Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Иммунная система крупного рогатого скота: структурная и функциональная характеристика 10
2.2. Иммуноглобулины крупного рогатого скота 17
2.3. Изотипы иммуноглобулинов: функциональные свойства 22
2.4. Пассивная передача иммунитета 24
2.5. Количественные методы определения иммуноглобулинов 30
2.5.1. Методы, основанные на реакции преципитации 30
2.5.2. Методы, основанные на использовании меченых антител или антигенов 32
2.6. Количественная характеристика иммуноглобулинов крупного рогатого скота 40
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Иммунологические реагенты 46
3.2. Испытуемые пробы биологического материала 46
3.3. Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) 47
3.4. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД) 48
3.5. Методы иммуноферментного анализа 48
3.6. Электрофорез в ПААГ-ДСН 51
3.7. Иммуноблоттинг 52
3.8. Синтез иммунопероксидазных конъюгатов 53
3.9. Статистическая обработка результатов 53
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Разработка «сэндвич»-ИФА на основе моноклональных антител для ко личественного определения IgA крупного рогатого скота 56
4.1.1. Иммунологические реагенты, предназначенные для использования в «сэндвич»-ИФА 57
4.1.2. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgA крупного рогатого скота 58
4.1.3. Разработка «сэндвич»-ИФА на основе моноклональных антител к IgA крупного рогатого скота 64
4.2. Разработка РИД на основе моноклональных антител для количественно го определения IgA крупного рогатого скота 71
4.3. Сравнительная оценка эффективности «сэндвич»-ИФА и РИД по определению уровня IgA в биологических жидкостях крупного рогатого скота 75
4.4. Количественная характеристика иммуноглобулинов G-, М- и А-изотипов в биологических жидкостях коров 82
4.5.Возрастная динамика иммуноглобулинов у телят 85
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
6. ВЫВОДЫ 95
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 97
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 98
- Иммуноглобулины крупного рогатого скота
- Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД)
- Иммунологические реагенты, предназначенные для использования в «сэндвич»-ИФА
Введение к работе
Актуальность темы. Всестороннее исследование иммуноглобулинов, одного из важнейших факторов иммунитета, представляет пристальный интерес для иммунологов и клиницистов. Он связан с тем, что особенностями свойств отдельных изотипов иммуноглобулинов объясняется характер взаимодействия антител с антигеном и способ элиминации последнего, а также характер патофизиологических реакций организма в случае иммунологического конфликта (Д.В.Стефани, 1975). Клинические и биологические аспекты исследования иммуноглобулинов животных многообразны, их определение имеет крайне важное значение для оценки иммунного статуса организма, диагностики иммунодефицитных состояний. Важнейшим условием для развертывания широкого фронта работ по количественному определению уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма является создание простых, доступных и информативных лабораторных методов исследования. Определение уровня иммуноглобулинов в различных биологических жидкостях организма животных проводится многими исследователями в течение ряда лет (Р.В.Боровик, 1978; П.А.Емельяненко, 1982; В.М. Чеки-шев, 1984; Ю.Н.Федоров, 1985; А.Б.Маркунас, 1988; Р.Х.Кармолиев, 1988; Ю.К.Пешкус, 1991; М.Д.Смердова, 2000; P.Porter, 1971; K.Bourne, 1971; J.P. Mach, JJ.Pahud, 1971; J.R.Duncan et al., 1972; J.Butler, 1974, 1983; M.R. Williams et al., 1975, 1990; D.Levieux, A.Olliver, 1999). Однако до настоящего времени существуют расхождения в полученных данных различными авторами. Эти различия в количественной характеристике обусловлены отсутствием стандартных методик получения биологических жидкостей для исследования и тем, что для иммунологического анализа биологических жидкостей различные авторы используют разные по чувствительности и специфичности методы: турбодиметрический, радиальную иммунодиффузию и иммуноферментный анализ. В последние годы периферическая кровь остается основной биологической жидкостью для иммунологического исследо-
