточной мембране
- Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента – ЦТАБ
- Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и е нормализация
- Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканяx человека
Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных молекул на клеточной мембране
Описано шесть основных способов закрепления белков на клеточной поверхности (рис. 3, Nelson and Cox, 2012). Белки I- и II-типа содержат по одному трансмембранному району, тогда как III-типа содержат несколько трансмембранных районов. Прикрепление к мембране IV-типа формируется несколькими белками, каждый из которых имеет по одному ТМ-району. Белки V-типа лишены ТМ-районов и для закрепления на мембране используют липидные якоря. Для белков VI-типа характерно закрепление посредством ТМ-района и с помощью липидного якоря. Сами участки, соответсвующие трансмембранным районам рецепторов, можно предсказать исходя из анализа гидрофобности аминокислотной последовательности (von Heijne, 1992; Jones et al., 1994). Один из самых часто встречающихся способов интеграции лейкоцитарных поверхностных белков в мембрану является способ крепления I-типа (Barclay, 2003). При этом типе крепления C-конец белковых молекул находится в цитоплазме, а N-конец располагается снаружи клетки. Первично белковые молекулы
Способы прикрепления белков к липидному бислою клеточной мембраны. Трансмембранные рецепторы I- и П-типа пронизывают мембрану один раз и различаются только положением NH2- и СООН-концов. Трансмембранные рецепторы Ш-типа пронизывают клеточную мембрану несколько раз. Прикрепление к мембране IV-типа образуется несколькими белками, при этом формируется трансмембранный канал. Белки V-типа прикрепляются к липидам через GPI-якорь. Прикрепление VI-типа формируется посредством ТМ-петель и с помощью липидов. (Nelson and Сох, 2012). содержат в N-концевом участке сигнальную последовательность (10-20 аминокислотных остатка), которая отрезается при их транспорте через бислой эндоплазматического ретикулума (Rapoport et al, 1996; Bendtsen et al, 2004). Размер трансмембранного района поверхностных молекул I типа приблизительно состоит из 25 аминокислотных остатков. Как правило, заряженные аминокислотные остатки Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys и Arg не встречаются в трансмембранных районах. Исключением являются случаи, когда белковые молекулы могут образовывать мультимерные мембранные рецепторные комплексы. Типичным примером подобных комплексов являются Т-клеточный рецепторный комплекс. У Т-клеточного рецепторного комплекса трансмембранные районы а-и р-цепи TCR содержат положительно заряженные аминокислотные остатки, тогда как в CD3 у, 5, є и С субъединицах они отрицательно заряжены (Call and Wucherpfennig, 2005). Наличие положительно заряженных остатков в трансмембранных районах лиганд-связывающей субъединицы и отрицательно заряженных аминокислотных остатков в сигнальных субъединицах является характерным для подобных мультимерных комплексов (Lanier, 2008). Для белков II-типа характерно обратная ориентация по отношению к молекулам І-типа. У них N-концевая часть находится в цитоплазме, а С-концевая - снаружи клетки. Характерной особенностью этих белков заключается в наличии коротких цитоплазматических районов и, как правило, трансмембранные участки представляют собой неотрезанные сигнальные последовательности (Scanlan et al, 1994). К белкам Ш-типа относятся молекулы, которые пронизывают мембрану от 2 до 12 раз. Отличительной особенностью белков IV-типа является наличие трансмембранного канала, заполненного водой. Среди белков V-типа выделяют два класса. Для одного класса характерна ассоциация с липидным бислоем через остаток миристиловой кислоты на N-конце, а для другого - связь через гликозил-фосфадитилинозитольный (GPI) якорь (Ferguson and Williams, 1988; Low and Saltiel, 1988). У последних С концевой аминокислотный остаток посредством фосфоэтаноламинного мостика прикрепляется к гликану ((манноза)3-глюкозамин), который, в свою очередь, связывается с фосфадитилинозитолом. Определить GPI-якорь возможно предсказать путем компьютерного анализа белковой последовательности молекулы. GPI-связанные молекулы содержат на N-конце сигнальную последовательность, определяющую секрецию, и на С-конце последовательность, которая отрезается в эндоплазматическом ретикулуме и меняется на GPI-якорь (Udenfriend and Kodukula, 1995; Yan et al., 1998). Отрезанный пептид структурно не отличим от трансмембранного района. В месте гидролиза обычно располагается несколько остатков с малыми радикалами (Gly, Ala, Ser).
