Содержание к диссертации
Введение
Глава I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
I.I.Распространение болезни и экономический ущерб 8
1.2.Этиология болезни, биологические свойства возбудителя 9
І.З. Иоточники инфекции нейссериоза гусей и пути передачи возоудителя 19
1.4.Течение инфекции, клинические признаки и патологоанатомические изменения при
нейссериозе 22
1.5.Диагностика нейссериоза гусей и ее значение 27
Глава 2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы 31
Глава 3.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ.ИССЛЕДОВАНИЙ
ЗЛ.Эпизоотологический анализ ' 46
3.2.Выделение возбудителяиего биологические свойства 51
3.2.1.Морфология и гинкториальные свойства нейссерий гусей 51
3.2.2. Культуральные свойства 54
3.2.3.Биохимические свойства . 54
3.2.4.Антигенные свойства 58
3.2.5.Чувствительность нейссерий к антибиотикам 63
З.З.Патогенность нейссерий для домашней птицы и лабораторных животных 65
З.З.І.Патогенность для эмбрионов птиц . 68
3.4.Клинические и патоморфологические изменения при экспериментальном нейссериозе гусей . 69
3.5.Пути передачи заболевания 78
Глава 4.ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 83
ВЫВОДЫ 97
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
- Иоточники инфекции нейссериоза гусей и пути передачи возоудителя
- Материалы и методы
- Культуральные свойства
Введение к работе
В Продовольственной программе СССР, принятой майским /1982 г/ Пленумом ЦК КПСС, птицеводство призвано выполнить важную роль в удовлетворении потребностей страны в диетических продуктах - птичьем мясе и яйце. Так, к 1990 году предусматривается довести производство мяса птицы до 3,4-3,6 млн.тонн, в том числе мяса гусей -262 тыс.тонн. В хозяйствах оистемы Птицепрома СССР намечается произвести гусиного мяса 55 тыс.тонн. По оравнению с 1976 годом поголовье взрослых гусей к началу 1983 года возросло в 2,6 раза и составило 1,6 млн.голов, из них 716,5 тыс.голов в Украинской ССР.
На современном этапе гусеводство служит значительным источником производства мяса птицы. Однако развитие данной отрасли часто одерживается появлением инфекционных болезней. В последние годы при переходе на интенсивные методы выращивания зарегистрировано ранее малоизученное заболевание половых органов гусей, именуемое в литературе как "нейссериоз" или "гонорея", которое стало серьез-ной угрозой дальнейшему развитию отрасли. В связи с этим особое значение приобретают вопросы разработки методов диагностики и профилактики указанной болезни.
Актуальность проблемы.Болезнь нанооит ощутимый экономический ущерб промышленному гусеводству, который складываегоя из повышен-ной выбраковки птицы (до 10-14,5 ), ее падежа (до ІВД и снижения ОПЛОДОТВОРЄННООТИ ЯИЦ (ДО I0%)/I.Szep et al., I97I-I979; V.Palya et al.,1971; I.Renes И G.Szalay, 1973; A.M.Bummee et al., 1973; Л.М.Контримавичус и соавт.,1975; В.С.Фадин и соавт.,1975; G.Ganto-gjovic et al.,I977; P.Gazdzinski,I98I/.
В нашей стране до 1971 года это заболевание не диагностировалось, поэтому многие вопрооы эпизоотологии и диагностики болезни изучены недостаточно, что определяет актуальность поставленных на разрешение задач.
Работа являлась частью плановой темы по изучению этиологии заболевания репродуктивных органов гусей и выполнена согласно тематическому плану НИЕ Украинского научно-исследовательокого института птицеводства в 1979-1984 годах.
Цель и задачи. Целью исследований было изучение этиологии и разработка диагностики инфекционного заболевания половых органов гусей, вызываемого микроорганизмами из рода Neisseria. Для достижения указанной цели перед нами были поставлены следующие задачи:
I.Изучить некоторые вопросы эпизоотологии болезни /распространение и пути передачи/ в отдельных хозяйствах Украины.