вания, иммуноглобулиновый состав ряда секретов остается мало изученным, нет единого мнения о месте синтеза иммуноглобулинов, выявляемых в них. Изучение секреторных иммуноглобулинов представляет не только теоретический интерес, но чрезвычайно актуально и для клиницистов, поскольку, как показывают наблюдения последних лет, состояние секреторной иммунной системы в значительной мере определяет частоту и характер течения заболеваний респираторного и желудочно-кишечного тракта. Поэтому изучение системы местного иммунитета является весьма актуальным и стоит в ряду проблем теоретической и клинической иммунологии наиболее интенсивно разрабатываемых в последнее время. Однако, к настоящему времени среди не до конца решенных, остаются такие вопросы, как становление секреторной иммунной системы в онтогенезе, наличие иммунной памяти местного иммунитета, особенности иммунобиологических свойств секреторного IgA, а также иммуноглобулиновый профиль различных секретов организма крупного рогатого скота. Сдерживающим фактором в проведении исследований в этих направлениях является отсутствие коммерческих сывороток против секреторного IgA и соответствующих тест-систем для выявления иммуноглобулинов этого изотипа во внешних секретах организма крупного рогатого скота. Поэтому вопросы, связанные с разработкой и совершенствованием методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител, также как и с их использованием для изучения функционирования иммунной системы крупного рогатого скота, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес как в научном, так и в практическом аспектах.
Цель исследования состояла в разработке тест-систем на основе методов иммунохимического анализа (РИД и ИФА) и изучении иммуноглобу-линового профиля различных биологических жидкостей крупного рогатого скота для определения информативности показателей уровня иммуноглобулинов при оценке иммунного статуса.
Задачи исследования:
Методами физико-химического и иммунохимического анализа охарактеризовать моноклональные антитела к IgA крупного рогатого скота.
Разработать чувствительную и специфичную тест-систему на основе ИФА с использованием моноклональных антител («сэндвич»-вариант) для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов А-изотипа в различных биологических жидкостях крупного рогатого скота (молозиво, молоко, носовой секрет, слезная жидкость). Оптимизировать условия проведения и учета результатов ИФА.
3. Определить показатели нормальных значений иммуноглобулинов
для таких биологических жидкостей крупного рогатого скота, как сыворотка
крови, молозиво, молоко, слезная жидкость и носовые секреты.
Провести сравнительное изучение диагностической ценности имму-нохимических методов исследования (РИД и ИФА) при оценке иммунного статуса коров после отела и полученных от них телят после рождения.
Изучить возрастную динамику становления местного иммунитета у телят в раннем постнатальном онтогенезе.
Научная новизна и теоретическое значение исследования. Дана физико-химическая и иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgA крупного рогатого скота и на их основе разработаны специфичные методы: «сэндвич»-вариант твердофазного ИФА и РИД для выявления иммуноглобулинов А-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Определены значения иммуноглобулинов G-, М- и А-изотипов в сыворотке крови, носовом секрете, слезной жидкости, молозиве и молоке коров, а также в сыворотке крови, слезной жидкости и носовом секрете у телят. Установлено, что высокая чувствительность метода ИФА позволяет количественно определять уровень IgA в пробах с низким его содержанием. Впервые проведены сравнительные исследования по изучению иммунного статуса коров после отела и полученных от них телят после рождения, уста-
новлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью РИД и ИФА. Получены новые данные и подтверждены некоторые закономерности о становлении секреторной иммунной системы у телят в раннем постнатальном онтогенезе.
Практическая значимость. Показана высокая информативность и целесообразность использования иммуноглобулинового анализа биологических жидкостей для оценки иммунного статуса животных, состояния системного и местного иммунитета. Определены границы нормальных значений иммуноглобулинов в секретах крупного рогатого скота с помощью им-муноферментного анализа. Разработан «сэндвич»-вариант ИФА и РИД на основе моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов А-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Количественное определение уровня slgA в молозиве, молоке, носовых и слезных секретах является основой оценки напряженности иммунитета слизистых и колострального иммунитета у телят. Полученные результаты составляют методическую основу дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования иммунитета у крупного рогатого скота.
