Содержание к диссертации
Введение
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
2.1 Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии 7
2.2 Краткие исторические данные, распространение вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей и ущерб, причиняемый этим заболеванием 15
2.3 Характеристика семейства парвовирусов 18
2.4 Эпизоотологические данные болезни 22
2.5 Клинико-патоморфологические признаки 25
2.6 Диагностика заболевания 31
2.7 Профилактика и меры борьбы 34
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
3.1 Материалы и методы 39
3.1.1 Очистка вируссодержащей жидкости методом гельхроматографии на макропористом стекле 41
3.1.2 Выделение иммуноглобулинов 42
3.1.3 Получение иммунопероксидазного конъюгата 43
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
3.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа 51
3.2.1.1 Получение очищенного вируса энтерита гусей 51
3.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови к вирусу энтерита гусей 53
3.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови гусей 54
3.2.1.4 Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата.55
3.2.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к парвовирусу гусей 57
3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена 58
3.2.2.2 Определение рН сорбирующего буфера 59
3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена 61
3.2.2.4 Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным парвовирусным антигеном..63
3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа..65
3.2.2.6 Определение диагностического титра сыворотки в ИФА 67
3.2.2.7 Количественная оценка титра антител к вирусу энтерита гусей методом одного разведения 70
3.2.3 Практическое использование разработанной тест системы на основе непрямого метода ИФА 77
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 86
5 ВЫВОДЫ 96
6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
ПРИЛОЖЕНИЕ 122
- Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии
- Получение иммунопероксидазного конъюгата
- Получение очищенного вируса энтерита гусей
Введение к работе
Гусеводство, как любая отрасль птицеводства является резервом ускоренного увеличения производства мяса. Кроме того, развитие его оправдано тем, что гусиное мясо, отличаясь по вкусовым качествам от мяса других видов птиц, расширяет ассортимент мясных продуктов. Мясо молодых, 2-месячного возраста гусят-бройлеров известно, как ценный диетический продукт питания, а гусиная печень, получаемая при откорме специальных пород гусей (вишнитес, рейнских и др.), относится к деликатесам. Гусиный жир используется в парфюмерной и фармацевтической промышленности, а пух и перо являются ценным сырьем для легкой промышленности.
Актуальность проблемы. Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди молодняка 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью, достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982; Л.М. Контримавичус, 1983; Б.Б.Трефилов, 2000; А. Белецкая, 2003).
Данные эпизоотологических и клинических наблюдений, патологоанатомической картины и лабораторных исследований свидетельствуют о том, что вирусный энтерит гусей (ВЭГ) протекает как моноинфекция и как смешанная инфекция с бактериальными, грибковыми и паразитарными болезнями (сальмонеллезы, колибактериоз, аспергиллез и кокцидиозы) (Б.Б.Трефилов, 2000).
Диагностика смешанных инфекций связана со значительными трудностями и требует комбинированного использования современных вирусологических и микробиологических методов исследования.
Следует отметить, что существующие методы лабораторной диагностики ВЭГ (реакция диффузионной преципитации, метод флуоресцирующих антител, реакция нейтрализации) являются либо недостаточно чувствительными, либо весьма трудоемкими, дорогостоящими, требуют специального оборудования и связаны с сезонностью репродуктивного периода гусей.
Поэтому разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики этой болезни являются актуальными и имеют большое научное и практическое значение.
В зарубежной и отечественной литературе имеются сообщения о все возрастающей роли в диагностике инфекционных болезней, микотоксикозов и эймериозов животных иммуноферментного метода, обладающего высокой специфичностью, чувствительностью и лишенного недостатков, отмеченных при других вышеуказанных методах.
Цель и задачи работы. Учитывая опасность ВЭГ для гусеводства и отсутствие экспресс метода диагностики заболевания, целью настоящих исследований явилась разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики ВЭГ, основанной на выявлении специфических антител к вирусу энтерита гусей.
В соответствии с поставленной целью в задачи наших исследований входило:
Получить высокоочищенный антиген вируса энтерита и вирусспецифическую гипериммунную сыворотку гусей;
Получить антивидовой иммунопероксидазный конъюгат специфичный к IgG гусей;
Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения антител к вирусу энтерита гусей в сыворотке крови гусей методом последовательных разведений и методом одного разведения;
Изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа (ИФА) в сравнении с реакцией нейтрализации при диагностике ВЭГ;
Испытать иммуноферментную тест-систему при изучении иммуногенеза у вакцинированных против ВЭГ;
Разработать Методические указания для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа.
