Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак почки (РП) - широко распространенное в мире заболевание, основным гистологическим типом которого является светлоклеточная почечноклеточная карцинома (светлоклеточный рак почки, СРП). В мире ежегодно выявляется в среднем 190000 новых случаев рака почки, причем почти у трети больных опухоль служит причиной смерти. Это позволяет считать рак почки одной из основных проблем онкоурологии. До 4% случаев заболевания имеют наследственный характер и связаны с терминальными мутациями в соответствующих генах. В большинстве случаев заболевание на ранней стадии, когда условия для его лечения наиболее благоприятны, выявляют случайно при плановом обследовании. Это обусловливает необходимость разработки новых более надежных, быстрых и доступных для пациентов методов ранней диагностики СРП, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов.
Известно, что на ранних этапах развития рака эпителиального происхождения (карцином), в том числе СРП, часто происходят различные геномные и эпигеномные нарушения, особенно на коротком плече хромосомы 3 (Зр) (Zabarovsky et al, 2002; Angeloni D., 2007). В этой области располагаются кластеры генов-супрессоров опухолевого роста и генов-кандидатов (Klein et al., 2007), для которых синтез мРНК и/или белка в опухолях может быть нарушен. Для выяснения роли тех или иных генов в канцерогенезе проводят исследование их структурных и функциональных изменений в опухолях, в том числе оценивают экспрессию на уровне мРНК и белка по сравнению с нормальными тканями. При различных типах рака профили экспрессии одних и тех же генов, могут существенно отличаться. Это свидетельствует о множественности механизмов канцерогенеза и о важности этих генов в процессах малигнизации.
К настоящему времени для СРП не найдено специфичных диагностических маркеров. Все используемые в клинике маркеры, например, М2-РК (изомерная форма пируваткиназы, единственный, внедренный в российскую клиническую практику, маркер), пригодны только в качестве дополнительных и не могут применяться для однозначного установления диагноза. Одним из дополнительных маркеров СРП является повышение уровня сывороточного ферритина. Однако вклад в это изменение каждого их двух генов, FTL и FTH, кодирующих субъединицы белка, до сих пор недостаточно изучен.
Благодаря современному методу кДНК-микропанелей, стало возможным выявление изменений экспрессии сотен и тысяч генов одновременно, которое требует дополнительного уточнения. Для этих целей широко используют ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Количественная оценка изменений экспрессии генов помогает сделать вывод о степени их вовлеченности в процесс развития опухолей почки, вносит важный вклад в понимание молекулярных основ канцерогенеза, а также позволяет выбрать
3 \ э
гены, которые могут быть перспективными в качестве маркеров ранней диагностики и прогрессии СРП.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы - количественная оценка содержания мРНК генов, расположенных на коротком плече хромосомы 3, которые могут проявлять себя как гены-супрессоры в эпителиальных опухолях - VHL, RBSP3, SEMA3B, SEMA3F, HYAL1, HYAL2, NPRL2, генов кандидатов - ITGA9, СНЫ, гена RB1, продукт которого является основной мишенью RBSP3, а также кодирующих субъединицы ферритина генов FTL и FTH при светлоклеточном раке почки.
В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:
-
Отработка методики количественных измерений содержания мРНК генов в образцах СРП и культур клеток почки, позволяющая оптимизировать условия, подобрать подходящие образцы сравнения и контрольные гены для получения воспроизводимых данных.
-
Оценка содержания мРНК выбранных генов.
-
Математическая обработка данных и сопоставление полученных результатов с клиническими характеристиками опухолей.
-
Поиск и обсуждение возможных причин, приводящих к изменению экспрессии исследуемых генов в опухолях почки.
-
Выбор генов, наиболее перспективных для дальнейшего применения в диагностике и генотерапии СРП.
Научная новизна и практическая ценность работы. Методом ПЦР-РВ впервые проведена количественная оценка экспрессии мРНК 13-ти генов, выполняющих в организме различные функции. Выявлено частое снижение содержания мРНК гена FTL, кодирующего легкую цепь ферритина, в то время как изменения гена тяжелой цепи - FTH - не значительные. Показано отсутствие заметных изменений экспрессии двух изоформ классического супрессора при раке почки - гена VHL, в то время как экспрессия белка существенно подавлена. Заметное и частое снижение содержания мРНК наблюдали у генов RBSP3, HYAL1, SEMA3B, СНЫ, дерегуляцияю экспрессии (как случаи повышения, так и понижения) - у генов NPRL2, HYAL2, ITGA9 и SEMA3F. Результаты для 4-х генов со значительным снижением могут быть использованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики СРП и новых подходов в генотерапии этого заболевания.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), «Петровские чтения - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), на IX международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Киев, Украина, 2008), «IV конгресс молекулярных генетиков (Ростов-на-Дону, 2010). По материалам диссертации опубликованы две статьи, глава в книге и выдан один патент на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения,
выводов и списка цитированной литературы (136 наименований). Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 19 рисунков.