Характерная особенность поверхности клеточной мембраны является наличие углеводных структур на липидах и белках (Spiro, 2002). Для большинства лейкоцитарных поверхностных молекул характерно наличие углеводных структур в их внеклеточной части (рис. 1). В результате посттрансляционной модификации белковых молекул происходит гликозилирование по соответствующим сайтам (рис. 4). N гликозилирование проходит по остаткам Asn в мотивах Asn-Xhr или Asn-X-Ser, X- любая аминокислота. Последовательности Asn-Prohr/Ser и Asn-Xhr/Ser-Pro являются исключением и обычно не гликозилируются. О-гликозилирование происходит по остаткам Ser и Thr в последовательностях, богатых Ser, Thr и Pro. Степень гликозилирования мембранных белков варьирует, и одна и та же молекула может нести различные олигосахаридные структуры в зависимости от фенотипических свойств клетки, в которых она экспрессируется (Kleinberg et al., 1989). Отличия в гликозилировании поверхностных молекул могут приводить к изменениям N- и О-гликозилирование белков. При N-гликозилировании углеводный комплекс (изображен только N-ацетилглюкозамин) присоединяется за счет взаимодействия с амидной группой остатка аспарагина (а). В результате О-гликозилирования углеводы присоединяются через гидроксильную группу остатков серина или треонина (б). (Berg, 2006) функциональных свойств молекул как за счет маскировки белковой поверхности и скрытия сайтов связывания лиганда углеводными структурами, так и за счет взаимодействия гликопротеинов с другими молекулами через свои углеводные группы, например с лектинами, селектинами или сиалоадгезинами (Gornik et al, 2012). Иногда встречаются мембранные белки (CD3s, CD81, CD20), которые не несут углеводов (Tedder and Schlossman, 1988; Klausner et al, 1990; Levy et al, 1998). Очень часто такие белки ассоциируются с гликопротеинами.
Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента – ЦТАБ
Очистку плазмидной ДНК от бактериальных липополисахаридов, белков и РНК проводили по методу Ландера (Lander et al., 2002). К раствору плазмидной ДНК (1 мг/мл), выделенной методом щелочного лизиса, добавляли 1:10 объема 5% водного раствора ЦТАБ, предварительно выдержанного при 37С в течение 30 минут. Перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре и далее центрифугировали 10 минут при 14000g. Супернатант удаляли, а осадок растворяли в 500 мкл воды. Доводили концентрацию NaCl в растворе до 0.65 М, тщательно перемешивали и центрифугировали при 14000g, 10 минут при комнатной температуре. Супернатант отбирали в отдельную пробирку, добавляли к нему равный объем изопропанола и центрифугировали при 14000g в течение 10 минут при комнатной температуре. Осадок промывали дважды 80% этанолом, затем сушили его при 65 C в течение 10 минут. Растворяли плазмидную ДНК в ультрачистой воде.
Удаление примесей бактериальной геномной ДНК из раствора плазмидной ДНК проводили по методу Ву и Кэннона (Wu and Cannon, 1985). В раствор плазмидной ДНК добавляли ацетат натрия pH 3.8 до концентрации 50 мМ и NaCl до 75 мМ. Раствор перемешивали с 1 объемом кислого фенола (насыщенного 50 мМ ацетат натрия pH 3.8 при 4С) и центрифугировали при 4С, 14000g в течение 5 минут. Водную фазу отбирали в отдельную пробирку и указанную процедуру проводили ещ два раза. Затем водную фазу нейтрализовали Трис-HCl, pH 8.0 до концентрации 75 мМ и плазмидную ДНК осаждали этанолом. Растворяли плазмидную ДНК в воде.
