Содержание к диссертации
Введение
1.1 Актуальность 5
1.2 Цель и задачи исследования 7
1.3 Научная новизна , 8
1.4 Практическая значимость 8
1.5 Основные положения, выносимые на защиту: 9
1.6 Личный вклад соискателя 9
1.7 Апробация работы 9
1.8 Публикация результатов исследований 10
2 Обзор литературы 11
2.1 Вирусные респираторные инфекции крупного рогатого скота 11
2.2 Вирусная диарея крупного рогатого скота 12
2.3 Лабораторная диагностика вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота 20
2.3.1 Общие принципы лабораторной диагностики вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота 20
2.3.2 Реакция нейтрализации 21
2.3.3 Реакция связывания комплемента 24
2.3.4 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) 26
2.3.5 Иммуноферментный анализ (ИФА) 30
2.3.6 Анализ данных литературы 33
3 Собственные исследования 34
3.1 Материалы 34
3.1.1 Штаммы вирусов: 34
3.1.2 Диагностические сыворотки 35
3.1.3 Реактивы 35
3.1.4 Конъюгаты 35
3.1.5 Клеточные культуры 35
3.1.6 Среды 36
3.1.7 Объекты исследований 36
3.1.8 Животные 36
3.2 Методы 36
3.2.1 Клинико-эпизоотологические методы исследований 37
3.2.2 Вирусологические методы исследований 37
3.2.3 Иммунологические методы 38
3.2.3.1 Реакция нейтрализации 39
3.2.3.2 Реакция иммунодиффузии 39
3.2.3.3 Реакция непрямой гемагглютинации 40
3.2.3.4 Твердофазный иммуноферментный анализ 40
3.2.4 Статистические методы 41
3.3 Эпизоотологический мониторинг респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, маститов и эндометритов у коров в хозяйствах Смоленской области 41
3.3.1 Распространение респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, маститов и эндометритов у коров 41
3.3.2 Изучение этиологии энтеритов телят в Смоленской области 47
3.4 Разработка методов выявления специфических антител и антигенов вируса диареи крупного рогатого скота 51
3.4.1 Получение гипериммунной сыворотки против возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота 51
3.4.2 Совершенствование методов ТФ ИФА для выявления антител к вирусу диареи крупного рогатого скота 54
3.4.2,1 Определение специфичности метода ТФ ИФА для обнаружения антител квирусуВД КРС в сыворотках кровиКРС 64
3.4.3 Разработка конкурентного метода ТФ ИФА для выявления антигенов к вирусу диареи КРС 65
3.4.3.1 Определение специфичности конкурентного метода ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса диареи КРС в биологическом материале. 71
3.4.4 Определение оптимальных параметров постановки ТФ ИФА для выявления специфических к вирусу диареи КРС антител в сборном молоке коров 72
3.4.5 Сравнительная эффективность различных методов выявления антител к вирусу диареи в сыворотке крови крупного рогатого скота 76
3.5 Серологический мониторинг вирусной диареи в
хозяйствах Смоленской области с использованием ИФА 78
3.6 Схема лабораторной диагностики вирусной диареи КРС 79
3.7 Экономическая эффективность диагностических мероприятий при вирусной диареи телят 81
4 Обсуждение 82
5 Выводы 87
6 Практические предложения 88
7 Список литературы 88
8 Приложение 105
- Иммуноферментный анализ (ИФА)
- Изучение этиологии энтеритов телят в Смоленской области
- Определение специфичности конкурентного метода ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса диареи КРС в биологическом материале.
Введение к работе
Специализация молочного и мясного скотоводства способствует более рациональному использованию в практике достижений науки. Однако интенсификация животноводства ставит ряд порой трудноразрешимых проблем перед ветеринарной медицине в плане эффективной системы профилактики инфекционных заболеваний, поражающих различные возрастные группы крупного рогатого скота, что может быть обусловлено высокой концентрацией поголовья на ограниченной площади, нарушением микроклимата, неполноценным кормлением, технологическими стрессами и другими условиями. Вследствие этого, появляется значительное количество особей, особенно среди молодняка, с ослабленной резистентностью, поэтому возрастает вероятность возникновения инфекционных болезней и повышается роль бактерио- и вирусоносительства. В таких условиях причиной респираторных и желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота, как правило, являются ассоциации возбудителей, включающие вирусы, бактерии и другие этиологические агенты, в том числе микотоксины, которые обладают мощными иммуносупрессивными свойствами. В этом случае, даже условно-патогенные микроорганизмы могут вызывать массовые вспышки болезней желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, заболеваемость при которых достигает от 5 до 100% с летальностью от 10 до 70%. Особенно следует акцентировать внимание на хозяйствах, работающих на сборном поголовье, поступающем из хозяйств-поставщиков с различным эпизоотическим и иммунным статусом. Среди болезней крупного рогатого скота наибольшее распространение получили желудочно-кишечные и респираторные инфекции, обусловленные возбудителями вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3. Указанные возбудители выделяются больными животными с истечениями, экскретами, загрязняя объекты окружающей среды, что способствует быстрому и широкому распространению инфекций.