Научная новизна. Впервые в РФ для серологической диагностики ВЭГ
разработан непрямой вариант ИФА с использованием отечественных
препаратов и реактивов. Выделен IgG из сыворотки крови интактных гусей,
получен конъюгат иммунопероксидазный антивидовоЙ гусиный. Дана
сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при
ВЭГ. Изучена кинетика формирования поствакцинального иммунитета у
гусят и гусей родительского стада против вирусного энтерита с применением
ИФА в экспериментальных и производственных условиях. Установлена
высокая чувствительность и специфичность разработанной
иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотках крови гусей к вирусу энтерита.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны иммуноферментная тест-система для диагностики ВЭГ и методические указания по ее применению в птицеводческих хозяйствах и научно-производственных лабораториях. Показана перспективность применения ИФА при проведении серологического мониторинга и определении уровня поствакцинального иммунитета гусепоголовья.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Методических советах отдела вирусологии и ОБП ВНИВИП (2003-2005гг.), на Международной Юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике в промышленном птицеводстве» (г. Санкт-Петербург-Ломоносов, 14-16 сентября 2004) и на 18-й Международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии».
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 печатных работах.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на І 32 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 254 источника, из которых 143 зарубежных.
2 Обзор литературы
Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии
В течение последнего десятилетия в диагностике инфекционных заболеваний широкое распространение получили методы иммуноферментного анализа. В отличие от классических иммунохимических методов лабораторной диагностики, основанных на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки.
В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом, вплоть до 10-21 молей в образце (А. Ройт с соавт., 2000). Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментов -биокатализаторов, которые позволяют создать каскадные системы усиления различных химических сигналов. Ферменты, используемые в иммуноанализе, должны удовлетворять следующим требованиям:
- доступность в чистом виде;
- простота и чувствительность методов определения продуктов ферментативной реакции;
- высокая стабильность и активность конъюгатов при хранении и в условиях выполнения анализа.
Наибольшее распространение в иммуноферментном анализе среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидазы из корней хрена, щелочная фосфатаза из слизистой кишечника теленка и р-галактозидазы Е. coli. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций.
Пероксидаза остается самым доступным ферментом. Она содержит легко окисляемые периодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления (Gallacher, 1981) активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным.
Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера (Gallacher, 1986). Стабилизация водных растворов 3,3 , 5,5 -тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона (Parham, Warren, 1986). Удобны в работе водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина (Wada, Kosaka, 1986).
Фенолы и К,1Ч-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, м- или п- замещенные анилины (Katsuyama, Shishido, 1983; Trager, Sojka, 1983; Gantzer, 1985), 3-амино-9-этилкарбозол (Gallacher, 1986). Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола (Stout, 1984). Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, ее интенсивности и стабильности во времени после остановки реакции. НИ-диалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную (Trager, Sojka, 1983) или фосфатную группу (Frey et al., 1986) стабильны при хранении, дают интенсивную и стабильную окраску (Trager, Sojka, 1983) и низкую неспецифическую реакцию в присутствии белков нормальной сыворотки (Frey, Zimmermann, 1986). Для повышения стабильности конъюгатов пероксидазы при лиофильной сушке, хранении и стоянии в растворе очень часто авторы используют различные добавки (Shaffar, 1981; Dawson, Homan, 1982; Brodbeck, Gallati, 1984; Anawis, Lindberg, 1985; Sun Ming, 1985; Klenner, Kleinhammer, 1986; Wehner, Mattersberger, 1986). Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка (Dawson, Homan, 1982), солей кальция (Dawson, Homan, 1982; Anawis, Lindberg, 1985), полиэтиленгликоля (Anawis, Lindberg, 1985), антибиотиков (Sun Ming, 1985).