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот, элюция ДНК-фрагмента из агарозы, очистка ДНК фенолом и хлороформом, лигирование ДНК-фрагмента с вектором, получение тупых концов у ДНК-фрагмента проводили, как описано в книгах (Маниатис и др., 1984; Гловер, 1988).
Приготовление компетентных клеток Е. coli и химическую трансформацию проводили, как описано в книге Мазина (Мазин и др., 1988). Для приготовления химически компетентных клеток использовали штаммы Е. coli JM109 и BL21(DE3). В 500 мл колбу со 100 мл 2xL среды (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5 г/л NaCl, 2 мл 1 M NaOH, pH 7.0) вносили 0.5 мл ночной культуры соответствующего штамма Е. coli, выращивали клетки при 30С, интенсивно перемешивая, до D60o=0.6-0.8. Клеточную суспензию оставляли на льду на 1 час. Клетки осаждали центрифугированием при 1500g 10 минут при 4С. Осадок суспендировали в 50 мл предварительно охлажденного до 0-4С буфера I (100 мМ СаCl2, 70 мМ МnCl, 40 мМ ацетат натрия, pH 5.5) и оставляли на льду на 30 минут. Клетки осаждали при 1500g, 4С в течение 10 минут. Удаляли супернатант и суспендировали клетки в 5 мл охлажденного буфера I, содержащего 15% глицерин. Расфасовывали клетки по 100 мкл и замораживали при -70С.
Для трансформации компетентные клетки Е. coli оттаивали на льду (коэффициент трансформации составлял 106-107 для вектора pBlueScript II KS). К клеточной суспензии добавляли 40 мкл воды с 10 мкл лигазной смеси (концентрация ДНК 1 мкг/мл) и инкубировали на льду 30 минут. Затем клетки инкубировали 5 минут при 37оС. К клеточной суспензии добавляли 1 мл среды LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, NaOH до pH 7.5) и инкубировали в течение 1 часа при 37С без перемешивания. Клетки осаждали центрифугированием и высевали на селективную среду (1.5% агар, среда LB) с антибиотиком, затем осуществляли селекцию клонов, несущих рекомбинантную плазмиду. Концентрации использованных антибиотиков и реагентов в жидких и твердых средах были следующими: ампициллин - 25 мкг/мл, тетрациклин -12.5 мкг/мл, канамицин - 50 мкг/мл, хлорамфеникол - 30 мкг/мл, X-gal - 50 мкг/мл, ИПТГ - 125 мкг/мл.
Подготовку электрокомпетентных клеток проводили по методу Тюнга и Чоу (Tung and Chow, 1995). Клетки E. coli штамма XL-1 Blue MRF выращивали в двух 500 мл колбах по 100 мл среды LB при комнатной температуре и интенсивном перемешивании до оптической плотности OD600=0.45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000g, 4оС в течение 20 минут. На льду клетки промывали суспендированием в объеме 200 мл, 100 мл и 50 мл ледяной дистиллированной автоклавированной воды (0-4оС) с последующим центрифугированием. Затем клетки промывали 10 мл раствора GYT (10% глицерин, 0.125% дрожжевой экстракт, 0.25% бактотриптон), центрифугировали и ресуспендировали в 500 мкл ледяного раствора GYT, расфасовывали по 40 мкл и замораживали при -70оС.
Для трансформации компетентные клетки E. coli оттаивали на льду (коэффициент трансформации составлял 108-1010 для вектора pBlueScript II KS). К 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1-2 мкл ДНК (концентрация ДНК 1 мкг/мл), суспензию вносили в кювету для электропорации при 0-4оС и через кювету пропускали электрический разряд (U=1700 В, t=5 мс). Добавляли 1 мл SOC (2% бактотриптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза), прогретого до 42оС, перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, также прогретой до 42оС, инкубировали при 37оС в течение 1 часа и высевали на селективную среду.
Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и е нормализация
Измерение фосфатазной активности химерных белков проводили по методу Фланагана и Ченга (Flanagan and Cheng, 2000). Эндогенную фосфатазную активность удаляли прогреванием кондиционированной среды при 65С в течение 15 минут. В каждую лунку планшета добавляли по 100 мкл буфера ИВАН (раствор Хенкса, БСА (0.5 мг/мл), 0.1% NaN3, 20 мМ Hepes, рН 7.0) и титровали образцы двукратными разведениями. Добавляли в каждую лунку по 100 мкл 2х субстратного раствора (2 М диэтаноламин рН 9.8, 1 мМ MgCl2, 7.3 мМ паранитрофенил фосфат). Инкубировали 1 час при комнатной температуре без доступа света и измеряли оптическую плотность в лунках при =405 нм, на автоматическом спектрофотометре EIA Reader 2550 (Bio-Rad).
Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и е нормализация. После плановой тонзилэктомии послеоперационный материал был помещен в раствор RNA-later (Invitrogen, США). Суммарную РНК из миндалины человека выделяли по страндартному протоколу с использованием TRIzol реагента (Invitrogen, США) и далее поли (А)-РНК очищали на колонке с Oligo (dT)-целлюлозой согласно Маниатис и др., 1984. 10 мкг поли (А)-РНК использовали для получения двухцепочечной кДНК при помощи коммерческого набора SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, США). Полученную ДНК фракционировали на колонке с сефакрилом S-500 для удаления ДНК-фрагментов длиной менее 500 пар нуклеотидов. Очищенные ДНК-фрагменты далее лигировали с линкерами BstX I/EcoR I (Invitrogen, США) и клонировали в pcDNA I/Amp вектор по сайтам BstX I и EcoR I. Лигазной смесью трансформировали Е. coli XL-1 Blue MRF, после чего клетки высевали на 20 больших чашек Петри (1.5% агар, среда LB) с ампициллином. Выросшие колонии смывали с чашки, высевали вместе с хелпер-фагом в 100 мл колбу с LB, подращивали при 30С до оптической плотности OD600=0.6 и выделяли одноцепочечную кольцевую кДНК-библиотеку (« + цепь»).
Нормализацию кДНК библиотеки проводили с помощью субтрактивной гибридизации по методу Сива и Джона (Sive and St John, 1988). Пробирку, содержащую раствор с 30 мкг первой цепи кДНК (« -цепь») миндалины человека обрабатывали РНКазой A. Далее образец инкубировали при 94C в течение 5 минут, после чего в течение 30 минут при 37C. Затем в пробирку добавляли протеиназу К (200 мкг/мл) и инкубировали при 50C в течение 30 минут. кДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ и осаждали этанолом. Затем проводили мечение кДНК биотином с использованием коммерческого набора Label IT Biotin Nucleic Acid Labeling Kit (Mirus, США). 3 мкг одноцепочечной кДНК-библиотеки гибридизовали с 30 мкг кДНК-библиотекой первой цепи, меченой биотином. В реакционную смесь добавляли стрептавидин и субтрактивную одноцепочечную ДНК отделяли от стрептавидин-биотин-ДНК экстракцией с помощью фенол-хлороформа. Очищенную ДНК амплифицировали методом ПЦР и лигировали с pcDNA I/Amp вектором по сайтам BstX I и EcoR I. Лигазную смесь трансформировали в электрокомпетентные клетки Е. coli XL-1 Blue MRF и высевали на 20 больших чашках (1.5% агар, среда LB) с ампициллином. Колонии трансформированных клеток, выросшие на каждой чашке, объединяли в пулы (1 пул приблизительно содержал 2000 клонов), выделяли из них плазмидную ДНК и далее использовали е для трансфекции 293Т-клеток. 2.22. Иммуноферментное окрашивание криосрезов миндалины человека и трансфицированных клеток с помощью AP-содержащих белков