При искусственном осеменении контаминированной спермой быков-производителей и выпаивании телят молоком от больных коров происходит одновременное инфицирование большого количества животных.
Респираторные и желудочно - кишечные болезни КРС распространены практически во всех хозяйствах Смоленской области. Они наносят серьезный экономический ущерб животноводству, связанный с потерей живой массы скота, снижением молочной продуктивности, нарушением воспроизводства и гибелью молодняка. Изменения структуры и технологии ведения животноводства, возникающие на фоне экономической реформы народного хозяйства, экономическое давление на сельскохозяйственное производство наложили отпечаток нестабильности на эпизоотическую ситуацию, требующую от животных определенного адаптивного периода, когда приходят в равновесие взаимоотношения их организма с условиями содержания. Эти периоды, сопровождающиеся временным снижением резистентности, являются наиболее благоприятными для развития инфекционных болезней, которые при традиционных режимах содержания животных, как правило, не возникают или протекают в латентной форме. За последние годы в хозяйствах Смоленской области, у клинически здоровых животных в сыворотке крови обнаруживаются антитела к вирусам ВД КРС (вирусной диареи), что связано с вирусоносительством. До сих пор ветеринарные специалисты не вооружены надежными способами оперативного выявления латентной формы ВД КРС. Феномен латенции при ВД КРС приводит к неконтролируемому распространению возбудителя инфекции
Характер течения латентной формы ВД КРС в России практически не изучен, недостаточно выявлены особенности проявления эпизоотического процесса заболеваний в хозяйствах. Ранняя диагностика, а также своевременное выявление скрытых вирусоносителей являются важным фактором в оздоровлении хозяйств отВД КРС и недопущении распространения инфекции.
Для успешного осуществления комплекса противоэпизоотических и профилактических мероприятий большое значение имеют сроки проведения диагностики и достоверность полученных результатов. Имеющиеся методы в арсенале ветеринарных лабораторий мало пригодны для экспресс-диагностики из-за низкой их чувствительности и производительности, продолжительности анализа, что является сдерживающим фактором для принятия срочных мер, а также проведения эпизоотологического мониторинга, включая серологические исследования.
Поэтому разработке и усовершенствованию иммуноферментного анализа и его различным вариантам в последние годы уделяется особое внимание. С помощью названного теста появляется возможность в течение короткого отрезка времени исследовать большое количество проб биологического материала на предмет выявления антигенов возбудителей или специфических антител. С помощью ИФА можно выявлять антитела в молоке коров и антигены вируса диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 в сперме быков-производителей.
Однако специфичность ИФА во многом зависит от чистоты реагентов, в т.ч. антигена, специфичности поликлональных и моноклональных антител, активности пероксидазы, технологии приготовления конъюгатов, а также качества подготовленных проб к анализу.
Таким образом необходимость совершенствование средств и методов лабораторной диагностики вирусной диареи крупного рогатого до настоящего времени остается актуальной для ветеринарной медицины проблемой и это послужило основанием для выбора темы диссертационной работы.
1.2 Цель и задачи исследования
Целью настоящих исследований являлась разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота и мониторинг болезни в хозяйствах Смоленской области.
Для выполнения указанной цели было необходимо выполнить следующие задачи: 1. Изучить распространение вирусной диареи крупного рогатого скота и этиологию энтеритов телят, заболеваемости коров маститами и эндометритами в хозяйствах Смоленской области.
2. Исследовать роль респираторной и желудочно-кишечной патологии в падеже и выбытии молодняка КРС в хозяйствах Смоленской области.
3. Разработать и создать иммунореагенты и методы ТФ ИФА для диагностики БД КРС путем обнаружения специфических антигенов возбудителя в патологическом материале и специфических антител к возбудителю болезни в сыворотке крови животных.