Получение иммунопероксидазного конъюгата
Активность конъюгата проверяли в прямом простом сэндвич-методе со специфическим иммуноглобулином, который использовали в качестве антигена при получении данного антивидового конъюгата. 5мг специфического иммуноглобулина растворяли в 5см3 0,01М фосфатно-буферного раствора с 0,15М хлорида натрия рН 7,2-7,4. Корректировали концентрацию по данным спектрофотометрирования раствора при длине волны 280нм по формуле: ОДгво/І-ЗхР, где 1,3-эмпирический коэффициент; Р-разведение. Раствор специфического иммуноглобулина разбавляли до концентрации 1 мкг/см3 ФБР рН 7,2-7,4 и сорбировали его в лунках полистиролового планшета в течение 2,5 часа при 37С или 18-20 часов при 4-8С. Трижды отмывали ФБР с твином-20 (ФБРТ), добавляя в каждую лунку не менее 0,2см3. Затем вносили по 0,1см3 конъюгата и термостатировали при 37С в течение 30 минут, содержимое лунок удаляли и планшет трехкратно отмывали по 0,2см3. Добавляли по 0,1см3 субстратной смеси и через 20 минут наблюдали изменение окраски, которая должна быть коричневой. Спектрофотометрировали при длине волны 450 нм, если оптическая плотность была (0,8±0,4) со специфическим иммуноглобулином и не более (0,2±0,05) с IgG других видов животных и с бычьим сывороточным альбумином, то препарат был пригоден к использованию в непрямом методе иммуноферментного анализа для обнаружения специфических антител к вирусу энтерита гусей.
Для определения конкретного оптимального рабочего разведения антивидового конъюгата поверхность лунок полистиролового планшета сенсибилизировали очищенным антигеном вируса энтерита гусей в разведении 1:5. После 18-20 часовой экспозиции и трехкратного отмывания в лунки планшета вносили сыворотки (положительную и отрицательную) в разведениях от 1:50 до 1:6400, которые инкубировали 30 минут при 37С.
Антивидовой конъюгат вносили в разведениях близких к предварительно оттитрованным. За рабочее разведение конъюгата принимали концентрацию, при которой выявляли антитела позитивной сыворотки в наибольшем разведении при минимальном фоне неспецифического окрашивания в лунках с негативной сывороткой. В наших опытах рабочее разведение полученных антивидовых конъюгатов варьировало от 1:300 до 1:500.
В очищенном препарате вируса, в конъюгате и промежуточных продуктах его получения и очистки, концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя в качестве стандартного раствора бычий сывороточный альбумин (БСА, производства НИИЭМ, Беларусь).
Постановка непрямого метода ИФА для обнаружения специфических антител к вирусу энтерита гусей Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет для ИФА (производства Biohit, Финляндия) использовали очищенный антиген вируса энтерита гусей в оптимальной концентрации, разведенный 0,01М фосфатно-буферным раствором с 0,15М NaCI рН 7,2±0,2. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 18-20 часов при температуре 4-8С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали трехкратно в объеме 0,2см3 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20, рН 7,2±0,2 ФБРТ. Планшеты для ИФА с иммобилизированным антигеном вируса энтерита были пригодны для постановки реакции при хранении их при температуре 4-8С в течение 6 мес.
При качественной постановке реакции в лунки с адсорбированным антигеном вносили по 0,1см3 специфической (положительной) сыворотки, контрольной (отрицательной) и исследуемых сывороток в разведении 1:100. Планшет помещали в термостат при 37С на 30 минут. Затем содержимое лунок планшета удаляли и планшет трехкратно отмывали в объеме 0,2см3 от несвязавшихся антител.
В отмытые лунки планшета вносили по 0,1см3 пероксидазного конъюгата (IgG сыворотки меченые пероксидазой) в рабочем разведении, термостатировали 30 минут при 37С и отмывали лунки планшета трехкратно в объеме 0,2см3 ФБРТ. Затем добавляли по 0,1см3 субстратно-индикаторной смеси (0,08 мг/см3 5-аминосалициловой кислоты и раствор перекиси водорода (1:600) в разведении 10:1). Планшет помещали в темное место при комнатной температуре на 15-20 минут. Реакцию останавливали 0,05см3 1% раствора NaOH, считывали поглощение (оптическую плотность) на иммуноферментном анализаторе «Пикон» при длине волны 450 нм.
Получение очищенного вируса энтерита гусей
Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови к вирусу энтерита гусей использовали клинически здоровых гусят 30-суточного возраста, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней (ньюкаслская болезнь, гепатит, аденовирусная и реовирусная инфекции гусей).
Иммунизацию проводили путем введения нарастающих доз очищенного вируса энтерита гусей по следующей схеме:
Подкожное введение антигена проводили в нижнюю треть шеи. Внутрибрюшинное введение антигена вируса энтерита гусей осуществляли следующим образом. Птицу фиксировали за ноги вниз головой для того, чтобы кишечник сместился в грудино-брюшную полость. Затем в области, где заканчивается киль, отступя 2-Зсм от средней линии живота удаляли перо, и место инъекции обрабатывали 70%-ным этиловым спиртом. Проводили вкол инъекционной иглой сквозь кожу и брюшинную стенку на глубину 0,5см и с помощью шприца инокулировали объем антигена. За иммунизированной птицей вели наблюдение.