Результаты исследований вошли в методические рекомендации: «Количественное определение иммуноглобулинов в биологических жидкостях иммуноферментным методом», утвержденные Ученым советом ВИЭВ (Москва, 2001 г.) и «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН (Новосибирск, 2003).
Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
- результаты экспериментальных исследований по иммунохимической характеристике моноклональных антител к IgA крупного рогатого скота и
разработка на их основе «сэндвич»-ИФА и РИД для определения уровня иммуноглобулинов А-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота;
- результаты сравнительных исследований по изучению количественной характеристики и динамики содержания иммуноглобулинов отдельных изотипов в биологических жидкостях у коров после отела (сыворотка крови, молозиво, молоко, носовые секреты, слезная жидкость) и у телят после рождения (сыворотка крови, носовые секреты, слезная жидкость).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийских научно-практических конференциях (Щелково, 2000; Омск, 2004), Ученом совете ВИЭВ (2002), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 12 таблицами и 4 рисунками. Список литературы включает 205 источников (64 отечественных и 141 зарубежных).
Иммуноглобулины крупного рогатого скота
Номенклатура иммуноглобулинов крупного рогатого скота определена комитетом по номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (1978). Иммуноглобулины представляют собой группу гликопротеинов, которые содержатся в плазме крови и в тканевой жидкости у всех млекопитающих (Р.В. Петров, 1982; А.М.Егоров и др., 1991; А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл, 2000). Некоторые молекулы иммуноглобулинов структурно связаны с плазматической мембраной В-клеток и функционируют как антигенспеци-фические рецепторы. Другие (антитела) присутствуют в плазме и в лимфе как свободные молекулы. Они могут быть мономерами или полимерами. Мономер состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких цепей (L), соединенных дисульфидными мостиками и нековалентными связями. Дисульфидные связи образуются между двумя аминокислотными остатками цистеина. Каждая легкая и тяжелая полипептидная цепь имеет один конец со свободной —NH2 группой (N - концевым участком) и другой конец цепи со свободной -СООН группой (С - концевым участком) (K.M.Moriarty, 1984, А.М.Егоров и др., 1991; А.Ройт и др.,2000; В.Г. Галактионов,2000).
Различные изотипы иммуноглобулинов, идентифицированные у крупного рогатого скота, представлены в таблице 1: имеются четыре класса (IgG, IgM, IgA, IgE), три субкласса IgG (IgGl, IgG2,IgG3) и два типа легких цепей (X, и к). В отличие от приматов и грызунов, у крупного рогатого скота большинство (около 90%) легких цепей относится к Х-типу. (L.Hood et al., 1967; J.Butler, 1997; R.Aitken et al., 1999).
Получение моноклональных антител к различным изотипам иммуноглобулинов крупного рогатого скота позволило провести изотип-специфиче-ские исследования (S.Srikurman et al.,1981; D.van Zaane, J.Ijzerman, 1984; J.J.Letesson et al., 1985; R.A.Goldsby et al.,1987; J.Naessens, D.J.L. Williams, 1992; J.Naessens, 1997). В литературе нет данных об обнаружении у крупного рогатого скота иммуноглобулинов D-изотипа (J.Naessens, D.J.L.Williams, 1992; J.Naessens, 1997). IgM крупного рогатого скота существует в пентамерной форме и состоит из пяти мономеров, каждый из которых включает четыре полипептидные цепи (две ц, Н-цепи и две L-цепи). Мономеры объединены в единую молекулу дисульфидными связями и J-цепью, которая требуется для корректировки пентамерной структуры. цН-цепи крупного рогатого скота имеют более высокую Мг чем JJ, Н-цепи человека или мыши, поэтому молекулярная масса IgM у крупного рогатого скота больше, имеются доказательства полиморфизма IgM (J.Naessens et al., 1988; D.J.L. Williams et al.,1990, А.М.Егоров идр.,1991).
