Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Биологические свойства возбудителя бешенства 10
1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства 12
1.3. Иммунитет при бешенстве и методы его оценки 21
1.4. Лечебно-профилактические средства от бешенства 25
1.5.Интерферон, индукторы интерферона и другие противовирусные препараты 32
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1. Материалы и методы исследований 39
2.1.1. Материалы исследований 39
2.1.2. Методы исследований г 41
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 46
3.1. Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов 46
3.2. Изучение патогенных свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства 54
3.3. Изучение эффективности антирабического глобулина из сыворотки крови овец производства при экспериментальном бешенстве 59
3.4. Получение препарата эндонуклеазы и определение его антирабического эффекта 64
3.5. Изучение антирабической активности циклоферона 74
3.6. Сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов при экспериментальном бешенстве... 77
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 84
Выводы 101
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 102
Список ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 103
ПРИЛОЖЕНИЕ 137
- Биологические свойства возбудителя бешенства
- Материалы и методы исследований
- Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бешенство — зооноз, поражающий центральную нервную систему, приводящий к летальному исходу. Учитывая широкое распространение бешенства и экономический ущерб, наносимый данным заболеванием, разработка и усовершенствование антирабических препаратов остаётся актуальной проблемой.
В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) разработана технология получения антирабической сыворотки крови овец, используемая в изготовлении иммуноферментных и иммунофлуоресцентных препаратов для диагностики бешенства (Бусыгин К.Ф., Юсупов Р.Х, 1983; Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., 1995, 1998, 2000), которые обеспечивают в целом своевременную и точную постановку диагноза. Тем не менее, на современном этапе в связи с неблагополучной ситуацией по этому зоонозу, необходимо дальнейшее усовершенствование диагностических препаратов в плане повышения их активности и чувствительности методов.
В то же время в центре внимания медицинской и ветеринарной службы России остаются вопросы постэкспозиционной антирабической лечебнопрофилактической вакцинации людей, основанной на комбинированном применении антирабического иммуноглобулина (АИГ) и антирабической вакцины.
Как известно, основная функция АИГ, гомологичного или гетерологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития болезни с коротким инкубационным периодом (Селимов М.А., 1978, 1987, 1998). Однако гетерологичный АИГ может вызывать аллергические реакции, а гомологичный - является дорогостоящим. В этой связи, необходим поиск альтернативных специфических и неспецифических препаратов для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства до развития клинических признаков.
Научно-практический интерес представляют работы С В . Грибенча и соавт. (1993, 2006), в которых показана эффективность РНКазы Bacillus intermedius в качестве антирабического препарата при экспериментальном заражении бешенством. В этом отношении определенную ценность представляет также изучение эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens, ингибирующей размножение ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов и применяемой на практике для лечения и профилактики вирусного паралича пчел (Панфилова З.И., Салганик Р.И., 1983; Аликин Ю.С. и др., 1998).
Большой интерес в качестве фактора противовирусного иммунитета представляет интерферон, ингибирующий транскрипцию вирусного генома и трансляцию вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клеткемишени. В связи с этим практический интерес представляет индуктор интерферона - циклоферон, эффективность которого установлена в отношении хламидиоза и ряда вирусных инфекций (Ершов Ф.И. и др., 1998).
В связи с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является усовершенствование средств лабораторной диагностики бешенства, анализ антирабической активности существующих и разработка новых противовирусных препаратов различной природы для экстренной постэкспозиционной защиты от возможного развития рабической инфекции.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Усовершенствовать способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.
2. Изучить эффективность иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец.
3. Получить препарат эндонуклеазы Serratia marcescens.
4. Изучить эффективность и провести сравнительный анализ применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и циклоферона для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства в эксперименте.
Научная новизна. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец, заключающийся в применении полиэтилсилоксана в составе масляного адьюванта вместо неполного адьюванта Фрейнда, позволяющий повысить ее вируснейтрализующую и комплементфиксирующую активность в 4 раза. Впервые установлен защитный эффект антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в экспериментах на белых мышах через 2 ч после заражения эпизоотическим штаммом вируса бешенства (ВБ), составляющий 57%. Впервые установлена антирабическая активность эндонуклеазы S.marcescens в комбинации с MgS0 4 и препаратом «Д» из группы дезинтоксикантов и разработан на их основе препарат «ЭМД», обеспечивающий 31%-ную защиту лабораторных животных при экспериментальном бешенстве. Установлена антирабическая активность циклоферона при внутримышечном трёхкратном введении в дозе 10 мг/кг через
2-, 24- и 48 ч после заражения белых мышей, обеспечивающая 45%-ную защиту.
