Введение к работе
Актуальность темы. В послелнке годы эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей (ЭГБО) широко распространилась а странах Азшг Севернойи Южной Америк, Австралии и вплотную приблизившись к границам Содружества. Болезнъ зарегистрирована в Турции и Японии; неблагополучие по ЭГБО в Турции создает потенциальную угрозу попадания вируса в Грузию и далее к нашім границам. Наибольшая яе угроза существует со сторонч Турции, Японии и США.
Вирус ЭГБО, вызывающий это заболевание, по своим бдагогичео-
ким свойствам тлеет относительное сходство с вирусом блютанга
(Campbell, 1985). Однако антитела, специфичные к вирусу .ЭГБО,
достаточно часто выявляют у КРС и овец; а антитела специфичные к
вируоу блютанга, обнаруживают у оленей (Luedke, 1970,1984,
Campbell, 1985). '' ' .
. Между вирусами ЭГБО и блютанга существует антигенное родство, поэтому положительны результаты определения антител к ним любым ганвечциональнш серологическим методом, за исключением реакции нейтрализации, не может служить однозначным доказательством инфи-нировашгости животных именно тем или другим вирусом. Дополнительной трудностью является наличие а ееротипов вируса ЭГБО и 24 се-ротипов вируса блютанга (Schultz, Grieder , .1987), что крайне усложняет проведение и интерпретацииі ?Н* а,- сл другой стороны, практически полное сходство вирусов ЭГБО и блютанга по фиэико-хи-.мческіш свойствам (In&ba, 1975), что исключает возможность их зиФФеренциации физико-химическими методами, в том числе методами электронной микроскопии.
Для лабораторной диагностики ЭГБО разработаны РЯ, РДП, PCR и ЙА (Campbell,; 1978,1985,1986; Della-Porta. 1982,1983,1985; reldner, 1981; Fosberg, 1977,1982; Glbbs, 1977; Goraoles, .988; Guimt. 1984; Pearson. 1979; Thomas. 1970. 1971.1978). Однако
каждый из методов имеет недостатки в плана чувствительности, воспроизводимости, акспрессности и технической простоты постановки. Разработка альтернативного метода исследования, лишенного хота бы большинства таких недостатков, могла бы создать эффективный способ диагностики ЗГБО и эпиаоотологического контроля га распространением этих болезней.
Разрабатываемые в последние годы методы твердофазного иммуно-ферментного анализа (ТФ ИФА) нашли широкое применение в медицинской и ветеринарной практике, в том числе при диагностике арбови-русных инфекций (Иаппіпг, 1880; Hubshle, 1981; СЯ. Гайдамович, 1984), и оценены как наиболее перспективные в ближайшее десятилетие для практической лабораторной диагностики (А.А. Воробьёв, 1987).
Цель и вадачв исследования. Целью ваших исследований являлось равработка средств и методов лабораторное диагностики эпизоотической геморрагической болезни оленей я их сравнительная оценка.
Для достижения указанной шли необходимо было решить следующие задача
разработать технологию получения и стандартизации иммуноре-агентов для диагностики ЭГБО методами РОК, РДП, РЗГА и ТФ ИФА;
определить оптимальные условия постановки РСК, РДП, РГА, РЗГА и ТФ ОД для обнаружения специфических антигенов и антител при ЭГБО;
дать сравнительную оценку, разработанных вариантов ТФ ИФА с другими серологическими методами;
получить моноюовальнь» антитела к антигенам вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и оценить их эффективность для изготовления диагностикумов;
. - определить пригодность разработанных вариантов ТФ ИФА для дифференциальной диагностики ЭГБО и блюгавга;
- изучить антигенное родство вирусов серогрулл ЭГБО и блотан-
га.
Научная новизна В результате проведённых исследований полу-Ччци данные о возможности получения сахарозо-ацетоноьоро антигена дад реакций связывания комплемента и ТФ ИФА.а тау»; гуттурального антигена для реакции диффузионной преципитации, реакции ге-ыц-глстинании и задержки гемагглотинации, шмуноферменгного анализа- с целью применения их при проведения = -лабораторній исследований по диагностике ЭГБО.