Изготовление криосрезов миндалины человека проводили на криостате HM505N (Microm) согласно инструкциям производителя. Иммуноферментное окрашивание проводили по методу Фланагана (Flanagan and Cheng, 2000). Криосрезы фиксировали ацетоном в течение 10 минут и сушили в течение 10 минут. Промывали срезы в холодном HBS (10 мМ Hepes pH 7.0, 150 мМ NaCl) - две смены по 5 минут. Затем промывали в холодном HBAH (см. п. 2.20) - две смены по 5 минут. Наносили на срез 0.5 мл кондиционированной среды из-под трансфицированных клеток, содержащей FCRL1-AP (или FCRL4-AP) с концентрацией 2-10 нМ, помещали во влажную камеру и инкубировали при 4С в течение 18 часов. В качестве контроля на срез наносили кондиционированную среду из-под трансфицированных клеток, содержащую AP. Промывали срезы в холодном HBAH – шесть смен по 5 минут. Добавляли ацетон-формалин-фиксирующий раствор (65% ацетон, 8% формалин в 20 мМ Hepes, pH 7.0) и фиксировали срезы в течение 15 секунд. Удалив фиксирующий раствор, срезы дважды промывали холодным раствором HBS, помещали на водяную баню (HBS, 65С) и инактивировали эндогенную фосфатазную активность в течение 15 минут. Затем клетки промывали буфером AP (100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ Трис-HCl, pH 9.5), наносили субстратный раствор, содержащий 0.33 мг/мл NBT, 0.17 мг/мл BCIP в буфере AP. Инкубировали в течение 1-4 часов при комнатной температуре без доступа света. Удаляли субстратный раствор, промывали срезы 10 мМ ЭДТА в PBS и заключали в бальзам.
Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканяx человека
Анализ экспрессии FCRL4 в мононуклеарах периферической крови и клетках миндалины человека проводили с помощью проточной цитометрии (рис. 29). Для окрашивания использовали полученные нами меченые биотином МКА R311 и коммерческие антитела против маркеров В- и Т лимфоцитов человека, CD19 и CD3, соответственно. Обнаружили, что в миндалине человека FCRL4 экспрессируется на поверхности В-лимфоцитов и не экспрессируется Т-лимфоцитами (рис. 29а). В миндалине FCRL4 маркирует небольшую субпопуляцию В-клеток и характеризуется низким уровнем экспрессии: доля FCRL4+ клеток составляла от 0.9% до 2% от всех клеток или от 2 до 6% от CD19+ В-лимфоцитов миндалины (рис. 29a). При окраске мононуклеаров, выделенных из 10 индивидуальных образцов периферической крови человека, количество FCRL4+ клеток варьировало от 0% до 0.05% от всех лейкоцитов, что свидетельствовало, скорее, об отсутствии экспрессии. Этот результат был ожидаемым (рис. 29б). Отсутствие сигнала на FCRL4 в клетках периферической крови было нами ранее показано с помощью ОТ-ПЦР и дот-блот гибридизации FCRL4-зонда на коммерческих мембранах Multiple Tissue Expression Array, Autoimmune Disease Profiling Array и Blood Disease Profiling Array. Иммуногистохимическое исследование белка FCRL4 на парафиновых срезах миндалины человека проводили с использованием FCRL4-специфичных КАС5 и КАС6. Обнаружили, что в миндалине FCRL4+ клетки локализуются преимущественно в экстрафолликулярных областях и лимфоэпителии (рис. 30а). Эрхардт и др. считают, что FCRL4+ В-клетки из этих областей могут представлять собой неклассические В-клетки памяти (Ehrhardt et al., 2003; Ehrhardt et al., 2005). При окрашивании с помощью МКА замороженных срезов, в дополнение к имеющимся данным, наблюдали единичные FCRL4+ клетки в лимфоидных фолликулах (рис. 30б). Схожий иммуногистохимический профиль был показан другими исследователями с помощью in situ локализации FCRL4-транскриптов, а затем и на белковом уровне с использованием FCRL4-специфичных МКА (Hatzivassiliou et al., 2001; Falini et al., 2003; Polson et al., 2006). Полученные данные свидетельствуют, что:
а) у человека FCRL4 экспрессируется на поверхности исключительно В лимфоцитов вторичных лимфоидных органов, где занимают в основном экстрафолликулярные области
б) его экспрессия в клетке низкая, а размер субпопуляции FCRL4+ В-клеток небольшой,
в) FCRL4+ В-клетки не выходят в кровь для циркуляции и представляют собой субпопуляцию нециркулирующих, оседлых В-клеток.