Практическая ценность. Антирабическая сыворотка крови овец, полученная по усовершенствованному способу иммунизации, повышает эффективность диагностических исследований.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативные документы: Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утверждённую Россельхознадзором 03.03.2008 г.; Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом имму но ферментного анализа (ИФА), утверждённую Россельхознадзором
03.03.2008 г. Указанные диагностические препараты зарегистрированы в РФ за № ПВР-1-4.9/00196 и № ПВР-1-1.9/00261 от 3 марта 2008 г., соответственно, а также сертифицированы ВГНКИ № РОСС БШ.ФВ01.В18715 и РОСС Рчи.ФВ01.В18714, соответственно.
Использование диагностикумов позволяет осуществлять точную и своевременную постановку диагноза и выдачу практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.
Установленная антирабическая активность композиции эндонуклеазы S.marcescens с MgSCU и препаратом «Д», антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», а также циклоферона при экспериментальном бешенстве свидетельствуют о перспективности их применения в качестве дополнительных средств к антирабической вакцине для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства с целью предупреждения развития заболевания.
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
•Усовершенствованный способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.
•Эффективность наборов препаратов для диагностики бешенства, разработанных на основе антирабического глобулина сыворотки крови овец, полученной по усовершенствованному способу иммунизации.
•Сравнительный анализ антирабической активности циклоферона, антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и РНКазы Bacillus intermedins, использованной в качестве стандарта, при экспериментальном бешенстве.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: ежегодных отчетных научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» по итогам НИР за 2005 - 2008 гг.; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007); научнопрактической конференции молодых учёных и специалистов «Достижения молодых учёных - в производство», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина (Казань, 2008); международной научнопрактической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных», посвященной 50-летию института (Покров, 2008).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе одна - в рекомендованном ВАК РФ издании («Учёные записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана»).
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 147 страницах и включает: общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 297 источников, в том числе 109 иностранных и 1 ссылка на сайт internet) и приложение. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками.
Биологические свойства возбудителя бешенства
Возбудитель болезни - РНК-содержащий вирус, относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Семейство Rhabdoviridae включает вирусы, выделенные от позвоночных и беспозвоночных животных, а также растений (FranckiR.LB.etal., 1991).
Среди рабдовирусов позвоночных выделено 2 рода - Lyssavirus и Vesiculovirus. Род Lyssavirus включает вирус бешенства и подобные вирусу бешенства (лиссаподобные) вирусы, которые характеризуются как общностью основных свойств генома вириона, так и общей способностью вызывать энцефалит у позвоночных животных. Кроме того, у всех видов рода Lissavirus обнаружен общий групповой нуклеокапсидный антиген, который ответственен за продуцирование комплементсвязывающих, преципитирующих антител (Вагабов A.M., 1979; Павловский В.В., 1975; Черкасский Б.Л., 1985; Шубладзе А.К. и соавт., 1974; 1975). Установлен генетический полиморфизм гена нуклеопротеина вируса бешенства (Kissi В., 1995).
Вирионы рабдовирусов имеют пуле- или бацилловидную форму, спиральный нуклеокапсид, окруженный белково-липидной оболочкой, с поверхностными выступами. Внутренние спирали имеют от 30 до 35 витков в форме цилиндров - 50 нм в диаметре и 150 нм в длину. Геномом является одноцепоченая РБК с молекулярной массой 3,5-4,6x106 дальтон.
Вирионы содержат также РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вирус имеет плавучую плотность в CsCl-1,32 г/см . Очищенные рабические вирионы содержат 2-3% РНК, 3% углеводов, 23% липидов и более 70% белка. В составе вириона выявлены 4 мажорных и 1 минорный белковый компонент. Полипептид с самой высокой относительной молекулярной массой (отн. мол. масса 80000, 1783 молекул на вирион) оказался гликопротеином (G), образующим шипы внешней оболочки. Он ответственен за продукцию вируснейтрализующих антител, антигемагглютининов и за формирование иммунитета к заражению вирусом бешенства.
На основе различий гликопротеидного компонента, выявляемый в реакции нейтрализации, в группе вируса бешенства выделяют 7 генотипов. К 1-ому генотипу относят абсолютное большинство уличных и фиксированных штаммов из различных частей света, в том числе и классический стандартный -С VS. Лиссаподобные вирусы остальных генотипов выделены первоначально на Африканском континенте от летучих мышей - Lagos bat вирус (2-й генотип), от землеройки и человека — Mokola вирус (3-й генотип), также человека и летучей мыши Duvenhage (4-й генотип). Позднее вирус Duvenhage был выделен на территории ФРГ и России (Селимов М.А., 1987). К 5 и 6 генотипам относят вирусы европейских летучих мышей (EBL 1, EBL 2) (Пилле Э.Р., 1996). К 7 генотипу относят вирус австралийских летучих мышей (ABLV) (www.who. rabies - bulletin.org.).