Из трех основных изотипов иммуноглобулинов, которые обусловливают местную защиту органов и тканей, находящихся в тесном контакте с внешней средой, наибольшую роль играет IgA. Это главный класс иммуноглобулинов серозно-слизистых секретов, таких как слюна, молозиво и молоко, а также выделений слизистых оболочек дыхательных и моче-половых путей. IgA встречается в сыворотке крупного рогатого скота преимущественно в форме димера. Структурными особенностями IgA является наличие в его молекуле J-цепи и секреторного компонента - СК. Наличие J-цепи, синтезируемой плазматическими клетками, является необходимым фактором формирования полимерных молекул slgA. СК может существовать в свободной или в связанной с полимерным иммуноглобулином (plgA) форме (J.E.Butler, 1986). Он состоит из нескольких родственных в антигенном отношении полипептидов и экспрессируется на поверхности эпителиальных клеток. СК ответственен за связывание и перемещение plgA через эпителиальные клетки слизистых и железистых тканей, в количественном отношении он составляет 4-6% от всей молекулы. При специфическом взаимодействии димера (IgA)2-J с секреторным компонентом на клеточной поверхности образуется комплекс, который после эндоцитоза перемещается в цитоплазме к апикальной части клетки. Здесь комплекс подвергается действию протеолитиче-ских ферментов, что позволяет ему высвобождаться в секрет субэпителиального пространства (J.E.Butler, 1986). Секреторный IgA (slgA) крупного рога того скота был выделен из экзокринных секретов и имеет Мг 420-550 10 в 3 степени, он синтезируется только плазмоцитами слизистых оболочек и железистых органов и обладает рядом важных свойств, от которых зависит его способность защищать слизистые оболочки от чужеродных агентов антигенной природы: высокой устойчивостью к протеазам, что делает возможным его функционирование в секретах слизистых оболочек; неспособностью связывать компоненты комплемента, что ведет к отсутствию повреждающего действия комплекса антиген-антитело на слизистые; способностью препятствовать адгезии микроорганизмов, их токсинов, пищевых и бактериальных аллергенов на эпителий слизистых оболочек, что блокирует их проникновение во внутреннюю среду организма (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин,1997; Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, И.В. Слугин, 2000).
slgA обнаруживается в" большинстве секретов крупного рогатого скота: в носовом секрете он составляет 97%, в слюне - 92%, в слезной жидкости-86% от общего количества иммуноглобулинов (J.P.Mach, JJ.Pahud,1971). Он выявляется в секретах пищеварительного тракта, дыхательной системы, молозиве, молоке, желче, лимфе и других секретах организма. В онтогенезе продукция иммуноглобулинов этого изотипа у телят начинается с двухнедельного возраста (TJ.Newby, F J.Bourne,1976).
С.А.Понкратов (1992) выделил свободный секреторный компонент иммуноглобулинов из молока коров, получил моноспецифическую антисыворотку и определил его содержание в молозиве и молоке клинически здоровых коров, которое составило 128 и 271 мкг/мл соответственно.
В анализе защитной роли секреторного иммуноглобулина А важное место занимает взаимодействие этих белков с другими защитными факторами. Следует особо подчеркнуть взаимодействие их с секретируемыми местно иммуноглобулинами G- и М-изотипов, а также с лизоцимом и пропердином. В оценке защитной роли slgA у животных имеются важные противоречия, ряд вопросов ждут своего выяснения. Имея в виду большое значение этого изотипа иммуноглобулинов в механизмах местной защиты, необходимо провести исследования по изучению иммуноглобулинового состава ряда экстра-васкулярных секретов. Нет единого мнения о месте синтеза иммуноглобулинов, выявляемых в различных биологических жидкостях.
IgE крупного рогатого скота представляет собой мономер, включающий две тяжелые цепи (є-цепи) и две легкие (х- или Этапов). Содержание IgE в сыворотке крайне мало, хотя удельный вес этих иммуноглобулинов в аллергических реакциях является доминирующим. Функциональная активность IgE проявляется в развитии аллергических реакций. Данный иммуноглобулин взаимодействует с тучными клетками и базофилами посредством Fc-об-ласти и соответствующего рецептора на этих клетках.