Получение поликлональных и моноклональных антител к FCRL6.
Для получения АТ к FCRL6 мы использовали векторы, обеспечивающие экспрессию FCRL6 в прокариотической и бакуловирусной системах. Химерный белок exFCRL6-6xHis, экспрессируемый в E. сoli, содержал в своем составе внеклеточную часть FCRL6 (домены D2-D3-D5), соединенную на COOH-конце с последовательностью из 6 остатков гистидина (предоставлена А.М. Наякшиным). Белок exFCRL6-6xHis был наработан в E. сoli, очищен (получено совместно с Н.А. Чикаевым) и был использован для получения кроличьих ПКА к FCRL6. После цикла из 6 иммунизаций антитела были выделены и иммобилизированы на CL-4B сефарозе. Полученный сорбент в дальнейшем использовали для выделения FCRL6, наработанного в бакуловирусной системе. Для получения бакуловирусного продуцента была создана рекомбинантная конструкция FCRL6 в транспортном векторе pBAC-1 (предоставлена А.М. Наякшиным). Этой конструкцией совместно с BacVector-3000 Triple Cut Virus DNA трансфицировали клетки насекомых Sf9 для получения рекомбинантного вируса. FCRL6+ вирусные клоны отбирали по LacZ селекции и проводили препаративную наработку вируса с измерением титра. Полученный вирус концентрировали и использовали для заражения Sf9-клеток с целью препаративной наработки белка exFCRL6. Для очистки белка использовали FCRL6-специфичные ПКА, иммобилизированные на сефарозе CL-4B. Очищенным exFCRL6 белком проводили четырехкратную иммунизацию мышей линии BALB/c, и далее спленоциты сливали с клетками миеломы X63-Ag8-653. В результате гибридизации было получено три гибридных клона, продуцирующих антитела против FCRL6. Антитела, продуцируемые этими клонами, специфично взаимодействовали с белком exFCRL6-6xHis в ИФА. Антитела клона 7B2 были очищены из асцитной жидкости и конъюгированы с биотином. Проверку специфичности МКА 7B2 проводили на трансфицированных клетках с помощью методов иммуноцитохимического окрашивания, проточной цитометрии и иммуноблоттинга (рис. 31а--г). Для получения трансфектантов полноразмерная кДНК FCRL6 была клонирована в эукариотический экспрессирующий вектор рCI-neo. Иммуноблот-анализ трансфицированных 293T клеток показал наличие двух полос, соответствующих 57 и 63 кДа
Анализ специфичности полученных МКА 7B2 и их способности выявлять FCRL6 в различных методах. а) МКА 7B2 выявляют белок FCRL6 в иммуноблоттинге трансфицированных 293T-клеток, мононуклеаров периферической крови и спленоцитов человека. б) Иммунопероксидазное окрашивание фиксированных FCRL6-трансфицированных 293Т-клеток с использованием МКА 7B2. в) Иммунофлуоресцентное окрашивание живых трансфицированных 293Т-клеток c использованием МКА 7B2. Поверхностная флуоресценция (зелное свечение) клеток свидетельствует об экспрессии FCRL4 на мембране клеток. г) Цитометрический анализ FCRL6-трансфицированных 293Т-клеток с использованием МКА 7B2. Уровень трансфекции составил 23% (FCRL6). 118 (рис. 31а). Вместе с этим, на спленоцитах и мононуклеарах периферической крови наблюдали одну полосу, соответствующую 63 кДа. Наличие в трансфицированных клетках дополнительной полосы в 57 кДа можно объяснить неполным гликозилированием FCRL6 в этих клетках (расчтная молекулярная масса белка FCRL6 состовляет 43,5 кДа). Иммуноцитохимическое окрашивание живых и фиксированных трансфицированных 293T-клеток показало, что МКА 7В2 способны выявлять FCRL6 как на поверхности, так и внутри клеток (рис. 31б--в). Кроме того, МКА 7B2 эффективно работали в проточной цитометрии (рис. 31г).
