Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста 9
1.1.1. Ген NETO2 - потенциальный онкоген СРП 14
1.1.2. Ген NR0B2 - потенциальный супрессор СРП 16
1.2. Энергетический обмен в опухолевых клетках 18
1.2.1. Гликолиз 20
1.3. Метаболизм ретинола и его нарушение при раке 24
1.3.1. Ретинол 25
1.3.2. Метаболизм ретинола в клетке 26
1.3.3. Механизм действия рецепторов ретиноидов 29
1.3.4. Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза ретиноевой кислоты 32
1.3.5. Биологическая роль продуктов метаболизма ретинола 33
1.4. Способы эпигенетической регуляции экспрессии генов 34
1.4.1. МикроРНК 34
1.4.2. Метилирование 42
1.4.3. Модификации гистонов 44
1.5. Методы оценки уровня мРНК генов 45
Глава 2. Материалы и методы исследований 52
2.1. Материалы 52
2.1.1. Образцы тканей 52
2.2. Методы исследований 52
2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот 52
2.2.2. Реакция обратной транскрипции 53
2.2.3. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 54
2.2.4. Математическая обработка данных ПЦР-РВ 55
2.2.5. Анализ метилирования 57
2.2.6. Подготовка библиотек микроРНК 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Разработка методической базы для ПЦР-РВ 59
3.2. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза 59
3.2.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих ферменты гликолиза 61
3.3. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола 76
3.3.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола 78
3.4. Бионформатический поиск потенциальных молекулярных маркеров СРП 102
3.4.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена NETO2 и регуляция его экспрессии 103
3.4.2. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена NR0B2 и регуляция его экспрессии 107
Заключение 110
Выводы 112
Список литературы 113
- Ген NETO2 - потенциальный онкоген СРП
- Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза ретиноевой кислоты
- Выделение нуклеиновых кислот
- Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих ферменты гликолиза
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак почки (РП) является одной из основных проблем онкоурологии и характеризуется высокой смертностью. Ежегодно по всему миру выявляют более 190 тыс. новых случаев рака почки и более 90 тыс. человек умирают по причине этого заболевания. Самым распространенным гистологическим типом РП (75%) является светлоклеточная почечноклеточная карцинома (светлоклеточный рак почки, СРП). В большинстве случаев РП возникает спорадически, причем мужчины заболевают в полтора раза чаще, чем женщины. Как правило, РП на ранних стадиях протекает бессимптомно. На момент постановки диагноза 25% больных имеют отдаленные метастазы. Между тем, при диагностике РП на I-ой клинической стадии заболевания выживаемость больных может достигать 70%. К настоящему времени для РП не выявлено специфичных диагностических маркеров. В российской клинической практике применяется только один опухолевый маркер, M2-РК (изомерная форма пируваткиназы), для выявления метастазов и рецидивов некоторых опухолей, включая РП (Moreno-Sanchez et al., 2009; Jahns et al., 2011). Поэтому актуальной задачей является развитие надежных и доступных для пациентов методов ранней диагностики (чувствительные и высокоспецифичные онкомаркеры) и лечения рака почки (таргетная терапия) на основе более глубокого изучения молекулярно-генетических особенностей канцерогенеза почки.
Рак почки характеризуется многочисленными генетическими и эпигенетическими нарушениями, которые приводят к активации или подавлению экспрессии многих генов, условно разделяемых на онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (Cairns, 2010). Вследствие этого происходит нарушение различных метаболических и сигнальных путей, например, энергетического обмена (Moreno-Sanchez et al., 2009). Для изучения роли определенных генов в канцерогенезе проводят оценку их экспрессии на уровне мРНК и белка в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями. Также исследуют возможные механизмы регуляции активности генов: статус метилирования, профиль микроРНК, модификации гистонов и др. За последние 20 лет разработаны различные методы анализа экспрессии генов, которые позволяют не только изучать активность и регуляцию определенных генов в биологических образцах (ПЦР, SSH), но и проводить масштабный анализ экспрессии генов (NGS, кДНК-микрочипы). Например, на основе результатов, полученных методом высокопроизводительного секвенирования и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) возможно получить достоверные данные об экспрессии множества генов, мутациях и профиле микроРНК, сделать выводы о возможных механизмах канцерогенеза и выбрать гены перспективные для дальнейшего применения в клинической практике.
Цель исследования. Основная цель исследования – идентификация онко-ассоциированных изменений экспрессии генов, в том числе вовлеченных в важнейшие метаболические пути, при светлоклеточном раке почки человека.
Задачи исследования.
-
Анализ транскриптомных баз данных и литературы для выбора потенциальных онко-ассоциированных генов.
-
Оптимизация методики количественных измерений содержания мРНК, а также микроРНК в образцах СРП.
-
Количественная оценка содержания мРНК выбранных генов и идентификация для некоторых из них альтернативных изоформ мРНК.