Биологические свойства вируса бешенства подвержены естественной изменчивости. Установлено несколько биологических вариантов уличного вируса. Имеют определенные особенности штаммы вируса, выделяемые при арктическом бешенстве («диковании») животных, «болезни безумной собаки» в Западной Африке, при бешенстве крупного рогатого скота, распространяемом летучими мышами в Центральной и Южной Америке и передающими скоту паралитическую форму болезни. Отклоняются от классических и биологические свойства «лисьего бешенства», а также выделенных от мышевидных грызунов в центральной Европе, лиссаподобных вирусов, выделенных от землеройки, летучих мышей и насекомых в Африке (Селимов М.А., 1978;ГрибенчаС.В., 1993).
Антигенные различия между штаммами вируса бешенства и родственными вирусами изучают с помощью полной и сокращенной панели антинуклеокапсидных (анти-НК) и антигликопротеиновых (анти-ГП) МКА (Селимов М.А. и соавт, 1982, 1983; Хисматуллина Н.А., 1989; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1990, 1998; Wiktor T.J. et al., 1980). М.А. Селимовым и соавт. (1987, 1990) изучена антигенная характеристика полевых штаммов вируса бешенства, выделенных от животных и людей из различных районов бывшего СССР с помощью набора из 36 антинуклеокапсидных моноклональных антител. На основании анализа результатов исследований авторы делают заключение, что циркулирующие на территории нашей страны штаммы вируса бешенства по нуклеокапсидной структуре неоднородны и принадлежат штамму классического вируса, серотип 1. Вирус Юли, выделенный от человека, покусанного летучей мышью, идентифицирован как лиссаподобный вирус типа Duvenhage, серотип 4. Это первое обнаружение лиссаподобного вируса на территории России (Ботвинкин А.Д., 1990; Selimov М., 1987).
В последующем было обнаружено еще два, выделенные на территории Западной Украины (Selimov М.А., 1991). Другой штамм Араван, выделеннный от летучей мыши в Кыргызстане, оказался лиссавирусом с оригинальным антигенным профилем, не имеющим аналогов среди известных серотипов (Ботвинкин А.Д., 1992; Кузьмин И.В. и соавт., 1992).
Материалы и методы исследований
1. В опытах применяли 2 штамма вируса бешенства: производственный фиксированный - «Овечий» ГНКИ (линия штамма Pasteur) и стандартный -CVS.
2. В работе использовали животных: овец, живой массой 40-50 кг, 5 гол.; морских свинок 0,3-0,35 кг, 100 гол.; белых крыс 0,3 кг, 50 гол.; белых мышей -беспородных, живой массой 6-7 г, 1000 гол.; живой массой 10 г, 200 гол; линии BALB/c 14-16 г, 2000 гол, а также перевиваемую культуру клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1).
При иммунизации овец применяли неполный адъювант Фрейнда (НПО «Реокомплекс», г. Чита), кремнеорганическую жидкость- полиэтилсилоксан (ОАО «Силан», г. Липецк ) в составе масляного адъюванта, а также декстран-сульфат, м.м.500000 у.е. («AppliChem», Германия).
3. В работе применяли следующие химические реактивы: аммоний сернокислый, ацетон, гидроксид натрия, глицерин, лимонную кислоту, спирт этиловый ректификованный 96%, твин-20 («Ferak», Берлин), трис (гидроксиметил) аминометан, фенол, формалин, хлороформ, эфир, хлорную кислоту, магний сернокислый, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК) нативные, ДНКазу панкреатическую (завод Медицинской техники, г. Санкт-Петербург), бычий сывороточный альбумин («Реанал», Венгрия), препарат «Д» из группы дезинтоксикантов (ОАО
«Биосинтез», г. Пенза), сернокислый магний, сефадекс G 25(coarse) («Pharmaceae», Швеция) и др.
4. В качестве исследуемого материала использовали 106 проб патологоанатомического материала (головной мозг, подчелюстные слюнные железы), доставленного из неблагополучных по заболеваемости бешенством районов Республики Татарстан, из них 6 - от сельскохозяйственных, 7- от домашних животных, 32 - от лисиц, 1 - от рыси, 60 - от мышевидных грызунов. В опытах исследовали также 370 образцов сывороток крови иммунизированных овец и вакцинированных белых мышей. Контролем в опытах служили суспензии и отпечатки головного мозга интактных белых мышей (контрольный отрицательный антиген), а также иммуноглобулины (Ig) сывороток крови неиммунизированных животных. В качестве контрольного положительного антигена использовали мозг белых мышей, зараженных ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в качестве гетерологичного антигена - мозг мышей, зараженных вирусом болезни Ауески, штамм ВГНКИ, а также контрольный флуоресцирующий глобулин.
Образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга на 0,85%-ном растворе NaCl с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, инактивировали при 56 С в течение 30 минут.