4. Усовершенствовать схему лабораторной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота с включением ТФ ИФА.
5. Провести серологический мониторинг вирусной диареи крупного рогатого скота в хозяйствах Смоленской области с использованием ТФ ИФА.
1.3 Научная новизна
Усовершенствована схема получения гипериммунных сывороток против вирусной диареи крупного рогатого скота, отработаны методы отбора и подготовки проб молока для исследования в ИФА.
Впервые был проведен иммунологический мониторинг вирусной диареи крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Смоленской области, что позволило уточнить эпизоотологическую ситуацию, сроки циркуляции колостральных и поствакцинальных антител и определить их диагностическое значение.
1.4 Практическая значимость
Усовершенствованные нами методы диагностики диареи крупного рогатого скота, изложенные в «Методических рекомендациях по использованию иммуноферментного анализа для выявления антител класса Ig G к вирусу диареи крупного рогатого скота», внедрены в работу Смоленской областной ветеринарной лаборатории и Научно-исследовательской ветеринарной станции. Всего в течение 1999-2003 гг. при проведении диагностических исследований в указанных учреждениях исследовано 457 проб материалов от больных коров и телят 1-6 месячного возраста. Выполнено более 700 экспертизных исследований.
1.5 Основные положения, выносимые на защиту:
1. Причины заболеваемости и падежа молодняка КРС при болезнях респираторной и желудочно-кишечной этиологии, заболеваемости коров маститами и эндометритами в хозяйствах Смоленской области.
2. Характеристика иммунореагентов и методов диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота, разработанных на основе твердофазного иммуноферментного анализа для обнаружения специфических антигенов возбудителя в патологическом материале и специфических антител к возбудителю болезни в сыворотке крови КРС, молозиве и молоке коров.
3. Усовершенствованная схема лабораторной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота, основанная на применении методов твердофазного иммуноферментного анализа.
4. Распространение вирусной диареи крупного рогатого скота в хозяйствах Смоленской области, установленное с использованием разработанных методов твердофазного иммуноферментного анализа.
1.6 Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделам 3,3.1, 3.3.2, 3.4.1., 3.4.4., 3.7. практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ СНИВС: Гамаюнов В.М., Турлаков А.П. Авторский вклад соискателя - около 80%.
1.7 Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого Совета Смоленской НИВС (1999-2002 гг.), Международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей, (г. Покров, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «ИЭКВМ - 80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки (г.Харьков, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Досягнення та перспективи розвитку ветеринарної медицини» (Полтава, 2002 г.); Научно-производственной конференции «Внедрение достижений ветеринарной науки в сельскохозяйственное производство», посвященной 70-летию Смоленской НИВС (Смоленск, 2002).
1.8 Публикация результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Иммуноферментный анализ, разработанный более двадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее время одним из распространенных методов лабораторных исследований. Явным преимуществом этого метода, является простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, что обеспечило его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях. Благодаря успехам биотехнологии, иммуноферментный анализ получил интенсивное развитие, поскольку с помощью генной инженерии были получены в высокоочищенном виде малодоступные антигены, а также ферменты-маркеры и их конъюгаты с антигеном. Новые направления развития иммуноферментного анализа связаны с использованием различных методов регуляции ферментативной активности при определении комплексов антиген-антитело. Иммуноферментный анализ был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей — Engval, Pormann в Швеции /106/, van Neamen, Schumes в Нидерландах /165/, Rubenslen et al в США /82/. При этом методе антиген или антитело, вступающие в иммунологическую реакцию, метится ферментом. По превращению фермента добавляемого субстрата можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определить нанограммы белка антигена или антител /82/.
Благодаря ИФА, появилась возможность проводить количественные измерения в широком диапазоне концентраций с использованием лишь единичного разведения сыворотки или плазмы. Этот метод позволяет легко различить по активности антитела, принадлежащие различным классам иммуноглобулинов. Объективность количественной оценки обеспечивается инструментальным фотометрированием: при этом интенсивность регистрируемых сигналов непосредственно коррелирует с уровнем тестируемых антител. Правильный подбор соответствующих антигенов, связанных с носителями, подходящий антииммуноглобулиновый конъюгат, содержащий ферментную метку, позволяет создать системы тестирования множества различных антигенов, основанных на одном и том же наборе манипуляций /69/.