-
Поиск возможных причин, приводящих к изменению экспрессии исследуемых генов в опухолях почки. Секвенирование микроРНК в нескольких образцах СРП и оценка статуса метилирования выбранных генов.
-
Математическая обработка данных и сопоставление полученных результатов с клиническими характеристиками опухолей.
-
Анализ нарушений гликолиза и метаболизма ретинола при СРП.
-
Выбор генов, наиболее перспективных для дальнейшего применения в диагностике и, возможно, таргетной терапии СРП.
Научная новизна и практическая значимость работы. Проведен анализ данных клонотек EST, Oncomine и др., а также данных высокопроизводительного секвенирования, полученных на платформе Illumina для 50-ти транскриптомов парных образцов СРП человека. Для дальнейшего анализа выбраны два потенциальных онкомаркера - гены NETO2 и NROB2 и два гена, вероятно коэкспрессирующиеся с NETO2 (COX4NB, NEFL), а также гены, кодирующие ферменты гликолиза и компоненты метаболизма ретинола, экспрессирующиеся в нормальных и опухолевых тканях почки. Методом ПЦР-РВ впервые проведена количественная оценка уровня мРНК 40 генов при СРП. Подтверждено значительное повышение экспрессии гена NETO2 и практически полная инактивация гена NROB2. Показано, что, активация NETO2 происходит, главным образом, за счет miR-144, -206 и -335, а инактивация NROB2 – посредством гиперметилирования. Впервые выявлено повышение экспрессии генов гексокиназ – HK1, HK2, HK3 и гена фосфофруктокиназы PFKP, а также сохранение экспрессии нескольких генов, которые можно рекомендовать в качестве контрольных при транскриптомных исследованиях СРП. Впервые подтверждено и количественно оценено изменение экспрессии ряда генов, продукты которых задействованы в метаболизме ретинола. Оценен вклад альтернативного сплайсинга в экспрессию гена NETO2 и нескольких генов, кодирующих ферменты гликолиза. Десять генов со значительными изменениями экспрессии могут быть рекомендованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики СРП, а также в качестве потенциальных мишеней для таргетной терапии этого заболевания.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, 2012), «Петровские чтения - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки (Ульяновск, 2011), 3-й Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии и лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), I Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2012), II Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2013), «FEBS 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2014 (Москва, 2014). По материалам диссертации опубликованы три статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (331 наименований). Работа изложена на 145-ти страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 55 рисунков.
Ген NETO2 - потенциальный онкоген СРП
У человека ген NETO2 (Neuropilin and Tolloid like 2) локализируется на длинном плече 16-ой хромосомы и кодирует трансмембранный белок. Этот белок состоит из N-терминальной сигнальной последовательности и двух консервативных внеклеточных CUB-домена (в англоязычной литературе C1r/C1s, Uegf, Bmp1), за которыми следует одна копия цистеин богатых липопротеинов низкой плотности класса А - LDLa (Low-Density Lipoprotein) модуль (рис. 1). Модуль LDLa может принимать участие в белок-белковом взаимодействии и связываться с различными классами молекул. Показано, что LDLa повторы инициируют процесс активного эндоцитоза путем иммобилизации лигандов на поверхности клетки. Такой комплекс необходим впоследствии для формирования клатриновых ямок (Kibbey et al., 1998). Функция CUB-домена до сих пор не ясна, возможно, он принимает участие в белок-белковом взаимодействии на поверхности клеточной мембраны (Liu et al., 2011). Белок NETO2 на 57% идентичен по аминокислотной последовательности белку, представителю того же семейства, NETO1 и имеет две изоформы (изоформы 1 и 2). Изоформа 1 характеризуется наличием 7-ми дополнительных аминокислотных остатков в N-терминальной области (Stohr et al., 2002). Рис. 1. Структура белков NETO1 и NETO2 (http://www.hprd.org/). Signal peptide – N-терминальная внеклеточная область; CUB-домен – структура антипараллельный -складчатый слой; LDLa модуль – структура -шпилька; ТМ – сигнал интернализации цитоплазматической области.
Гены семейства NETO, главным образом, экспрессируются в тканях головного мозга и сетчатки (Sthr et al., 2002; Jung et al., 2007; Copits et al., 2011). Оба гена сравнительно малоизученны и исследуются только с 2002 года (Sthr et al., 2002). При исследовании глутаматных рецепторов нейронов мыши показано высокоспецифическое регуляторное взаимодействие NETO2 и рецепторов каинатного типа (Jung et al., 2007; Copits et al., 2011). В то же время NETO1 участвует в качестве регуляторной субъединицы глутаматных рецепторов нейронов - NMDA (Michishita et al., 2002). Также показано участие генов NETO-семейства в развитии головного мозга мышей в процессе эмбриогенеза (http://www.emouseatlas.org/). Отдельные случаи тканеспецифичной экспрессии генов семейства NETO выявлены в узком наборе клеток, включающих нейроны, гепатоциты, клетки поджелудочной железы и др. (Sutcliffe et al., 2011; Zhang et al., 2011; Ogawa et al., 2011). Кроме того, в современной литературе описаны случаи повышения экспрессии генов, асоциированное с канцерогенезом, ранее описанных как нейроспецифичные в норме (подобных NETO2) - хромогранин А, нейрон-специфичная энолаза, синатпофизин, нейрон-специфичный сайленсер NRSF и др. (Abbona et al., 1998; Coulson et al., 2000; Coulson et al., 2003; Gurrola-Diaz et al., 2003).