2.Выделить возбудителя и изучить его морфологические, куль-туральные, биохимические, антигенные, патогенные свойства и определить чувствительность к антибиотикам.
З.Йзучигь клиническую картину и патологоморфологические изменения.
4.Изучить отдельные вопросы серологической диагностики болезни
Научная новизна работы. Впервые зарегистрировано заболевание роловых органов гусей в хозяйствах Украины. Выделены возбудители, установлена их роль в этиологии болезни, а также половой и гранс-овариальный пути распространения.
Впервые проведена идентификация возбудителей из рода Neisseria , выделенных ОТ больных гусей, ДО ВИДОВ: Neisseria oanis, Neisse sp.B, ria caviae,Neisseria sp.A,Neisseria изучены ИХ МОрфОЛОГИЧЄСКИЄ, культуральные, биохимические, антигенные и патогенные свойства, чувствительность к антибиотикам.
Впервые изучены патоморфологические изменения у больных гуоей.
Практическая ценность. На основании полученных результатов разработаны "Методические рекомендации по лабораторной диагностике нейооериоза гусей" /Утверждены Научно-техническим советом МСХ УССР 9 авгуота 1983 года/.
Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процеоое на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей при Харьковском и Троицком зооветеринарных институтах.
Штаммы Neisseria, выделенные от больных гусей, приняты в фонд музея патогенных и условно патогенных микробов при Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасовича.
Апробация работы. Материалы работы и ее отдельные разделы доложены: на заседаниях Ученого совета УНЙИП /1979-1982 гг/, на ХХІУ Всесоюзной конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству /г.Загорск,1981/, на научно-производогвенной конференции ВНИВИП "Задачи молодых ученых и специалистов по дальнейшему развитию научных исследований и ускорению внедрения в производство достижений науки в свете решений майокого /1982 г/ Пленума ЦК КПСС /г.Ленинград,1982/, отчетной научной конференции, посвященной итогам научно-исследовательской работы кафедр Харьковского зооветеринарного института /г.Харьков,1981/, конференции молодых ученых и аспирантов, посвященной 112-й годовщине оо дня рождения В.й.Ленина /Борки,1982/.
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в которых отражено основное ее содержание.
Структура и объем работы.Диосертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение, иллюстрирована рисунками и 12 таблицами. Бибжографический указатель включает 200 источников литературы, в том числе 82 иностранных источника.
Иоточники инфекции нейссериоза гусей и пути передачи возоудителя
Венгерские И Чешские ученые /I.Szep, M.Fataky, G.Nady,I973, G.
GantosoviJ?77/, изучая источнижи инфекции и пути передачи возбудителя болезни половых органов гусей, установили, что заболевание передается половым путем при спаривании птицы в племенной сезон года. Согласно их данным, появлению и распространению болезни способствуют антисанитарные условия содержания /грязная подстилка, повышенная плотность посадки, сырость/, спаривание птицы вне воды, при котором часто происходит механическое повреждение органа, травма бахромы пениса и наслоение вторичной инфекции.
M_.Pataky /1978/ и i.Szep et al. /1979/ при бактериологическом исследовании внутренних органов больной птицы и однодневных гусят в 50-88% случаев выделили возбудитель рода Neisseria. Эти же микроорганизмы были изолированы из желтка 689 яиц, что указывает на возможность траноовариальной передачи инфекции о последующим бакгерионо си гельс твои.
В.С.Фадин и В.И.Корнеева /1980/ доказали возможность передачи возбудителя только при половом контакте больных гусаков со здоровыми гусынями и больных гусынь со здоровыми гусаками. При экспериментальном заражении птицы путем внутривенного, перорального, интраназального, аэрозольного введения, а также нанесения возбудителя на слизистую конъюнктивы глаза заметных отклонений в общем состоянии организма и в половых органах птицы замечено не было. Бактериологические исследования дали отрицательные результаты.