Постановка твердофазного ИФА на полистироловых панелях с целью выявления противовирусных антител имеет следующие стадии: иммобилизация растворимых антигенов на твердой фазе, отмывание несвязавшегося антигена буферным раствором с детергентом, связывание активных центров твердой фазы инертным белком, взаимодействие иммобилизированных антигенов с исследуемыми антителами и образование комплекса антиген-антитело, выявление данного комплекса с помощью антииммуноглобулиновой сыворотки или белка А золотистого стафилококка, меченных ферментом, детекцию с помощью субстратной смеси количества связанного фермента/75, 81/.
Для выявления антигенов вирусов в биологических жидкостях также используют твердофазный ИФА. Для этого наиболее часто используют метод двойных антител или "сэндвич"-вариант. При этом в лунки полистироловых панелей иммобилизируют специфический гамма-глобулин, выделенный из специфической к данному антигену сыворотки. Стадии выявления антигена следующие: иммобилизация на твердой фазе антител, отмывание их избытка, обработка лунок панели инертным белком, внесение исследуемого антигена, отмывание, внесение конъюгата антител с ферментом, внесение субстратной смеси и учет результатов /75/. Кроме твердофазного ИФА имеется еще и гистологический вариант ИФА или иммунопероксидазная реакция. Данная реакция аналогична реакции иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки ИФА используются антитела меченные не флуорохромом, а ферментом, и учет реакции проводится под обычным световым микроскопом. В этом варианте ИФА используются антитела, меченные пероксидазой, так как молекулярная масса (40000) меньше, чем других ферментов и способствует лучшему проникновению пероксидазных конъюгатов через клеточные мембраны. Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазного метода могут служить мазки-отпечатки из различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови. При выявлении антигенов используют как прямой, так и непрямой иммунопероксидазные тесты. Для выявления вирусспецифических антигенов прямым иммунопероксидазным методом проводят следующие этапы: фиксация мазков-отпечатков или инфицированного монослоя, внесение конъюгата антител с ферментом, отмывание, внесение субстратной смеси и учет под микроскопом /48, 75/.
Различные варианты ИФА с целью выявления антигенов и антител нашли широкое применение для диагностики вирусных болезней животных /60, 71, 146,147, 130/.
Для обнаружения антигенов вируса диареи в инфицированной культуре клеток предложены прямой и непрямой иммунопероксидазные тесты /91,167/.
Выявление антител к вирусу диареи крупного рогатого скота с помощью ИФА осуществили J.M.Hyera et al /122/, R.Bock et al /91/, C.J.Howard et al /121/. При сравнении РН с ИФА оказалось, что ЙФА выявляет значительно более высокий процент серопозитивных животных /91, 122/. Коэффициент корреляции между этими реакциями составляет 0,89 /121/.
Таким образом, представленные литературные данные показывают, что для диагностики ВД широко применяются такие иммунологические реакции, как ИФА, РНГА, РН, РСК. Однако в литературе нет данных, указывающих на использование штаммов вируса диареи, выделенных в странах СНГ, для изготовления диагностических препаратов на основе оценки их в ИФА.
Изучение этиологии энтеритов телят в Смоленской области
В лабораторных исследованиях патологического материала от павших и вынужденно убитых больных телят, проведенных в Смоленской областной и районных ветеринарных лабораториях в 1994-2002 гг., чаще всего выделяли эшерихии (E.coli), стафилококки (Staph, aureus, Staph, epidermidis), псевдомонады (Ps.aeruginosa) при диарейном синдроме; возбудители пастереллеза (Past, multocida, Past, haemolitica), сальмонеллеза (Salmonella dublin, Salmonella thyphymurium), стрептококкоза (Str. pneumoniae), стафилококки (Staph, aureus, Staph, epidermidis) при респираторных инфекциях. При проведении серологических исследований сывороток крови от больных животных в диагностических титрах выявлены антитела к антигенам возбудителей вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций. Кроме того, в фекалиях больных диареей телят методом ИФА и иммунной электронной микроскопией обнаружены антигены вируса диареи, рота- и коронавирусов.
Анализ результатов диагностических лабораторных исследований показал, что при серологическом исследовании антитела к вирусу диареи выявлялись у 75-82% переболевших энтеритами телят и у 85-100% коров из хозяйств, в которых отмечались массовые заболевания телят энтеритами. У телят, больных энтеритами установлено наличие антигенов вируса диареи - у 65-80%, ротавирусов - у 46-53%, коронавирусов - 62-71% животных.