Ген NR0B2 (Nuclear Receptor subfamily 0, group B, member 2) у человека локализируется на коротком плече 1-ой хромосомы и состоит из двух экзонов, разделенных одним интроном длиной 1.2 т.п.н. Ген NR0B2 кодирует белок - орфановый рецептор, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов. Этот белок содержит лиганд-связывающий домен (LBD) и может взаимодействовать с другими ядерными рецепторами. Белок NR0B2 не может связываться с ДНК в качестве транскрипционного фактора из-за отсутствия ДНК-связывающего домена (DBD, DNA Binding Domain) (Seol et al., 1996). Ближайшим родственным белком для NR0B2 является рецептор DAX-1, оба белка характерны только для позвоночных (Lalli, Sassone-Corsi, 2003).
В клетке NR0B2 выполняет функцию ингибирования транскрипции, связываясь непосредственно с разными ядерными рецепторами (HNF4, LXRs, PPARs, GR, TR-бета, RAR-альфа, FXR, AR, NGFI, RXRs). NR0B2 связывается с С-концевым AF-2 доменом ядерных рецепторов через два функциональных LXXLL-мотива (NR-боксы), которые расположены в предполагаемой N-концевой спирали (Box 1) и в С-концевой области (Box 2) (Johansson et al., 2000) (рис. 2).
Структура классического ядерного рецептора (NR, Nuclear Receptor) и белка NR0B2 (Zhang et al., 2011). Ядерный рецептор содержит пять основных доменов: N-концевой лиганд-независимый трансактивационный домен (A/B), ДНК-связывающий домен (DBD или C домен), шарнирная область - D-домен, C-концевой лиганд-связывающий домен (LBD или Е домен) и лиганд-зависимый трансактивационный домен (AF2 или F домен). NR0B2 по сравнению с классическим ядерным рецептором не содержит DBD домен, содержит два функциональных LXXLL мотива.
На сегодняшний день известно три различных механизма ингибирования транскрипции генов посредством NR0B2. Первый механизм - прямая конкуренция с коактиватором связывания: NR0B2 связывается с AF-2 доменом ядерных рецепторов через два функциональных LXXLL мотива вместо коактиватора и выполняет ингибирующую функцию. Возможно два варианта отношений между ингибитором NR0B2 и другим коактиватом: 1) NR0B2 и коактиватор могут конкурировать за общий сайт связывания - AF-2, или 2) связывание NR0B2 с рецептором может вызывать его конформационные изменения, приводящие к диссоциации домена AF-2 и коактиватора. Второй механизм - непосредственное взаимодействие репрессирующей С-терминальной области NR0B2 с ядерными рецепторами, например, с ядерным фактором гепатоцитов - HNF4 (Johansson et al., 2000; Lee et al., 2000; Lee at al., 2002). Третьим механизмом является диссоциация с помощью NR0B2 комплексов, которые формируют некоторые ядерные рецепторы: комплексы гетородимеров RAR-RXR, димеров ER-альфа и гомодимеров HNF4-альфа (Klinge et al., 2002; Ourlin et al., 2003; Shimamoto et al., 2004).
В организме человека ген NR0B2 экспрессируется в печени, сердце, поджелудочной железе, почках, селезенке, тонкой кишке, надпочечниках и желудке (Sanyal et al., 2002; Nishizawa et al., 2002). Генетические изменения NR0B2: делеции, вставки, повторяющиеся элементы, одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) и хромосомные перестройки приводят к развитию различных заболеваний (Nishigori et al., 2001; Mitchell et al., 2003; Echwald et al., 2004; Zhou et al., 2010).