Таким образом, приведенные материалы литературы, касающиеоя путей передачи инфекции, носят характер отдельных сообщений. Однако, несмотря на малочисленность работ подобного плана, авторы высказывают единое мнение о том, что половой путь является основным при нейссериозе гусей.
Учитывая общность характера путей передачи данного заболевания и гонореи человека, позволим себе, в некоторой степени, остановиться на отдельных аспектах распространения возбудителя гонореи.
Согласно данным медицинской литературы, источником инфекции гонореи человека являются больные лица. Возбудитель чаще переда 21 етоя половым путем /А.Кан,І950; И.Брауде и соавт.,1957; Н.Л.Утев-ский,1961,1975; М.Фробишер,1965; И.И.Потоцкий,1981/. При этом необязательно наличие большого количества вирулентных гонококков /острого периода болезни/, так как заражение возможно и в случаях хронической и даже скрытой гонореи. Хотя при хронических процессах вирулентность гонококков и понижается, однако достаточно попадания их в здоровый организм, чтобы эта вирулентность восстановилась. Заражение от хронически больных может служить причиной острой и, подчас, очень бурной инфекции. Если поврежденный плоский эпителий слизистых оболочек, а тем более кожи, совершенно не проницаем для гонококков, то цилиндричеокий и мерцательный эпителий здоровых олизистых оболочек немедленно инфицируются, как только на их по« верхность попадут жизнеспособные гонококки.
Заболевание может передаваться и неполовым путем: через загрязненные выделениями руки или предметы домашнего обихода /таз, ванна, губка, мочалка, полотенце и другие вещи/, которыми пользовались больные. Внеполовой путь заражения гонореей наблюдаегоя чаще всего у девочек /А.П.Кушелевский,1928; В.Г.Сергеева и соавт., 1972; Ф.М.Зубриянов, 1973; E.Barrett-Connor, 1973; Н.И.Гулицкая и ооавт.,1979; Л.Д.Кунцевич, 1974,1976; A.R.Stark et al.,i979; Б.А.За-дорожный,1981; И.И.Потоцкий,1981; К.Д.Пяткин и соавт.,1981; В.И.Синица и соавт.,1981/.
Широкому распространению инфекции внеполовым способом препятствует то, что гонококки плохо перенооят высыхание и погибают вне организма уже через несколько часов. Если же гной оотаетоя во влажном состоянии /в теплой воде, во влажном пятне на белье/, гонококки могут сохранять свою жизнеспособность в течение суток /Й.Л.Брауде,1957/.
Из всех тканей человеческого организма наибольший тропизм к заражению проявляют слизистые оболочки, покрытые цилиндрическим эпителием или так называемым переходным эпителием. Среди них на первом месте стоит олизистая оболочка мочеиспускательного канала, одинаково как у мужчин, так и у женщин, затем конъюнктива глаз и далее ожзиотая шейки матки /мерцательный эпителий/ у женщин. Слизистая оболочка других отделов половых органов женщин неодинаково восприимчива к гонококкам в разные периоды жизни.
Анализируя данные, приведенные отечественными и зарубежными авторами в ветеринарной и медицинской литературе, можно предположить, что возбудитель нейссериоза гусей, как и гонореи человека, передается, по-видимому, половым путем. Однако не исключена возможность и других путей передачи инфекции. Их роль в распространении болезни нуждается в дальнейшем изучении.
Материалы и методы
Эпизоотологический анализ, клинические наблюдения, отбор материала для изоляции возбудителя проводили в опытном хозяйстве "Борки" УНИИП, на птицефабрике "Охоченская", в совхозе "Димитрово"
Харьковской и совхозе "Беляево" Калужской областей, в Каховском агропромышленном птицеводческом предприятии.
При проведении эпизоогологического обследования хозяйств учитывали материалы ветеринарной отчетности за последние 2-3 года, изучали клиническое проявление болезни, факторы, способствующие возникновению и распространению заболевания, сезонность, источник инфекции, течение болезни, пути заражения и передачи, возраст заболевшей птицы и способ ее содержания, наносимый экономический ущерб. Последний рассчитывали в отделе экономики Украинского НИИ птицеводства совместно со старшим научным сотрудником Шоминым А.В. по методике определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений, утвержденной МСХ СССР 22 февраля 1979 года.