Среди всех классов иммуноглобулинов в количественном отношении доминирует IgG. В сыворотке млекопитающих он составляет около 75% от общего количества иммуноглобулинов (В.Г.Галактионов,2000). Биологическая роль IgG разнообразна. Это: и антибактериальная защита через механизм комплементзависимого лизиса микробной клетки, и «армирование» макрофагов (цитофильность к макрофагам), в результате чего они становятся цитотоксическими для трансплантатов и опухолей, и участие в повышенной реактивности аллергического типа (В.Г.Галактионов,2000). IgGl и IgG2 впервые были идентифицированы серологическими методами. Иммуноглобулины этих субизотипов проявляют различную чувствительность к протео-литическим ферментам. Так IgGl более чувствителен к пепсину и более резистентен к трипсину, чем IgG2. При воздействии на смесь IgGl и IgG2 крупного рогатого скота пепсином в течение 30 минут, молекула IgGl расщепилась на F(ab)2- и Fc- фрагменты, при этом большинство IgG2 осталось. При сравнении yl и у2 последовательностей установлены большие различия в шарнирной области — Сн2 регионе (D.B.A.Symons et al., 1989). Это может объяснить различную способность двух подклассов IgG в связывании по средством Fc- рецептора с соответствующими рецепторами эпителиальных клеток молочной железы и, следовательно, транспортировкой в молозиво. 2.3. Изотипы Ig: функциональные свойства. Эффекторные функции иммуноглобулинов ассоциированы с наличием или отсутствием у них места рецепторного связывания на Fc-фрагменте их молекулы. Комбинация Ун-сегмента с различными Сн-областями делает возможным рекомбинацию антигенсвязывающей активности с различными иммунологическими функциями: связывание комплемента, Fc-рецепторное связывание, а также распределение Ig в различных биологических жидкостях с учетом прохождения через эпителиальные клетки слизистых после связывания с рецептором pig (Р.В.Петров,1982;1987; А.Ройт и др., 2000; В.Г.Галактионов, 2000).
Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД)
Антигены. В качестве стандартных антигенов при проведении РИД и ИФА использовали иммунохимически чистые препараты IgG, IgM, IgA, slgA крупного рогатого скота и сыворотку крови крупного рогатого скота с известным содержанием иммуноглобулинов каждого изотипа.
Определение концентрации белка в препаратах иммуноглобулинов проводили по методу O.H.Lowry (1951). Для построения калибровочной кривой использовали в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Serva, Германия).
Поликлональные антисыворотки и моноклональные антитела. В исследованиях использовали моноспецифическую антисыворотку к IgG, моноспецифическую антисыворотку к IgA, моноклональные антитела G9 к IgM и моноклональные антитела к IgA крупного рогатого скота, секретируемые 7 независимыми клонами гибридом.
Все используемые в экспериментах антигены и антитела были ранее получены и охарактеризованы в лаборатории иммунологии ВИЭВ. 3.2. Испытуемые пробы биологического материала
Биологический материал для исследований (кровь, молозиво, молоко, носовые и слезные секреты) был получен от клинически здоровых коров черно-пестрой породы 3-4 лактации (п=28) в динамике через 1,3, 10, 20, 30, 40, 60 суток после отела и полученных от них телят (п=20) в динамике через 1, 3, 10, 20, 30, 40, 60 суток после рождения, принадлежащих учебному хозяйству Коломенского агроколледжа Московской области. Всего было получено и исследовано 1204 пробы (784 пробы от коров и 420 - от телят).
Сыворотку крови, молозива и молока получали традиционными способами и хранили при -20С. При этом пробы молозива и молока отбирали из каждой четверти вымени в равных объемах и затем объединяли для получения средней пробы. Носовые секреты получали путем введения в каждый носовой проход стерильных ватных тампонов с последующим их отжатием с помощью шприца и объединением для получения средней пробы. Слезную жидкость получали из конъюнктивального мешка каждого глаза с помощью глазной пипетки, собранную жидкость объединяли в одну пробу. Для получения объективных данных пробы в исследованиях использовали в исходном виде без предварительного разведения.