Патогенная кишечная палочка выявлялась у 26-32% обследованных телят, псевдомоны - у 12-17%, стафилококки - у 35-41%, стрептококки - у 9-13% животных.
В связи с этим, для профилактики и борьбы с вирусными и бактериальными заболеваниями телят в хозяйствах Смоленской области рекомендован комплекс мероприятий, который включал проведение хозяйственно-технологических и ветеринарно-санитарных мер. Из ветеринарных мероприятий основная роль принадлежит специфической иммунизации вновь поступающих на комплексы телят против вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 (вакцинами производства РНИУП «ИЭВ им. С.Н.Вышелесского НАШ», Покровского биокомбината, Ставропольской и Краснодарской биофабрик), сальмонеллеза (вакцина производства Армавирской биофабрики) и пастереллеза (вакцина производства Покровского биокомбината).
Проведя анализ клинического состояния животных, технологии содержания и кормления, результатов вирусологических, серологических, бактериологических, биохимических и иммунологических исследований, нами сделано заключение о том, что респираторные и желудочно-кишечные болезни телят в Смоленской области - это многофакторные заболевания.
К основным возбудителям регистрируемых желудочно-кишечных заболеваний телят следует отнести; вирус диареи, рота- и коронавирусы, энтеропатогенные, энтеротоксигенные и энтероинвазивные эшерихии, сальмонеллы и псевдомонады ,
Факторами, определяющими их возникновение и способствующими широкому распространению, являются:
- иммунодефицитное состояние новорожденных телят (первичный иммунодефицит) или животных старше месячного возраста под воздействием неблагоприятных технологических и экологических факторов (вторичный приобретенный иммунодефицит);
- нарушение технологии содержания (скученное содержание телят на ограниченной площади) и кормления животных по несбалансированным рационам с дефицитом питательных веществ, аминокислот, микро- и макроэлементов, витаминов;
- влияние неблагоприятных экологических факторов внешней среды;
-комплектование крупных ферм сборным поголовьем телят без учета эпизоотической ситуации и иммунного статуса хозяйств или ферм-поставшиков, а также удлинение сроков комплектации (содержание в одном помещении разновозрастных животных с различным эпизоотологическим и иммунным статусом, нарушение принципа "пусто-занято" между технологическими циклами);
-нарушение сроков проведения противоэпизоотических мероприятий. На крупных специализированных фермах, комплектующих животных из хозяйств - поставщиков, как правило, регистрируются респираторные инфекции со смешанной этиологией.
Тяжелое течение вирусных инфекций приводит к значительному угнетению клеточного и гуморального звеньев иммунитета. На этом фоне условно-патогенная микрофлора активизируется и у животных развивается, так называемая, "энзоотическая пневмония", которая приводит к значительному снижению их продуктивности и отходу.
В связи с выше изложенным, весьма актуальным является изучение закономерностей развития эпизоотического и инфекционного процессов при вирусных желудочно-кишечных и респираторных болезнях на комплексах и крупных фермах. Оно должно включать:
— эпизоотологическое обследование хозяйств - поставщиков;
—изучение состояния иммунитета и обменных процессов у животных, поступающих из различных хозяйств;
—анализ результатов клинического и патологоанатомического исследования животных, заболевших в условиях комплексов;
—проведение бактериологических и вирусологических исследований патологического материала от вынужденно убитых и павших телят с выделением и идентификацией этиологического агента;
—осуществление серологического обследования больных и переболевших телят,
Таким образом, проведенные исследования позволили установить роль возбудителей вирусной и бактериальной этиологии при респираторных и желудочно-кишечных болезнях телят, а также роль общехозяйственных и технологических факторов в возникновении этой группы заболеваний.
Определение специфичности конкурентного метода ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса диареи КРС в биологическом материале
Специфичность является важным показателем диагностической ценности методов выявления антигенов вируса в патологическом материале или культуральной жидкости. При определении специфичности разработанного нами конкурентного метода ТФ ИФА для выявления антигенов вируса ВД КРС проводили его постановку с рядом известных гетерологичных возбудителей инфекционных болезней КРС. В качестве гетерологичных антигенов использованы культуральные жидкости инфицированных этими возбудителями культур клеток.
В табл. 21 представлены результаты изучения специфичности конкурентного метода ТФ ИФА для выявления антигенов вируса диареи крупного рогатого скота.