В 1926 г. Отто Варбург, сравнивая высокозлокачественные клетки с нормальными тканями, предположил существование так называемого «ракового обмена» (Warburg, 1926). Нормальные ткани интенсивно поглощают кислород и характеризуются высоким уровнем дыхания и эффектом Пастера (подавление гликолиза дыханием). Отличительными чертами обмена опухолевых клеток, наоборот, являются высокий уровень гликолиза и низкий уровень дыхания. Первоначально Варбург выдвинул гипотезу о том, что в раковых клетках образуется дефект в митохондриях, что приводит к необратимым нарушениям аэробного дыхания и последующей зависимости от гликолитического метаболизма, компенсирующего энергетическую неполноценность поврежденного дыхания (Warburg, 1926). Он показал, что раковые клетки продолжают использовать гликолиз для получения энергии даже тогда, когда кислород присутствует в тканях в достаточном количестве. Это явление получило название эффекта Варбурга. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о пониженном содержании в раковых клетках цитохрома С (Aisenberg, 1961); снижение активности митохондриальных ферментов сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы (Антонеева, 2005); работы Сейца с соавторами, проводившиеся на малигнизированных бластных клетках (Сейц, 1967); опыты Паула с культурой клеток почки, показавшие снижение дыхания в опухолевых клетках по сравнению с нормальными (Paul, 1966); исследования in vitro, показавшие увеличение интенсивности аэробного гликолиза в раковых клетках (Weinhouse, 1972). Ельциной была изучена реакция подавления дыхания гликолизом в опухолевых клетках (Ельцина, 1965). Также была изучена экспрессия каталитической субъединицы Н+-АТФ-синтазы (p-Fl— ATPase), которая необходима для снабжения клеток энергией и эффективного осуществления апоптоза, в митохондриях клеток опухолей печени, почек и толстого кишечника человека. Авторы показали, что в опухолевых клетках печени количество митохондрий уменьшается, тогда как в опухолевых клетках почки и толстого кишечника происходит избирательное подавление экспрессии Fl-АТФазы и увеличение экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Механизмы, в которых задействованы эти ферменты лимитируют активность митохондрий в опухолях, подтверждая гипотезу Варбурга (Locasale, 2010).
Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза ретиноевой кислоты
В эмбриональных тканях у мышей происходит изменение уровня экспрессии генов семейства альдегиддегидрогеназ (Aldh1a1, Aldh1a2 и Aldh1a3), которые участвуют в основных этапах метаболизма ретинола. Вывлена корреляция уровня экспрессии этих генов с увеличением содержания ретиноевой кислоты в процессе эмбриогенеза мышей в тканях почек, печени, сердца и кишечника. Возможно, уровень содержания ретиноевой кислоты в эмбриональных тканях контролируется механизмами, регулирующими развитие, которые также, могут быть вовлечены в модуляцию экспрессии ферментов, катализирующих биосинтез ретиноевой кислоты (Pangala, 1998).
В опухолевых клетках продукты метаболизма ретинола могут оказывать влияние на их рост и дифференцировку, активируя ядерные рецепторы ретиноидов. Ретиноевая кислота связывается с большей аффиностью с рецепторами ретиноевой кислоты, чем с рецепторами Х ретиноидов (Jemal et al., 2003). Кроме того, имеются данные о том, что антипролиферативная активность ретиноевой кислоты опосредуется именно через RAR-бета, а не через RAR-альфа или RAR-гамма. Показано, что экспрессии RAR-бета снижается в клеточных линиях опухолей почки человека, резистентных к ретиноевой кислоте (Berg et al., 1999). Ретиноевая кислота также может связыватся с гетородимерами, например RAR-RXR.
Выделяют ряд генов, участвующих во внутриклеточном биосинтезе ретиноевой кислоты, экспрессия которых изучена в ряде карцином. Например, выявлено снижение уровня мРНК конститутивных генов AKR1C1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1A1, ADH1B1, CRBP1, генов смейства ADH1 и ALDH1 при раке легкого, почек и толстой кишки (Barski et al., 1999; Lefranc et al., 2004; Ji et al., 2005; Kopantzev et al., 2008; Alzeer, Ellis, 2011; Leclerc et al., 2011). Выявлено повышение уровня мРНК гена CRABP2 при раке шейки матки (Zaitseva et al., 2007).
Ретинол регулирует процессы роста, деления и дефференцировки клеток, ограничивает свободно-радикальное окисление и участвует в метаболизме родопсина в сетчатке. Ретинол также участвует в биосинтезе гликопротеинов и является необходимым компонентом слизистых оболочек глаз, дыхательной, пищеварительной систем и мочевыводящих путей (Biesalski, Stoff, 1992; Biesalski, 1997). Ретинол и продукты его метаболизма активируют пролиферацию эпителиальных клеток, препятствуют накоплению в них кератогиалина и предотвращают избыточное ороговение эпителия. Воздействие ретиноевой кислотой in vitro вызывает многочисленные биохимические и метаболические изменения в тканях. Эти изменения, главным образом, тканеспецифичны. Ретиноевая кислота производит модификацию активности ферментов, участвующих в пролиферации и дифференцировке, и структурных белков. Также ретиноевая кислота осуществляет трансдукцию сигнала, влияющего на экспрессию мембранных рецепторов и других генов, включая онкогены, путем регуляции либо транскрипции, либо посттранскрипционных процессов, выступает в качестве морфогена в процессе эмбриогенеза (Lewandoski, Mackem, 2009). В настоящее времая благодаря своему широкому спектру действия ретиноевая кислота используется в клиниках для лечения кожных заболеваний и позиционируется в качестве кандидата для профилактики рака и терапии клеток на стадии дифференцировки (Dawson, 2004; Lefebvre et al., 2005; Osanai et al., 2010).
