Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди многообразия вирусных агентов, вызывающих патологию у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС) занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Н.Н. Крюков и соавт., 1984; К.П. Юров и соавт., 2003; D. Deregt et al., 1995; A.L.E. Lindberg, 2003).
Многие исследователи отводят первичную этиологическую роль в возникновении массовых респираторных болезней молодняка КРС этим вирусам, которая заключается в разрушении клеток эпителия (V. Fainstein et al., 1980), понижении активности бактериостатических механизмов в легких, воздействии на макрофаги, лейкоциты, Т4+-лимфоциты и изменении их функций (L.A. Babiuk et al., 1991; М.Т. Winkler, 1999).
Эти болезни регистрируются во всем мире, а также в РФ и причиняют значительный экономический ущерб мясному и молочному скотоводству (О.Г. Петрова и соавт., 1999; А.Г. Высокопоясный и соавт., 2000; Н.И. Закутский, 2000; В.А. Мищенко и соавт., 2001; Н.Ю. Басова, 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; A.L.E. Lindberg, 2003).
В настоящее время необходима разработка и внедрение простых, высокочувствительных и специфичных методов, выявляющих возбудителя на любой стадии заболевания. Одним из них является полимераз-ная цепная реакция (ПЦР), которая становится важным диагностическим тестом в ветеринарной вирусологии (S. Belak et al., 1993).
В научной литературе есть сообщения о разработке и использовании ПЦР для выявления ДНК вируса ИРТ КРС в сперме быков (J. Rola et al., 1999), культуральной жидкости (В.Р. Sreenivasa et al., 1996), полевых изолятах (S.Moore et al., 2000). В качестве мишеней амплификации выбирались гены гликопротеинов (С. Ros et al., 1999), тимидинкиназы (S. Moore et al., 2000), использовалась стратегия гнездовой, или в комбинации с блот-гибридизацией ПЦР (R.S.Kataria, 1997).
С введением в практику ветеринарной вирусологии метода рестри-кционного анализа появилась возможность дифференциации вируса ИРТ КРС (BHV-1) на подтипы (1.1, 1.2 а/в и 1.3), различающиеся по вирулентности (A. Metzler, et. al., 1985). Впоследствии штаммы BHV-1.3, реклассифицировали в отдельный тип BHV-5 (В. Roizman et al., 1995). Метод имеет ограниченное диагностическое значение, но успешно используется при эпизоотологических исследованиях, хотя обладает некоторыми недостатками, главным из которых является необходимость наработки большого количества вирусной ДНК.
Существование геномных вариантов вируса необходимо учитывать при разработке диагностических ПЦР-тест-систем (С. Ros, S. Belak, 1999). Для дифференциации между вариантами различных вирусов широко используются методы оценки полиморфизма ДНК, в частности, ПЦР-ПДРФ анализ (С. Херрингтон и соавт., 1999).
Принимая во внимание длительную персистенцию вируса ИРТ КРС на уровне популяции крупного рогатого скота, определение вирулентности изолятов в зависимости от их генотипа вызывает большой научно-практический интерес исследователей всего мира (М. Ackermann, 2001).
Актуальным в настоящее время является также изучение возможности использования противовирусных препаратов различных классов для профилактики и лечения больных животных (М.М. Зубаиров, 1998).
Учитывая то, что возбудитель ВД-БС КРС представлен цитопато-генным и нецитопатогенным биотипами, определяющими клинические проявления болезни в зависимости от способности индуцировать выработку интерферона типа 1 в организме восприимчивых животных, изучение связи между интерфероногенной активностью и его патогенно-стью имеет большой научный интерес (N. Grandvaux et al., 2002).
Цель и задачи исследований. Цель работы: разработка способов диагностики, изучение молекулярно-биологических свойств возбудителей и научное обоснование применения противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее крупного рогатого скота.
Для достижения указанной цели были поставлены задачи:
-
Усовершенствовать методику постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для серологической диагностики ВД-БС КРС. Изучить распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири, установить роль вирусов в этиологии массовых респираторных болезней молодняка КРС и выявить ассоциации вирусов, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней;
-
Разработать ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучить ее сравнительную диагностическую эффективность, а также способ типи-рования и дифференциации штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа;
-
Изучить некоторые молекулярно-биологические свойства штаммов и изолятов вирусов, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов определить их сравнительную патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности, а также воспроизвести острую смешанную бронхопневмонию вирусной этиологии и изучить ее клинические проявления;
-
Изучить противовирусную активность препаратов различных классов, а также экзогенного интерферона в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro, а наиболее эффективных из них в экспериментах in vivo.