Через 14 дней после последней иммунизации гусей тотально обескровливали путем взятия крови из сердца.
Кровь разливали по 3-5см3 в пробирки, предварительно смоченные физиологическим раствором. Пробирки маркировали с указанием номера птицы, даты взятия крови и ставили на 1 час в термостат при температуре 37С. Сгусток крови обводили спицей и помещали в холодильник при 2-4С на 16-18 часов для ретракции сгустка. Полученную сыворотку крови сливали в стерильные флаконы.
Активность полученных гипериммунных сывороток определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток гусиных эмбрионов в р-варианте по общепринятой методике. Результаты свидетельствовали о том, что гипериммунная сыворотка крови гусей имела титр 9,3-10,3 Iog2 (1:640 -1:1280).
Таким образом, нами была получена высокоактивная положительная сыворотка крови к вирусу энтерита гусей для ИФА.
Получение отрицательной сыворотки крови гусей Для получения отрицательной сыворотки крови использовали клинически здоровых гусей свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к ВЭГ. Кровь разливали по 3-5см3 в пробирки, предварительно смоченные физиологическим раствором. Пробирки маркировали с указанием номера птицы, даты взятия крови и ставили в термостат на 1 час при температуре 37С. Сгусток крови обводили спицей и помещали в холодильник при 2-4С на 16-18 часов для ретракции сгустка.
Полученную сыворотку крови сливали в стерильные флаконы и проверяли на отсутствие антител к вирусу энтерита в реакции нейтрализации. Результаты показали, что исследуемая сыворотка крови не содержала антител к вирусу энтерита гусей.
Таким образом, нами была получена отрицательная сыворотка крови гусей, которая была необходима: во-первых, для отрицательного контроля при постановке реакции ИФА; во-вторых, для получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата.
Качество конъюгата зависело от высокой активности фермента и специфических иммуноглобулинов, соотношения фермента и иммуноглобулинов в конъюгате (показатель их связывания - отношение оптической плотности иминовой основы фермента пероксидазы к оптической плотности общего белка конъюгата, коэффициент связывания - ОП4оз/ОП28о).
В работе по получению конъюгата использовали препарат пероксидазы производства Олайнского НПО «Биолар», RZ = 2,7, который предварительно очищали на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой до RZ=3,0. При этом использовали одноступенчатый метод очистки пероксидазы. Собирали первую фракцию белка, определяли RZ. Результаты показали, что RZ первой белковой фракции был не ниже 3. Полученный одностадийной очисткой препарат превосходил по степени очистки и гомогенности пероксидазу хрена производства «Биолар». Очищенный в лабораторных условиях фермент давал одну доминантную полосу в электрофорезе и две слабовыраженные минорные полосы.
Производственный препарат содержал три четко выраженные белковые полосы и несколько (около 4) минорных. RZ различных серий препарата после очистки колебалась от 3,0 до 3,8, а различные серии производственного препарата давали разброс от 2,7 до 3,0. В качестве конъюгата использовали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, т. к. именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с иммуноглобулинами в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Конъюгаты пиковых фракций с показателем коэффициента связывания 0,4-0,6 были высокоактивными в противоположность конъюгатам с показателем коэффициента связывания ниже 0,4 (фракции левого и правого плеча), которые обладали низкой активностью, давали неспецифический фон и в работе не были использованы (рис. 2).
Конъюгат лиофилизировали в присутствии 1% бычьего сывороточного альбумина и проверяли исходную активность в прямом методе ИФА. Активность конъюгата составила 1:6000.
Для лиофильно высушенного конъюгата подбирали оптимальное рабочее разведение в ИФА, так как от правильно выбранного рабочего разведения иммуноглобулинового конъюгата зависит результат реакции.
При разработке диагностической тест-системы ИФА для выявления специфических антител к парвовирусу гусей одну ампулу лиофилизированного конъюгата разводили 1:20 (рабочее разведение). В наших экспериментах рабочее разведение конъюгата составило 1:300-1:400. Жидкий конъюгат разливали по 0,2см3 в ампулы и высушивали в присутствии стабилизатора - 1% бычьего сывороточного альбумина на аппарате типа В-71 фирмы «New Brunswick» (США) до конечной температуры в препарате 22-23С, постоянного вакуума 11-12 мкр ртутного столба. Общее время лиофилизации не превышало 22-25 часов.