В условиях хозяйства клиническому обследованию было подвергнуто 9 тыс. гусей крупной серой, рейнской и итальянской пород в возрасте от 2 месяцев до 3 лет. Проявление болезни регистрировали визуально. При этом определяли цвет, состояние слизистой клоаки, пениса, величину органа и его консистенцию.
Для экспериментальных исследований использовали гусей крупной серой, рейнской и итальянской пород из опытного хозяйства "Борки".
Гуси крупной оерой породы созданы в УНИИП /борковская попу- 32 ляция/ на основе скрещивания роменских гуоей с тулузскими.
Рейнские белые гуси завезены в опытное хозяйство "Борки" в 1975 году из Резекненской птицефабрики Латвийской ССР.
Итальянские белые гуои завезены в 1982 году из колхоза "Большевик" Валковского района Харьковской области.
Птиц опытных групп содержали в виварии лаборатории профилактики болезней птиц УНИИП. Кормление проводили по нормам и рационам, рекомендованным ВНИТИП /1976/.
Первичную изоляцию возбудителя от спонтанно больной птицы проводили совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории Харьковского кожно-венерологического института. Материал для посева с эрозий t и язв отбирали влажным стерильным ватным тампоном непосредственно с пораженного органа. Патматериал наносили на поверхность питательного агара с добавлением 20$ лошадиной сыворотки, разлитого в чашках Петри, а также на МПА, МПБ, агар Эндо, 5% кровяной агар.
Для культивирования изолированных грамотрицательных диплококков использовали 3% мясо-пепгонный агар, приготовленный из водного экстракта бычьего сердца и печени на мартеновском пептоне. Указанная среда выпускается заводом бактерийных препаратов Харьковского научно-исследрвагельского института микробиологии, вакцин и сывороток им.й.М.Мечникова. Перед применением к питательному агару добавляли 2.0% асцитической жидкости или такое же количество сыворотки лошадей, гусей либо крупного рогатого скота. Посевы выдерживали при 37С в условиях термостата. Для культивирования использовали также агар Хоттингера с содержанием аминного азота до 120 мг% и 5-10% кровяной агар /рН среды 7,2-7,6/. Засеянные пробирки помещали в эксикатор, где создавали анаэробные условия путем добавления 1,5 г двууглекислой соды к б мл I № раст/вора серной кислоты на сосуд объемом 3 л. Крышку эксикатора, смазанную ланолином, плотно притирали и ставили в термостат. Через 24 часа производили осмотр выросших колоний, определяли их форму, характер роста, наличие пигмента. Всего изучена 31 культура грамотрипа тельных диплококков, их морфологические, биохимические, антигенные свойства, чувствительность к некоторым антибиотикам, патогенность для домашней птицы и эмбрионов /гуоей, уток, кур/.
Морфологию микроба изучали путем микроскопии мазков из суточной агаровой культуры, окрашенных по Граму. Для определения их ультраструктуры, плотный осадок бактерий, полученный в результате смыва 24-часовой агаровой культуры физиологическим раствором и последующего центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10-15 мин., фиксировали 5% раствором глутаральдегида на фосфатном буфере и выдерживали в течение 2 ч при +4С /на холоду/. Повторную фиксацию проводили раствором четырехокиси осмия на фосфатном буфере в течение 2 ч. Пр.:- истечении этого времени материал проводили через спирты в возрастающей концентрации /50,75,96,100/ с экспозицией 12-24 ч. С обезвоженных образцов последнюю порцию абсолютного спирта удаляли пипеткой. К проведенному через эпоксипропан микробному осадку добавляли эпон-аралдитовую смесь в соотношении 2:1 и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Срезы готовили на ульграмикрогоме !,УМТП-3". Контрастирование проводили 50% спиртовым раствором уранилацетата в течение 30 мин и раствором азотнокислого свинца. Контрастированные срезы просматривали под электронным микроскопом УЭМВ-ЮОК при увеличении х15000 крат. Работу выполняли в лаборатории электронной микроскопии Харьковского медицинского института.