Была использована для определения преципитирующей способности моноклональных антител к IgA крупного рогатого скота.
Для постановки РДП использовали 1% гель агарозы на 0,01 М борат-ном буфере, рН 8,6. Расплавленную агарозу заливали слоем 2-3 мм в чашки Петри, расположенные строго горизонтально и после полимеризации штампом вырезали лунки. Периферические лунки заполняли моноклональными антителами в разведении 1:2- 1:64. В центральную лунку вносили антиген и помещали во влажную камеру.
Результаты реакции оценивали через 24- 48 час. по наличию линий преципитации. За титр принимали последнее разведение испытуемых антител, дающее видимый преципитат по отношению к гомологичному антигену и выражали в преципитирующих единицах от 1 до 64 . 3.4. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД)
Количественное определение содержания IgG, IgM и IgA в испытуемых пробах проводили методом РИД по Манчини (G.Manchini et al.,1965). В исследованиях использовали моноспецифическую антисыворотку к IgG, моноспецифическую антисыворотку к IgA, моноклональные антитела G9 к IgM и МкА к IgA крупного рогатого скота.
При постановке РИД поли- или моноклональные антитела диспергировали в агаровый гель (1,2% агароза на 0,05 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6), смесь наносили на стекло и в застывшем агаре вырезали лунки, в которые вносили испытуемые пробы биологического материала. Наряду с исследуемым материалом в другие лунки вносили раствор соответствующего Ig с известной концентрацией. Пластины инкубировали в течение 24- 48 часов во влажной камере при комнатной температуре, затем отмывали в физиологическом растворе, высушивали при 37С и окрашивали 0,1% амидо-черным 10В.
Количество Ig определяли по измерению диаметра кольца преципитации испытуемых образцов относительно калибровочной (стандартной) кривой, построенной с использованием стандарта. В качестве стандартов использовались иммунохимически чистые иммуноглобулины каждого изотипа или сыворотка крови крупного рогатого скота с известным содержанием в ней иммуноглобулинов каждого изотипа.
Для проведения экспериментальных исследований нами были разработаны и использованы все основные варианты твердофазного ИФА: прямой, непрямой, конкурентный и «сэндвич».
Общие принципы постановки реакции
Во всех случаях использовались плоскодонные полистироловые 96-луночные микропанели для ИФА (Nunc, Дания). При постановке всех вариантов ИФА антигены (или антитела) сорбировали на микропанелях в 0,02 М К-карбонатном буфере, рН 9,6. Все стадии реакции сопровождались трехкратной отмывкой ФБ (0,01 М фосфатно-буферный раствор, 170 mM NaCl, рН 7,2- 7,4), содержащим 0,05% твин-20 (ФБТ) и проточной водой. ФБТ был также использован для разведения испытуемых проб. Несвязавшие белок участки пластика, блокировали, внося в каждую лунку по 100 мкл ФБТ, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (ФБТ- БСА). Этот же буфер был выбран для разведения меченных МкА (конъюгатов). В качестве субстратной смеси во всех случаях использовался 0,02% о-фенилендиамин (ОФД) в 0,3 М цитратном буфере, рН 4,7, содержащем 0,01% перекиси водорода. Реакцию останавливали через 10 минут, добавлением в лунки по 50 мкл 5 N Н2 SO4. Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра «Multiskan МСС/340» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 492 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492). Прямой ИФА
Метод использовался для определения активности и специфичности иммунопероксидазных конъюгатов на основе МкА.
Для проведения ИФА в лунки 96-луночных полистироловых микропанелей вносили по 100 мкл растворов антигенов (очищенные иммуноглобулины в концентрации 10 мкг/мл) и инертного белка (2% БСА). Микропанели инкубировали в течение 18 часов при 4С, затем после промывки вносили в лунки последовательные разведения МкА, меченые пероксидазой, и инкубировали 1,5 часа при 37С при легком встряхивании на шейкере. За титр (рабочее разведение) принимали последнее разведение конъюгата, ОП 492 которого составляла 1,0.