Механизм действия, оказываемый ретиноевой кислотой на процессы дефференцировки при отдельных раковых заболеваниях, отличается от механизма действия цитотоксических препаратов, применяемых в современной медицине. Эти препараты, главным образом, элиминируют опухолевые клетки, тем самым снижая пролиферативный потенциал опухоли. Ретиноевая кислота способствует дифференцировке и снижает пролиферацию опухолевых клеток (Richard, 2008).
В работах Мирца показано противоопухолевое действие интерферона (INF) в комплексе с ретиноевой кислотой и интерлейкина 2 (IL-2) в коплексе с полностью-транс-ретиноевой кислотой у больных раком почки (Mirza et al., 2006). Механизм кооперации 13,14-дигидроретиноевой кислоты и INF-a при раке почки изучен во многих работах (Lancillotti et al., 1995; Lotan et al., 1995; Giandomenico et al., 1997). Комбинация препаратов 13,14-дигидроретиноевой кислоты и INF-a приводит к ингибированию роста опухолевых клеток в клеточных линиях рака почки по сравнению с действием, оказываемым одиночными препаратами 13,14-дигидроретиноевой кислоты или INF-a. Также показано, что ретиноевая кислота может модулировать INF-индуцибельную экспрессию генов путем увеличения транскрипции INF-опосредованных генов при раке легких и шейки матки (Giandomenico et al., 1997). В ряде исследований проводили измерение уровня экспрессии рецептора ретиноевой кислоты RAR-бета до лечения и после лечения больных раком почки препаратами 13,14-дигидроретиноевой кислоты и INF-a. Показано, что после лечения у больных наблюдалось значительное увеличение экспрессии RAR-бета (Wang et al., 2002). Также проводились исследования уровня экспрессии фермента лецитинретинолацетилтранферазы (LRAT). Показано, что при раке почки уровень экспрессии этого фермента значительно снижается, что может быть связано со снижением интенсивности превращения сложного эфира ретинола в полностью-транс-ретинол (Guo et al., 2001). Снижение содержания ретинола и сложного эфира ретинола в опухолевых клетках, а также снижение экпрессии LRAT может играть важную роль в канцерогенезе (Guo, Gudas, 1998; Guo et al., 2000; Guo et al., 2001; Guo et al., 2002; Zhan et al., 2003).
Регуляция активности генов играет важную роль в процессе деления, дифференцировки и роста клеток. Основными молекулярными механизмами эпигенетической регуляции активности генов являются некодирующие РНК, метилирование и модификации гистонов. В настоящее время известно, что нарушение эпигенетической регуляции: изменение профиля экспрессии микроРНК, гипреметилирование промоторных областей генов-супрессоров, диметилирование онкогенов и изменение структуры хроматина часто приводит к развитию злокачественных новообразований.
МикроРНК являются эндогенными короткими (19-25 нуклеотида) некодирующими молекулами РНК, которые могут ингибировать экспрессию генов-мишеней (Kim, 2005). МикроРНК участвуют в регуляции таких основных клеточных функций, как дифференцировка, рост, пролиферация и миграция клеток, апоптоз и внутриклеточный метаболизм (Wang et al., 2007; Zhang, 2008). МикроРНК и их гены-мишени образуют сложные регуляторные сети. Например, одна микроРНК может связываться и регулировать экспрессию нескольких генов-мишеней или несколько различных микроРНК могут регулировать экспрессию одного гена (Carthew, Sontheimer, 2009). МикроРНК, главным образом, играет важную роль в отрицательной регуляции экспрессии генов (ингибирование трансляции). Тем не менее, в ряде случаев, например в условиях клеточного стресса, наблюдается положительная регуляция экспрессии генов посредством микроРНК (активация трансляции) (Vasudevan, Steitz, 2007). Большинство генов, кодирующих микроРНК, располагаются в областях между генами ( 1кb аннотированных последовательностей), часть транскрибируется в интронах белок-кодирующих генов, меньшее число находится в областях генома некодирующих РНК. Большинство микроРНК кодируются автономными транскрипционными единицами, продукты которых состоят из нескольких транскриптов (Bartel, 2004). Эти транскрипты могут кодировать различные микроРНК-кластеры или микроРНК и белок. В настоящее время полагают, что большое разнообразие микроРНК животных возникло не за счет дупликации генов, а благодаря накоплению в процессе эволюции изменений в последовательности нуклеотидов (Lu et al., 2008).