Научная новизна.
1. Усовершенствована методика постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для серологической диагностики ВД-БС КРС. Установлено широкое распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири и подтверждена ведущая роль вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят вирусной этиологии в крупных хо-
зяиствах племенного и молочного направления. Выявлена взаимосвязь между концентрацией поголовья, серопозитивностью и частотой выделения вирусов от больных животных. Изучены ассоциации вирусов, возникающие при массовых вспышках респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота.
-
Разработана ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучена ее сравнительная диагностическая эффективность, а также способ типиро-вания и дифференциации вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа. Проведено типирование Российских штаммов и изолятов вируса, разработан способ дифференциации аттенуированного вакцинного штамма ТК-А от полевых штаммов и изолятов вируса.
-
Изучены некоторые молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов показана взаимосвязь генотипа вируса ИРТ КРС и интерфероногенной активности вируса ВД-БС КРС с их патогенностью для естественно восприимчивых животных, а также воспроизведена острая смешанная вирусная болезнь и показано усиление патогенных свойств вируса ИРТ КРС на фоне размножения вируса ВД-БС КРС.
-
Установлена противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro. Показана профилактическая эффективность 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолона в контролируемых опытах на экспериментально зараженных телятах 4-6-месячного возраста.
Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации использованы при составлении:
Рекомендаций «Вирусные заболевания крупного рогатого скота в Сибири и на Урале (Особенности эпизоотологии, клинического проявления, диагностика, меры профилактики и борьбы)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 1, 12.01.2001) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 1, 15.01.2001);
Методических рекомендаций «Оценка токсичности противовирусных препаратов в культуре клеток», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 2, 05.03.2004) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 10, 05.03.2004);
Методических рекомендаций «Выявление вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразнои цепной реакции с последующей дифференциацией вакцинного штамма и эпизоотических изолятов», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 6, 09.11.2004) и подсекцией секции инфекционной
патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 11, 10.11.2004);
Рекомендаций «Вирусные и ассоциативные вирусно-бактериаль-ные респираторные болезни крупного рогатого скота (Особенности эпизоотологии, патогенеза, клинического проявления, патологоанатомиче-ских изменений)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 6, 09.11.2004) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 23, 09.11.2004);
Методических рекомендаций «Выявление вируснейтрализующих антител к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота в реакции нейтрализации микрометодом в культуре клеток», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 2, 29.04. 2005) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 4, 29.04.2005);
Методического пособия «Противовирусное действие интерферо-нов», утвержденного Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. №2, 03.05Л2005) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 4, 03.05. 2005);
Методического пособия «Молекулярные методы диагностики: принципы и практическое применение при инфекционных болезнях животных», утвержденного Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 2, 03.05. 2005) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. № 4, 03.05.2005).
Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, создают перспективы использования ПЦР не только в диагностике ИРТ КРС, но и в молекулярной эпизоотологии болезни и могут быть использованы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью дифференциации аттенуированного вакцинного штамма от полевых штаммов и изолятов вируса. Полученные данные также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпес- и пестивирусами. Результаты исследований открывают перспективы применения противовирусных препаратов для профилактики вирусных инфекций и могут быть использованы в практике при разработке оздоровительно-профилактических мероприятий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого совета ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (Новосибирск, 1999-2005), Международной научно-практической конференции (Новосибирск, 1999); Научно-практической конференции (Новокузнецк, 2000); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2000); 111 и IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2001, 2002); Научно-практической конференции «Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологии и меры борьбы с ними» (Иркутск, 2001); 5-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкорстана» (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2002); Международной научно-практической конференции (Покров, 2002); 6-й Международной научно-практической конференции «Аграрная наука Сибири, Монголии, Казахстана и Башкорстана — сельскому хозяйству» (Новосибирск, 2003); International Multidisciplinary Workshop Scientific Discussion Club «Progress in Biotechnology and neurobiology - integrative medicine» (Egypt, 2004); Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию проф. Н.Т. Кондюрина (Омск, 2004); Международной научно-производственной конференции «Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004); Сибирском Международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005), Международной научно-практической конференции «Проблемы ветеринарной науки и практики в современных условиях» (Алматы, 2005).
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены Подсекцией инфекционной патологии при ИЭВСиДВ (прот. № 5, 20.10.2005) и Ученым Советом ГНУ ИЭВСиДВ (прот. № 9, 20.10.2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 39 печатных работах в сборниках научных трудов, журналах «Ветеринария», «Вопросы вирусологии», «Антибиотики и химиотерапия» и других научных трудах и изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20