5. В опытах по изучению антирабического действия препаратов при экспериментальном заражении бешенством использовали антирабический глобулин сыворотки крови овец, иммунизированных антигеном вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань), коммерческий антирабический иммуноглобулин (ЗАО «Биолек», г. Харьков) с активностью 205 МЕ/мл, отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки ВГНКИ с активностью 20 МЕ/мл, (ВГНКИ, г. Москва), эндонуклеазу S.marcescens (изоформа Sml), любезно предоставленную д.б.н. Филимоновой М.Н. и 12,5 % циклоферон в ампулах по 2 мл («Полисан», г. Санкт-Петербург). В качестве контрольных препаратов применяли РНКазу B.intermedius (экспериментальный завод Института органического синтеза, Латвия) и культуральную антирабическую вакцину «Рабикан» из штамма «Щелково-51» (Щелковский биокомбинат).
6. В экспериментах применяли диагностические наборы препаратов, разработанные в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»: «Флуоресцирующий антирабический глобулин» (ТУ 9388-027-00492374-2007) и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ТУ 9388 - 025 - 00492374 - 2007), а также антитела диагностические против Ig G (H+L) барана и лошади, меченные.пероксидазой (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва).
Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов
Целью исследований явилось усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец, обладающей высокой серологической и вируснейтрализующей активностью.
В качестве иммунизирующего антигена использовали очищенный и концентрированный антиген вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, в виде суспензии мозга зараженных овец. С целью частичной очистки и концентрирования вирус подвергали ультрацентрифугированию (УЦФ) при 4700 g в течение 60 мин и осадок ресуспендировали 0,01 М ФБР, рН 7,4-7,6, в 0,1 первоначального объема.
Определение инфекционного титра вируссодержащей взвеси до и после УЦФ на белых мышах показало, что до УЦФ титр вируса был равен 103 84 LD50 /мл, а после УЦФ - 105 51-1)5о/мл. При этом содержание белка в вируссодержащей взвеси составило 6 мг/мл, а после УЦФ - 2,7 мг/мл, то есть произошла частичная очистка вируссодержащей взвеси от белка при одновременном повышении инфекционного титра вируса.
Иммунизирующий антиген вируса бешенства соединяли с масляным адъювантом, в состав которого входила кремнеорганическая жидкость -полиэтилсилоксан (ПЭС-3). Прототипом ПЭС-3 служил неполный адъювант Фрейнда (НАФ), используемый в настоящее время для получения антирабической сыворотки, аналогом - декстран-сульфат (м.м.500000 у.е.) в концентрации - 2%.
Сформировали три группы овец, по 3 головы в каждой. Животных иммунизировали внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра обеих конечностей. Животным первой группы вводили смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с масляным адъювантом, в состав которого входил ПЭС-3. Овцам второй группы вводили смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с НАФ. Животным третьей группы вводили подкожно смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с декстран-сульфатом (м.м.500000 у.е.) в концентрации - 2%. Уровень специфических антител определяли в РН, ИФА и РДСК. В результате исследований установлено максимальное накопление специфических антител через месяц после иммунизации, активность которых составила в РДСК 1:160-1:640, в непрямом ИФА - 1:3200-1:12800 и РН - 1:200-1:800. Титры антител сохранялись в течение 5-10 месяцев (срок наблюдения). Результаты исследований представлены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 видно, что более выраженная стимуляция антителогенеза происходит при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с масляным и ПЭС-3. Уровень специфических антител в 4 раза превосходит таковой при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с НАФ и в 2 раза - по сравнению с декстран-сульфатом.
Таким образом, усовершенствован способ получения антирабической сыворотки крови овец, заключающийся в применении в составе масляного адьюванта кремнеорганической жидкости - ПЭС-3 при иммунизации овец вирусом бешенства, позволяющий повысить ее вируснейтрализующую активность в 4 раза по сравнению с прототипом (НАФ) и в 2 раза по сравнению с аналогом (декстран-сульфат).
Из активной антирабической сыворотки крови овец выделяли глобулиновую фракцию путем двукратного осаждения 50%-ным раствором сульфата аммония. Провели сравнительную оценку вируснейтрализующей активности антирабического глобулина из сыворотки крови овец («ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань) и коммерческого антирабического иммуноглобулина сыворотки крови лошади (ЗАО «Биолек», г. Харьков), применяемого в медицинской практике РФ.
Для нейтрализации антирабического глобулина использовали стандартный вирус бешенства CVS в дозе 300 LDso- Результаты исследований представлены в таблице 2.
Из данных таблицы 2 следует преимущество антирабического глобулина сыворотки крови овец производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» перед коммерческим антирабическим иммуноглобулином, заключающееся в двукратном превышении вируснейтрализующей активности. Так, активность их в РН составила 420 ME/ мл и 205 МЕ/мл, а в ИФА - 1:12800 и 1:6400, соответственно.