п/п Культуральные антигены вирусов + антисыворотка к вирусу диареи: Оптическаяплотность ДЕ
1 Вирус диареи + антисыворотка 0.479 1,26
2 Вирус инфекционного ринготрахеита +антисыворотка 0.874 2,30
3 Вирус парагриппа-3 + антисыворотка 0.784 2,06
4 Ротавирус + антисыворотка 0.805 2,12
5 Коронавирус + антисыворотка 0.785 2,07
6 Аденовирусам 1 подгруппы + антисыворотка 0.724 1,91
7 Аденовирусам 2 подгруппы + антисыворотка 0.822 2,17
8 Респираторно-синцитиальному вирус + антисыворотка к ВД 0.799 2,11
9 Антисыворотка к ВД 0.974 2.57
10 Отрицательная сыворотка 0.379 1
Из представленных в таблице данных видно, что только вирус диареи существенно снижает титр антител в антисыворотке после их взамодействия , что свидетельствуют о высокой специфичности разработанного метода ТФ ИФА для выявления антигенов вируса диареи КРС.
Таким образом, разработанный нами конкурентный метод ТФ ИФА для обнаружения антигенов возбудителя ВД КРС в биологическом материале от больных острыми респираторными заболеваниями и острыми гастроэнтеритами телят, позволяет поставить диагноз на эту болезнь в течение 3 часов, что в свою очередь, позволит своевременно проводить противоэпизоотические мероприятия против вирусной диареи КРС.
3.4.4 Определение оптимальных параметров постановки ТФ ИФА для выявления специфических к вирусу диареи КРС антител в сборном молоке коров
При массовых исследованиях индивидуальное взятие крови от животных сопровождается большими затратами физического труда и времени. Одним из перспективных методов ретроспективной диагностики вирусных инфекций у животных является определение их в естественных секретах — носовых истечениях, слезах, молозиве, молоке. Антитела, относящиеся к секреторным иммуноглобулинам класса А, имеют высокую активность и диагностическую ценность. Наряду с этим классом иммуноглобулинов в молозиве и молоке присутствуют и другие классы иммуноглобулинов — М и G. Количество антител, содержащихся в молозиве, в 2-5 раз превышает их содержание в сыворотке крови и поэтому в исследовании молозива на наличие антител к возбудителям респираторных и желудочно-кишечных болезней телят наиболее оптимальный способ ретроспективной диагностики. Однако период выделения молозива у коров непродолжительный и не всегда имеется возможность отобрать пробы для исследований. Использование же молока позволяет проводить исследования независимо от времени отела и отбирать этот материал от животных без особых затрат сил и времени.
В молоке содержится иммуноглобулинов в 50-100 раз меньше, чем в сыворотке молозива. В этой связи одним из моментов подготовки материала для исследований является наряду с удалением казеина, концентрация полученной сыворотки с помощью различных веществ в 20-50 раз.
В работе нами использовались сборные пробы молока из хозяйств, благополучных и неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням.
Первым этапом подготовки молока для исследования являлось удаление казеина. Имеется несколько способов его отделения от сыворотки — с помощью сычужного фермента, пепсина, молочной, уксусной или соляной кислот. При проведении исследований мы пришли к выводу о необходимости осаждения казеина с помощью молочной кислоты, с последующим центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10-+15 минут и доведением рН до нейтральной двууглекислым натрием. Этим способом осаждали казеин при массовым отборе проб. Для установления возможности использования сыворотки молока с целью определения антител к вирусу диареи были проверены различные варианты ее подготовки. Так, в ИФА использовалась цельная сыворотка молока, концентрированная в 50 раз с помощью насыщенного раствора аммония сульфата, натрия сульфата, 50%-го раствора полиэтиленгликоля ММ 6000. Результаты исследований по отработке осаждения казеина из проб молока, а также подготовки сыворотки молока представлены в таблицах 22, 23 .
При изучении оптимального способа концентрирования глобулинов из сыворотки молока установлено, что лучшим оказался способ концентрирования с помощью полиэтиленгликоля ММ 6000 до 15%-ного насыщения сыворотки. При этом оптическая плотность концентрированной сыворотки составляла при исследовании на ВД - 1,073 (AF-? 47) Положительным моментом при таком способе концентрирования глобулинов является возможность растворения полученного осадка глобулинов, тогда как после осаждения сульфатом натрия или сульфатом аммония осадок плохо растворяется.