Научная новизна проведённых исследований состоит в том, -по:
отработаны условия получения универсального культурального антигена вируса ЭГБО, пригодного для использования в РДП, РСК и ТФ ЙФА;
разработан способ получения очищенного культурального антигена для применения его в РГА И ГЗГА;
установлено, что непрямой вариант ТФ ИФА с использованием специфического антигена из мозга мышат-сосунов, изготовленного четодом сахарозо-алетоновой экстракции и антивидовых иммуноперок-слдазных конъюгатив против IgG оленя, крупного рогатого скота и овец, позволяет обнаруживать специфичные к вирусу ануиуела в сыворотках' крови чувствительных видов животных и служить основным методом эпизоотологического мониторинга:
получены моноклональные антитела к антигенцм ЭГЕО, использование которых для сенсибилизации твердой фазы щ лцигоговлепия пероксидазных конгюгатов псзволилс достичь строгой специфичности ТФ йФА при ЭГБО: . -.
разработан "Сэндвич"-вариант TQ ИФА на основе мсноклональ-ных антител для обнаружения специфического антигена вируса ЭГЕО:
определены сптимальные условия, для постановку РГА и РТГЛ-для выявления специфических антигена и антител;-
- 4 -О
- показана возможность применения разработанных "Сэндвич"- и непрямого варианта ТФ ИФА, РГА и РЗГА для дифференциальной диагностики ЭГБО и блютанга.
Практическая значимость. На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для диагностических целей чувствительные, специфичные, высокопроизводительные и экспрессные методы ТФ ИФА, РГА и РЗГА. предназначенные для выявления специфического антигена вируса ЭГБО в Еируссодержадих культуральных материалах, а также для обнаружения специфичных к вирусу ЭГБО антител в сыворотках крови переболевших оленей, крупного рогатого скота и овец.
Разработана нормативно-техническая документация на "Набор диагностических препаратов для выявления антител ііри ЭГБО непрямым вариантом твердофазного иммуноферментного анализа" и "Набор диагностических препаратов для для выявления антигена вируса ЭГБО "Сэндвич"-вариантом твердофазного иммуноферментного анализа" (Временная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и Наставление по применению), и "Методические указания по обнаружению антител к вирусу ЭГЕО непрямым вариантом твердофазным иммуноферментным анализом", "Мэтодичэские указания по обнаружению
антигена вируса ЭГЕО "Сэндвич"-ьариантом твердофазным иммунофер-і" . . ментным анализом", утвержденные директором ВНИИВВиМ.
Метод ТФ ИФА применён во ВНИИВВиМ. для широкого скрининга антител в сыворотках крови оленей, крупного рогатого скота и овец иа хозяйств различных регионов страны ( 628 проб ).
Предложены "Методические указания для лабораторной диагностики ЭГБО РГА и РЗГА".
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на
защиту:
- результаты экспериментов по определению оптимальных, условий получения специфических культуральных антигенов, пригодных для
применения в лабораторной диагностики ЭГБО методами ТФ ЯФА, РГА и
РЗГА, РДП И РСК;
непрямой вариант ТФ ИФА, включашяе использование специфического сахарозо-ацетоновых антигена, антивидовых ишіуноперокси-дазных конъюгатов и казеин-мертиолятного буфера, обеспечивает уровень чувствитрлъности и специфичности, достаточный для диагностики и зпизоотологического мониторинга ЭГБО;
"сэидвич"-вэриант ТФ ИФА , разработанный на основе применения ьшсклональных антнтел, позволяет выявлять антигены вируса ЭГБО и превосходит аналогичный метод, разработанный на основе использования поликлональных антител, выделенных из сывороток и ИАЖ;
данные по изучению антигенного родства вирусов серогрупп ЭГБО и блотанга в серологических реакциях.
Апробация работы. Материалы диссертации додоягпы на научных когойеренциях ВНИИЬВиМ [1991, 1992) и на заседаниях ученого совета ЕНИИВВиМ (1990-19921Т).
Публикации. По теме диссертации опубликовано И научных работ.
Объем работы. Диссертация изложена на 145 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собствепные исследования, обсуждение, выводы, практические предлояэния и список литературы ( 244 источников, в том числе 29 отечественных}. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 12 риоунками я дополнена приложениями.