Наличие капсул у микробов определяли по Бури. Отдельные мазки окращивали по методу Гинса /М.О.Биргер,1982/.
Биохимические свойства. Микроорганизмы рода Neisseria образуют ферменты оксидазу и каталазу. Реакция на оксидазу заключается в нанесении пастеровской пипеткой 1% водного раствора №-диме-тил-нфенилендиаминдигидрохлорида в количестве 1-2 капель непосредственно на поверхность суточной агаровой культуры микроба. Появление розового окрашивания, переходящего в красный, а затем в черный, свидетельствовало о положительной пробе. Для этой реакции можно использовать бумажные диски (Ж /система индикаторная бумажная/ производства Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии /З.М.Андреева и соавт.,1983/.
Реакция на каталазу. На колонию суточной культуры микроба наносили 1-2 капли 10% перекиси водорода. Выделение пузырьков газа свидетельствовало о положительной реакции.
Биохимические свойства изучали по способности культур ферментировать углеводы /глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, лактозу, маннит, ксилозу, арабинозу, дульцит, рамнозу, крахмал, сорбит/. Индикатором служил феноловый красный. На 100 мл Шк добавляли 50 мл сыворотки, б мл фенолового красного в разведении 1:500; 1,5 г углевода. При добавлении всех компонентов раствор должен быть малиновой окраски или цвета спелой вишни. Положительной реакцию считали при изменении малинового цвета среды в желтый через 18-24 ч со времени посева.
Параллельно проводили исследования сахаролитической активности НеЙССерИЙ На Среде ДЛЯ уГЛевОДОВ ПО ПРОПИСИ Juhlin /1963/, в состав которой входят: Z,Z/o плацентарного агара с индикатором феноловый красный; 0,9% углевода; 0,001% кокарбоксилазы и 30% ас-цитической жидкости.
Реакцию со щавелевой кислотой проводили с помощью индикаторной бумаги на индол по Морелю. Реакция считалась положительной, если нижняя часть бумаги окрашивалась в розовый цвет.
Обнаружение сероводорода. Применяли обычный способ, учитывающий потемнение фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца. Почернение нижней части бумаги свидетельствовало о положительной реакции.
Культуральные свойства
Изолированные от спонтанно больных гусей культуры нейссерий были аэробами /N.canis, N.caviae, N.species В/ или факультативными анаэробами /N.species А/. Они хорошо росли на питательных средах, содержащих до 20$ сыворотки, или на кровяном агаре с добавлением 5-10$ крови, а также на средах с содержанием 120 мг$ аминного азота при оптимальной температуре Зб-37С, рост также отмечен и при 22с. /табл.3/. На простых питательных средах /МПА, МПБ/ культуры не росли. На плотных сывороточных средах /агаре Хоттингера, % кровяном агаре/ колонии появлялись через 18-24 ч. роста в виде нежных, прозрачных, бесцветных или слегка сероватых, похожих на капельки росы образований диаметром до 2 мм. Края колоний ровные, поверхность гладкая, блестящая. Интенсивность роста колоний в значительной мере зависела от состава питательной среды и ее рН. При посеве на кровяной агар зона гемолиза отсутствовала. Колонии вида N.canis на среде Хоттингера через 24 ч. образовывали пигмент /рис.5/. В зависимости от периода роста, цвет пигмента менялся от желтого до коричневого. Культуры были нестойкие и по иотечении 24-48 ч. подвергались лизису.
На жидких питательных средах /сывороточный бульон, среда Китт-Тароцци/ культуры давали слабое помутнение с образованием тонкой пленки, которая по истечении 2-3 суток оседала на дно пробирки, образуя небольшой осадок.
Биохимические особенности выделенных микроорганизмов изучали по 27 тестам. Суммарные данные приведены в таблице 4.