Выделение нуклеиновых кислот
Замороженные в жидком азоте образцы опухолевых и нормальных тканей почки (20-30 мкг) подвергались механической гомогенизации на микродисмембраторе фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК и микроРНК использовали специализированные наборы «RNeasy Mini Kit» и «miRNeasy Mini Kit» фирмы Qiagen (Нидерланды). Для выделения ДНК использовали специализированный набор «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen, Нидерланды). Выделение нуклеиновых кислот проводили согласно протоколу производителя. Оценка количества выделенных РНК и микроРНК проводилась на спектрофотометре NanoDrop 1000, (Nanodrop, США) и флюориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США), оценка качества – на анализаторе качества нуклеиновых кислот Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Параметр RIN (RNA Integrity Number, показатель качества РНК) для РНК и микроРНК для дальнейших исследований составлял не менее 7. Препараты РНК и микроРНК хранили при температуре -810С. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Nanodrop, США) при длине волны 260 нм. Качество выделенной ДНК проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия и по значению отношения 260/280 нм, которое составляло 1,8 - 2,0. Препараты ДНК хранили при температуре -320С.
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали 1 мкг микроРНК, которую обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, Литва) и инкубировали в 10-кратном буфере для ДНКазы в течение 15 мин. при комнатной температуре. Затем добавляли 25 мМ EDTA (Fermentas, Литва) и инкубировали 10 мин. при 650С. Отдельно готовили смесь для обратной транскрипции: добавляли 50 нM специфического праймера для целевой микроРНК - TagMan microRNA Assays (Life Technologies, США), содержащего петлю; 250 нM смеси нуклеотидов (Fermentas, Литва); 5-кратный буфер для обратной транскрипции, содержащий 250 мM Tris-HCl (pH 8.3, 25оC), 250 мM KCl, 20 мM MgCl2 и 50 мM DTT (Fermentas, Литва); 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas, Литва) и ТЕ буфер (Amplisens, Москва). В приготовленную реакционную смесь на одну реакцию обратной транскрипции добавляли 5 нг обработанной ДНКазой микроРНК. Смесь общим объемом 20 мкл инкубировали при 160С в течение 30 мин., при 420С - 30 мин., и 5 мин. при 850С. Дополнительно, готовили несколько контрольных препаратов для проведения ПЦР-РВ: препараты OT микроРНК, не обработанные ДНКазой; препараты OT, где вместо микроРНК добавлен буфер ТЕ; препараты ОТ микроРНК, не обработанные ДНКазой, в которые не добавлена обратная транскриптаза M-MuLV; препараты микроРНК, обработанной ДНКазой, в которые не добавлена обратная транскриптаза M-MuLV; препараты ОТ, в которые вместо микроРНК добавлен буфер ТЕ; препараты, в которые вместо микроРНК добавлен буфер ТЕ, не обработанные обратной транскриптазой M-MuLV. В результате реакции обратной транскрипции на матрице микроРНК, выделенной из образцов опухолевых и нормальных тканей синтезировалась кДНК. Для получения кДНК по матрице мРНК также проводили реакцию обратной транскрипции. Суммарную РНК (1 мкг) обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, Литва) в 10-кратном ДНКазном буфере (Fermentas, Литва) и инкубировали 15 мин. при комнатной температуре. Затем добавляли 25 мM EDTA (Fermentas, Литва) и инкубировали 10 мин. при 650С. Добавляли 100 нг случайных гексануклеотидных праймеров, смесь прогревали до 700С в течение 5 мин. и помещали на лед на 2 мин. Затем в реакцию добавляли 1 мM смеси нуклеотидов, 5-кратный реакционный буфер (Fermentas, Литва), содержащий 250 мM Tris-HCl (pH 8.3, 25оC), 250 мM KCl, 20 мM MgCl2, 50 мM DTT (Fermentas, Литва) и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas, Литва). Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующем температурном режиме: 250С - 10 мин, 420С - 60 мин, 500С - 10 мин, 700С - 10 мин. Препараты кДНК хранили при температуре -320С.
Для проведения ПЦР-РВ использовали ПЦР-смесь 2FRT, содержащую Mg2+ (Amplisens, Москва); термостабильную ДНК-полимеразу TaqF (Amplisens, Москва); 10-кратную смесь нуклеотидов (Amplisens, Москва); набор специфичных для каждой РНК или микроРНК праймеров и зондов TagMan microRNA Assays (Life Technologies, США); синтезированные праймеры и зонды для контрольных генов (Евроген, Москва). Приготовленные реакционные смеси по 20 мкл вносили в 96-луночный планшет, после чего добавляли в каждую лунку по 4 мкл (5-20 нг) матрицы (кДНК) и плотно закрывали планшет пленкой. ПЦР-РВ проводили на приборе Applied Biosystems 7500 Fast Realime PCR System (Life Technologies, США) с использованием программного обеспечения RQ (Relative Quantitation software, Life Technologies, США). Использовали следующий температурный режим: предварительная денатурация и активация фермента при 95oC в течение 15 мин (по протоколу для TaqF ДНК-полимеразы), затем 50 циклов: денатурация - 15 сек при 95oC, отжиг праймеров и зонда; элонгация - 1 мин. при 60oC.
Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием. Все наборы праймеров и зондов были специфичны в условиях ПЦР-РВ, ампликоны имели ожидаемые нуклеотидные последовательности и размер. Секвенирование и ПЦР-РВ проводили на приборной базе ЦКП «Геном».
Сравнивали уровень повышения мРНК генов, равный 1/R и показывающий во сколько раз содержание мРНК каждого гена повышено в опухоли по сравнению с нормой. Эффективность ПЦР-РВ (Е) для контрольных и исследуемых генов рассчитывалась с помощью разработанной в ИМБ РАН программы «АТГ» (Анализ Транскрипции Генов, Свидетельство №2008612585, 2008, Роспатент, РФ). В данной программе эффективность реакции рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой, которая аппроксимирует кинетическую кривую на её линейном участке с помощью метода наименьших квадратов. При дальнейшей обработке данных учитывали полученные значения эффективностей, которые для контрольных генов составили Еопухоль = Енорма = (90 ± 3)%, для исследуемых - Еопухоль = Енорма = (92 ± 8)%. Достоверность наблюдаемых изменений оценивали при помощи непараметрических тестов Уилкоксона, Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса, а также рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена. Данные считали достоверными при Р 0,05, где Р - показатель статистической значимости данных.
Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих ферменты гликолиза
Гены HK1, HK2 и HK3 кодируют гексокиназы 1, 2 и 3, которые принимают участие в первом (основном) этапе гликолиза - фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата (рис. 1). Гены HK1, HK2 и HK3 экспрессируются конститутивно во всех в тканях человека. Однако при раке почки и гептоцеллюлярной карциноме показано повышение экспрессии этих генов, что вероятно связано с активацией транспорта глюкозы в опухолевых клетках (Bujalowska, 1975).
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена HK1 при СРП представлены на рисунке 2. В большинстве исследуемых образцов (60%, P 0,05) выявлено повышение уровня экспрессии гена HK1 от 2-х до 139-ти раз. В 20% случаев (4/20, P 0,05) наблюдалось снижение его экспрессии от 3-х до 51-го раза. Уровень мРНК гена HK1 в 20% образцов СРП (4/20, P 0,05) не изменялся. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 2,4. Характерная особенность экспресии гена HK1 – значительное повышение экспрессии в образцах СРП II-ой стадии.
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена HK2 представлены на рисунке 3. В 81% образцов СРП (29/36, P 0,05) выявлено значительное повышение экспрессии гена HK2 от 2-х до 35-ти раз. В 8% случаев (3/36, P 0,05) наблюдалось снижение его экспрессии от 2-х до 4-х раз. В нескольких образцах (11%, P 0,05) обнаружено сохранение уровня мРНК гена HK2. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 15,9.
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена HK3 представлены на рисунке 4. В 52% образцов СРП (17/33, P 0,05) наблюдалось значительное повышение экспрессии гена HK3 от 2-х до 448-ми раз. В 18% случаев (6/33, P 0,05) выявлено значительное снижение экспрессии от 2-х до 430-ти раз. В 30% исследуемых образцов (10/33, P 0,05) экспрессия этого гена не изменялась. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 2,0. Характерная особенность экспрессии гена HK3 – ее повышение преимущественно в образцах СРП II-ой (70%, P 0,05) и III-ей (60%, P 0,05) стадий.
Ген ADPGK кодирует фермент АДФ-зависимую глюкокиназу, которая участвует в первом этапе гликолиза (рис. 1). Ген ADPGK экспрессируется конститутивно во всех тканях человека. На сегодняшний день, в современной биомедицинской литературе данные об экспрессии гена ADPGK в опухолевых тканях отстствуют.
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена ADPGK представлены на рисунке 5. В большинстве образцов СРП (68%, P 0,05) выявлено сохранение экспрессии гена ADPGK. В 29% случаев (8/28, P 0,05) наблюдалось повышение уровня мРНК гена ADPGK от 2-х до 12-ти раз. В одном образце наблюдалось незначительное снижение его экспрессии в 3 раза. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 1,4.
Ген GPI кодирует глюкозо-6-фосфат изомеразу, которая относится к семейству белков фосфоглюкозоизомераз и катализирует обратимую изомеризацию глюкозо-6-фосфата до фруктозо-6-фосфата (2-й этап гликолиза) (рис. 1). Кроме того, GPI участвует в глюконеогенезе и является нейротрофным фактором спинномозговых и сенсорных нейронов. Известно, что GPI может фукционировать в качестве секретируемого опухолью цитокина или ангиогенного фактора и стимулировать подвижность клеток эндотелия. Ген GPI экспрессируется во всех тканях человека. В исследованиях Ниинаки с коллегами из Института рака Барбары Энн (Карманос, США) показана гиперэкспрессия гена GPI при раке почки (Niinaka et al., 1998).