Метод был использован для определения специфичности и перекрестной реактивности моноклональных антител.
Для проведения ИФА в лунки микропанелей вносили растворы IgG, IgM и IgA крупного рогатого скота в концентрации 10 мкг/мл и инкубиро вали в течение 18 ч при 4С. Тестируемые МкА в последовательных разведениях, начиная с 1:100, вносили в лунки сенсибилизированных микропанелей по 100 мкл и инкубировали 2 часа при 37С. После отмывки добавляли в лунки по 100 мкл конъюгата (антитела к IgG мыши, меченные пероксидазои) в разведении 1:5000 и инкубировали в течение 1,5 час. при 37С. Лунки трижды отмывали и вносили субстратную смесь, как описано выше. Рабочий титр антител в исследуемых препаратах оценивали как конечное разведение, превышающее ОП 492 равное 1,0.
Иммунологические реагенты, предназначенные для использования в «сэндвич»-ИФА
Для разработки методов, направленных на обнаружение антигена в биологических жидкостях организма животных, необходим детальный анализ активности и иммунологической специфичности моноклональных антител. При этом иммунохимическая характеристика МкА должна быть определена с использованием тест-систем, адекватных разрабатываемому методу. Поэтому целью данного раздела работы было определение активности и специфичности всех, имеющихся в нашем распоряжении семи МкА к IgA крупного рогатого скота. Исследования проводили в четыре этапа, причем два первых были направлены на определение антигенной активности и специфичности МкА, третий и четвертый - эпитопной:
1) подтверждали активность и специфичность моноклональных антител методом непрямого ИФА;
2) определяли активность конъюгированных МкА методом прямого ИФА;
3) определяли локализацию и структуру эпитопов молекулы IgA, с которыми взаимодействуют МкА методом иммуноблоттинга;
4) с помощью нативных и конъюгированных МкА проводили эпитоп-ный анализ молекулы IgA методом конкурентного ИФА.
При постановке непрямого твердофазного ИФА использовали очищенный препарат IgA крупного рогатого скота с концентрацией в сорбирующем буфере 10 мкг/мл. МкА, предварительно выделенные из асцитов двукратным переосаждением полунасыщенным раствором сульфата аммония и растворенные в ФБ, титровали методом двукратных разведений, начиная с разведения 1:100. Одновременно определяли перекрестные взаимодействия исследуемых антител с иммуноглобулинами других изотипов. Для этого, каждый препарат МкА титровали на трех микропанелях, сенсибилизированных IgG, IgM и IgA крупного рогатого скота в аналогичных концентрациях (10 мкг/мл). За титр принимали последнее разведение МкА, показатель ОП 492 которого был 1,0.
Далее все 7 МкА были конъюгированы с пероксидазой хрена (ПХ) перйодатным методом, при котором ПХ на первой стадии реактивируется перйодатом натрия, а затем в щелочной среде связывается с аминогруппами IgA в виде шиффовых оснований.
Активность полученных конъюгатов определяли методом прямого ИФА при двукратном титровании на микропанелях с иммобилизованным IgA и БСА (см. раздел Материалы и методы). Рабочим считали конечное разведение конъюгата, ОП 492 которого в лунке со специфическим антигеном (IgA) составляла 1,0, а в лунке с инертным белком (БСА) - 0,15.
Локализация и структура эпитопов, находящихся как на полипептидных цепях, так и на нативной молекуле IgA, была установлена в иммуноб-лоттинге после электрофореза в ПААГ-ДСН в «плюс - минус» варианте. Постановку реакции и учет полученных результатов осуществляли, как описано в разделе «Материалы и методы». Характеристика активности и иммунологической специфичности МкА к IgA крупного рогатого скота, любезно предоставленных в наше распоряжение, представлена в таблице 6.
Таблица 6. Характеристика моноклоналъных антител к IgA крупного рогатого скота.
