Введение к работе
Актуальность проблемы. Нейтрофилы являются основными эффекторными клетками неспецифического иммунитета и представляют первую линию защиты организма от патогенных микроорганизмов. Эти клетки узнают и убивают микроорганизмы посредством их фагоцитоза и последующей секреции активных форм кислорода и цитотоксических компонентов гранул в фагосомы (Nauseef, 2007). Помимо элиминирования патогенных микроорганизмов, нейтрофилы, аккумулирующиеся в воспаленной ткани, секретируют хемоаттрактанты, привлекающие другие типы лейкоцитов в очаг воспаления. К настоящему времени показано, что аккумуляция нейтрофилов в очагах проникновения инфекции и поврежденных тканях сопровождается индукцией экспрессии генов многочисленных хемокинов (Scapini et al., 2000). Кроме того, помимо классических хемокинов, активированные нейтрофилы секретируют другие белки, способные оказывать хемотактический эффект на отдельные типы лейкоцитов (Плиев, 2008). Эти белки являются компонентами гранул нейтрофилов и быстро секретируются при дегрануляции активированных клеток.
Урокиназный рецептор (uPAR) - мультилигандный рецептор, играющий важную роль в околоклеточном протеолизе мигрирующих клеток, клеточной адгезии и хемотаксисе (Ragno, 2006). В структуре uPAR выделяют три гомологичных домена: Dl, D2 и D3. Линкерный участок, связывающий домены D1 и D2, может расщепляться многими сериновыми протеазами, что приводит к образованию D2D3 формы рецептора (Montuori et al, 2005). Мембраносвязанный uPAR может отщепляться GPI-специфичной фосфолипазой D с образованием растворимой формы рецептора - suPAR. Как и мембраносвязанный рецептор на плазматической мембране, suPAR в биологических жидкостях присутствует как в полноразмерной, так и в D2D3 формах. Расщепление линкерного участка между доменами D1 и D2 может происходить в разных сайтах. D2D3 форма suPAR с экспонированным фрагментом SRSRY (остатки 88-92) линкерного участка является хемоаттрактантом для базофилов, моноцитов и CD34+ гематопоэтических стволовых клеток (HSCs). Хемотактический эффект этой формы suPAR опосредован формилпептидными рецепторами FPRL1 и FPRL2 на базофилах, FPRL1 - на моноцитах и FPR - на HSCs.
Нейтрофилы человека содержат значительный внутриклеточный пул uPAR, локализованный в первичных и третичных гранулах и секреторных везикулах (Plesner et al., 1994; Pedersen et al., 2000). Активация нейтрофилов приводит к быстрой транслокации uPAR из внутриклеточных компартментов на плазматическую мембрану (Plesner et al., 1994). Поскольку активированные нейтрофилы секретируют также сериновые протеазы (нейтрофильную эластазу и урокиназу), способные расщеплять линкерный участок между доменами Din
D2, мы предположили, что если активация нейтрофилов приводит к секреции suPAR (шеддингу uPAR), образующаяся форма, возможно, является хемотактически активной D2D3 формой рецептора. Таким образом, целью настоящей работы было выяснить возможность секреции растворимой формы урокиназного рецептора (suPAR) нейтрофилами человека в их различных функциональных состояниях и исследовать ее возможное участие в воспалительных процессах. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:
Показать возможность секреции suPAR при активации нейтрофилов;
Охарактеризовать доменную структуру и возможные хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR;
Исследовать механизм образования suPAR при активации нейтрофилов;
Оценить секрецию suPAR активированными in vivo нейтрофилами очагов
острого воспаления. Научная новизна и практическая значимость работы. В представленной работе впервые показана возможность секреции хемотактически активной D2D3 формы растворимого урокиназного рецептора клетками на примере активированных нейтрофилов человека. Хемотактически активная D2D3 форма растворимого урокиназного рецептора идентифицирована как новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами человека. Обнаружен новый механизм образования хемотактически активных белков при активации нейтрофилов (шеддинг и протеолитический процессинг мембранного белка). Обнаружен новый механизм образования растворимого урокиназного рецептора - катализируемый катепсином G шеддинг мембранного урокиназного рецептора. Результаты работы существенно дополняют современные представления о роли нейтрофилов в привлечении других типов лейкоцитов в формирующийся очаг воспаления.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Факультета Фундаментальной Медицины МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2008), на научных конференциях Xlth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation (Saltsobaden, 2007) и Gene Expression and Signaling in the Immune System (Cold Spring Harbor, 2008).
Публикации. Результаты работы представлены в 2 статьях и в 2 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Работа содержит 125 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 24 рисунка. Список литературы включает 281 источник.