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена GPI при СРП представлены на рисунке 6. В большинстве исследуемых образцов (64%, P 0,05) выявлено сохранение уровня мРНК гена GPI. В 25% образцов СРП (7/28, P 0,05) выявлено повышение экспрессии гена GPI от 2-х до 8-ми раз. В 11% случаев (3/28, P 0,05) наблюдалось незначительное снижение его экспрессии от 2-х до 3-х раз. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 1,2. Повышение эксрессии было характерно для образцов преимущественно II-ой стадии (45,5%). Выявлено, что в образцах СРП, главным образом, экспрессируется длинная изоформа 1 гена GPI (NM_001184722.1) (из двух известных).
Ген PFKP кодирует фосфофруктокиназу, которая является одним из ключевых ферментов гликолиза (3-й этап - необратимое преобразование фруктозо-6-фосфата в фруктозо-1,6-фосфат) (рис. 1). Ген PFKP экспрессируется конститутивно во всех тканях человека. Однако в семиномах и эмбриональных опухолях показана дерегуляция его экспрессии (Hofer et al., 2005). Данные об экспрессии гена PFKP в опухолях почки в литературе отсутствуют.
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена PFKP представлены на рисунке 7. В 86% образцов СРП (25/29, P 0,05) выявлено значительное повышение экспрессии гена PFKP от 2,5 до 34-х раз. В 4-х образцах (14%, P 0,05) уровень мРНК гена PFKP не изменялся. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 5,7. Рис. 7. Относительный уровень мРНК гена PFKP при СРП. Данные количественной ПЦР.
Ген ALDOA кодирует альдолазу А, которая в гликолизе катализирует обратимое преобразование фруктозо-1,6-бисфосфата в глицеральдегид-3-фосфат и дигидроксиацетонфосфат (4-й этап) (рис. 1). У позвоночных известно 3 изофермента альдолазы (A, B и С), которые отличаются своими каталитическими свойствами. Альдолаза А экспрессируется преимущественно в скелетной мускулатуре. В печени и кишечнике экспрессия альдолазы А подавляется и активируется экспрессия альдолазы B. В нервных тканях экспрессируются альдолазы А и C. В работах Лин с коллегами в клетках аденокарциномы легкого выявлена экспрессия аберрантного гена ALDOA (Lin et al., 2011). При раке легкого и линиях клеток меланомы показано повышение экспрессии гена ALDOA на уровне мРНК и белка (Rho et al., 2009; Suzuki et al., 2011). В современной биомедицинской литературе данные об экспрессии гена ALDOA в опухолевых тканях почки отсутствуют.
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена ALDOA представлены на рисунке 8. В 53% образцов СРП (8/15, P 0,05) экспрессия гена ALDOA не изменялась. В 40% случаев (6/15, P 0,05) наблюдалось повышение экспрессии гена ALDOA от 2-х до 7-ми раз. Снижение его экспрессии выявлено в одном образце СПР I-ой стадии. Среднее значение относительного уровня мРНК составило 1,4.
Ген GAPDH кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогиназу и является классическим контрольным геном для транскриптомных исследований. GAPDH в гликолизе катализирует обратимое окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата в присутствии неорганического фосфата и НАД (6-й этап) (рис. 1). Кроме того, белок GAPDH участвует в транскрипции, транспорте РНК, репликации ДНК и апоптозе. Ген GAPDH является конститутивным и экспрессируется во всех тканях человека. Однако в исследовании нормирования количественных данных ПЦР-РВ Краснова с коллегами наблюдалось изменение стабильности экспрессии гена GAPDH при СРП (Краснов и др., 2011). Также, в более ранних исследованиях транскриптома почечно-клеточной карциномы выявлено повышение экспрессии гена GAPDH (Vila et al., 2000).
Результаты количественной оценки уровня мРНК гена GAPDH представлены на рисунке 9. В половине образцов СРП (6/12, P 0,05) экспрессия гена GAPDH не изменялась. В 30% случаев (4/12, P 0,05) выявлено повышение его экспрессии от 2,5 до 7-ми раз. В двух образцах (12%, P 0,05) наблюдалось снижение экспрессии гена GAPDH до 44-х раз. Среднее значение относительного уровня мРНК составило 1,2. Выявлено, что в образцах СПР, главным образом, экспрессируется альтернативно-сплайсированная длинная изоформа 2 гена GAPDH (NM_001256799.1), кодирующая, так называемый, полноразмерный белок.