Выделенные от больных гусей грамогрицательные диплококки давали положительную реакцию на оксидазу /рис.б/ и кагалазу, не разжижали желатин при 22 С, что сходно с гонококком. Два штамма I.canisи N.caviae не ферментировали углеводы /глюкозу, лактозу, мальтозу, манниг, сахарозу, фруктозу, сорбит, дульциг, ксилозу, крахмал, рамнозу, арабинозу/; штамм N.species А образовывал кислоту из глюкозы и сахарозы в малом пестром ряду по Juhiin y редуцировал нитраты и нитриты. Штамм N.canis редуцировал нитраты, а штамм N.ca-viae нитраты в нитриты до образования свободного азота. Штамм N.species в І. обладал способностью ферментировать глюкозу, сахарозу и фруктозу с образованием газа и кислоты как на пестром ряде по Juhiin, так и на большом пестром ряде, а также редуцировал нитраты и нитриты.
На основании изучения биохимических свойств, согласно международной классификации бактерий Д.Берги /1974/» штаммы N. species А и N.species в не могут быть отнесены к известным видам рода Neisseria.
Антигенные свойства Гипериммунизация кроликов убитыми культурами нейссерий /ы.са vJ.ae, N.canis, N.species А., N.species В/аИНДуцировала ИММУНОЛОГИ-ческий ответ. Внутривенные инъекции живой суточной культуры нейссерий животным не увенчались успехом, кролики погибали через 24 часа. Первое введение инактивированной культуры сопровождалось общим угнетением животного, расстройством желудочно-кишечного тракта, у отдельных кроликов отмечали паралич задних конечностей. Реакция организма на антиген продолжалась 3-4 дня. При повторной иммунизации каких-либо отклонений от нормы не наблюдали. Через 7 дней после последней инъекции в сыворотке крови в РА были выявлены антитела. Положительная реакция с гомологичным антигеном характеризовалась появлением мелко- или крупнозернистой хлопьевидной агглютинации в течение 2 минут. В РИГА на 7 день были обнаружены антитела в разве 59 дении сыворотки 1:160-1:640, на 19 день они достигли уровня 1:10240. Такой уровень иммунной отзывчивости свидетельствует о высокой антигенной активности изучаемых штаммов. Результаты исследований гипериммунной сыворотки на специфичность представлены в таблице 5. Согласно данным таблицы, гипериммунные сыворотки кроликов положительно реагировали с гомологичными антигенами и вступали в перекрестные реакции с испытуемыми штаммами нейссерий, в том числе с представителями патогенных /N.gonorrhoeae/ и непатогенных /N.per-flava/ видов. Полученные положительные результаты в перекрестной
РА С N.gonorrhoeae И N.perflava еще раз подтверждают принадлежность изучаемых штаммов к роду Neisseria. Однако с менингокок-ковой поливалентной сывороткой получена отрицательная реакция, что указывает на существенное различие внутри рода Neisseria. О высокой специфичности испытуемых оывороток свидетельствует получение отрицательных результатов с антигенами s.typhimurium, E.coli /cep.OjQj/, стафилококков и энтерококков.
Степень антигенного родства между нейссериями, выделенными от гусей, и N.gonorrhoeae /возбудителем гонореи человека/ устанавливали в реакции непрямой гемагглютинации /РИГА/ /таб.6/.
Данные, представленные в таблице свидетельствуют о том, что степень антигенного родства между отдельными штаммами нейссерий, изолированными от гусей, выражена различно. Наиболее близкородственными в антигенном отношении оказались штаммы N. species А и N. species в, которые реагировали в перекрестной реакции с антисы-воротками этих культур в разведении 1:2560. В то же время штаммы N.canis и N.caviae проявили отдаленное родство со штаммами N.species А и N.species в. Они реагировали с их антисыворотками в разведении 1:40-1:160. Аналогичные результаты получены в РИГА ан ГИСывороток штаммов N.canis И N.caviae С. антигенами N.species А и N. species