Код МкА Изотип Ig мыши Титр МкА Эпитоп молекулыIgA, распознаваемыйв иммуноблоттинге Титр конъюгиро-ванных МкА
1Е8 IgG2b 1:12800 линейный 1:1000
6В8 IgG2a 1:12800 конформационный 1:1000
1А4 IgG2b 1:6400 конформационный 1:1000
2G1 IgGl 1:1600 конформационный 0
2F8 IgG2b 1:1600 конформационный 0
3F3 IgG2b 1:800 конформационный 0
6С5 IgGl 1:800 конформационный 0
П римечание результаты были получены ранее к.б.н.Т.А.Феоктистовой
Как видно из данных, приведенных в таблице 6, титр исходных МкА по отношению к гомологичному антигену (IgA крупного рогатого скота) составил 1:800 - 1:12800, реакции с гетерологичными иммуноглобулинами (IgG и IgM) отсутствовали. После перйодатного окисления, только 3 МкА из семи сохранили свою специфическую активность, остальные же утратили способность к связыванию IgA при проведении этой процедуры.
Известно, что основным свойством моноклональных антител, определяющим их специфичность, является их способность реагировать только с одним эпитопом, входящим в состав антигена. По своей структуре (или природе) эпитопы подразделяются на два типа: линейные и конформационные (топографические). Линейные эпитопы формируются линейным построением соседних аминокислот одной полипептидной цепи, тогда как конформационные (топографические) формируются остатками различных цепей или удаленными остатками одной цепи, соединенными вместе четвертичной струк турой всей белковой молекулы. Поскольку четвертичная структура белков может быть легко нарушена, конформационные эпитопы являются непостоянными на молекуле антигена, в то время как линейные эпитопы относят к постоянным, т.е. не изменяющимся ни при каких условиях. Нарушения четвертичной структуры зависят от взаимодействия между молекулой и раствором, от условий, изменяющих внутримолекулярное равновесие, что, в свою очередь, приводит к изменениям эпитопов (W.G.Laver et al., 1990; J.A Ber-zofsky and IJ.Berkower, 1993 и др.).
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что только МкА 1Е8 распознавало линейный эпитоп IgA крупного рогатого скота, специфически взаимодействуя в иммуноблоттинге как с нативной молекулой иммуноглобулина, так и с ее а -цепью. Остальные 6 МкА были конформаци-оннозависимыми, т.е. направленными против конформационных эпитопов IgA крупного рогатого скота. Эти эпитопы присутствуют только в нативной молекуле иммуноглобулина данного изотипа и необратимо разрушаются при ее денатурации.
На заключительном этапе исследований нами была определена эпитоп-ная специфичность исследуемых МкА. Для этого был разработан конкурентный вариант ИФА, при котором к антигену (IgA крупного рогатого скота), адсорбированному на поверхности пластика в концентрации 10 мкг/мл, добавляли смесь моноклональных антител: МкА, меченые пероксидазой в предварительно установленном титре и немеченые МкА в двукратных последовательных разведениях и инкубировали 3 часа при легком встряхивании на шейкере. Исходная концентрация всех неконъюгированных МкА составляла 100 мкг/мл. Принцип метода состоит в том, что моноклональные антитела, направленные к одному и тому же эпитопу, конкурируют между собой за связывание с антигеном и происходит полное торможение (ингиби-рование) реакции при избытке немеченых МкА, графически это выражается максимально низким значением ОП 492 в лунках с высокой концентрацией немеченых антител и максимальным его значением в лунках, где немеченые антитела отсутствуют или их количество минимально (рис. 1). МкА, специфичные к разным эпитопам, характеризуются отсутствием конкуренции между собой, т.е. торможение (ингибирование) реакции полностью отсутствует при любых концентрациях немеченых антител (значение ОП 492 максимальное во всех лунках). Частичное ингибирование может свидетельствовать о близком расположении двух разных эпитопов молекулы. По результатам реакции строили кривые титрования и после сравнения значения ОП 492 в аналогичных разведениях определяли процент ингибирования реакции исследуемыми МкА
