Содержание к диссертации
1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Бактериальные болезни птиц на современном этапе промышленного птицеводства
1.2. Сальмонёлла-энтеритидис инфекция птиц. Биология возбудителя, эпидемиологические, эпизоотологические и экологические аспекты
Клинические, патологоанатомические изменения, лечение и профилактика
1.3. Биологические свойства бактериофагов
1.4. Применение бактериофагов для лечения бактериальных болезней в ветеринарии и сравнительная характеристика влияния бактериофагов и антибиотиков на организм животных
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.1. Методика приготовления питательных сред для определения фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus
2.1.2. Методика выделения бактериофагов из внутренних органов птицы и сточных вод
2.1.3. Методика определения фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus
2.1.4. Методика определения концентрации живых микроорганизмов путём высева на плотные питательные среды
2.1.5. Методика определения титра бактериофага по Аппельману и по Грациа
2.1.6. Методика определения чувствительности культур к выделенному бактериофагу и спектра литической активности фагов по Отто
2.1.7. Методика электронной микроскопии выделенного бактериофага
2.1.8. Методика определения стерильности бактериофага
2.1.9. Методика определения безвредности бактериофага на модели суточных цыплят и куриных эмбрионов
2.1.10. Методика определения активности бактериофага в лабораторных условиях на модели суточных и 60-ти дневных цыплят
2.1.11. Методика определения достоверности различий результатов опыта и контроля
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Выделение бактериофагов
2.2.2. Определение фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus и Escherichia coli на различных плотных питательных средах
2.2.2.1. Определение фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis
2.2.2.2. Определение фазы логарифмического роста Staphylococcus aureus
2.2.2.3. Определение фазы логарифмического роста Escherichia coli
2.2.3. Биологические свойства и выделенных бактериофагов
2.2.4. Электронная микроскопия выделенного бактериофага «IBP-1» против Salmonella enteritidis
2.2.5. Изучение активности сальмонеллёзного и стафилококкового бактериофагов в экспериментальных условиях
2.2.6. Изучение активности бактериофага «IBP-1» против сальмонеллаэнтеритидис инфекции птиц в производственных условиях
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Введение к работе
Актуальность темы: Интенсивное развитие птицеводства - одной из крупнейших отраслей сельского хозяйства, сдерживается широким распространением инфекционных заболеваний (Косякова Г.П., Дуценко Н.Н., Маенкова СИ., 2007г). Среди болезней, общих для человека и животных, бактериальные болезни занимают ведущ;ее место. Наличие их в хозяйстве негативно сказывается не только на эпизоотической ситуации, но и на экономике предприятия (Борисенкова А.Н., 2007). Наибольшая роль отводится сальмонеллёзам. В течение последних почти трёх десятилетий доминирующим серовариантом, вызывающим заболевание людей и циркулирующим в птицехозяйствах, является Salmonella enteritidis.
По сложности эпизоотологии, эпидемиологии и трудностям борьбы сальмонеллёз не имеет себе равных среди зоонозов (Новикова О.Б., 2007г).
Сальмонеллы — эпидемиологически опасные микроорганизмы, способные вызывать крупные вспышки инфекции среди людей. Резкий и значительный подъём заболеваемости сальмонеллёзом в разных странах в 80-90-х годах прошлого столетия был оценен экспертами ВОЗ как «пандемия».
Этиологическая структура возбудителей, выделенных от заболевших, свидетельствует о преобладании сальмонеллы энтеритидис — 90% (А.Н. Пережогин, 2007).
Статистический мониторинг и анализ данных ветеринарных отчетов выявили возрастание числа неблагополучных по сальмонеллезу пунктов в РФ: от 60-ти в 1991 г. до 170-ти в 2001 г. Летальность от сальмонеллёза в пересчете на общее поголовье заболевших кур в РФ составила: 23,6 % в 1998 г.; 13,7 % в 1999г.; 25 % в 2000г; 23,3 % в 2001 году. Летальность среди цыплят до 30-ти дневного возраста превысила 40 % (Пименов Н.В., 2003). В 1990 году распространение Salmonella enteritidis по миру воспринималось как пандемия (D. Rodrique, R. Tauxe, В. Rowe,1990).
Для профилактики сальмонеллёза в промышленном птицеводстве разработана система контроля (Борисенкова А.Н., 2001, 2004), включающая в себя 9 основных этапов, в т.ч. контроль с применением эффективных антибактериальных препаратов, сульфаниламидов и нитрофуранов.
Существенным недостатком антибиотикотерапии является снижение иммунных сил организма птиц, негативное влияние на качество продукции, быстрое привыкание патогенных микроорганизмов к лекарственным препаратам. Применение антибиотиков, нитрофуранов и фторхинолонов привело к селекции резистентных возбудителей инфекционных болезней животных(Соок Mark Е., 2001 г). Появление антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов привело к неэффективности лечения бактериальных болезней у животных, к увеличению заболеваемости и смертности и, как следствие, к продолжительному бактерионосительству.
Антибиотикорезистентность появляется у многих видов возбудителей, таких как Escherichia coli, Salmonella enteritidis (Piddock L.„ 2002; Забровская A.B., Кафтырева Л.А., Борисенкова А.Н. и др.,2007; Белов Л. П., Сорокин О.А. В связи с ограничениями, вводимыми на применение антибиотических препаратов (Джавадов Э.Д., 2007) еще более актуальным является вопрос о включении бактериофагов в противоэпизоотические мероприятия в промышленном птицеводстве.
В связи с этим в ветеринарной практике все более широкое применение находят экологически безопасные методы лечения, которые в комплексе с другими лечебными мероприятиями часто дают более высокий терапевтический эффект. К последним относят и бактериофаготерапию (Косякова Г.П., Дуценко Н.Н., Маенкова СИ., 2007г).
За последние годы в ветеринарной практике с целью диагностики (Гаврилов В.А., Васильев Г.Г., Литусов Н.В. и др., 2004), лечения (Натидзе М., Ригвава С, Толкликишвили Т.,2004; Леонтьева И.А,, 2004;Розовенко Л.Н., 2005) и профилактики болезней стали широко применяться бактериофаги (Barrow and Soothill, 1997).
Levin и Bull (1996) и Broxmayer Lawrence (2004), опубликовали обзоры работ по применению фаготерапии у животных, выполненных в Великобритании и США. Бактериофаги строго специфичны и воздействуют только на те микроорганизмы, которые вызвали инфекционное заболевание, не приводя к дисбактериозу, как это происходит при применении антибиотиков, нитрофуранов и фторхинолонов (Кереселидзе М., Габисония Т., Лоладзе М., Мелашвили Г., Дидебулидзе К., Макадзе И., 2006).
Цель работы. Целью настоящих исследований явилось выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц, изучение их биологических свойств и применение против сальмонеллёза и стафилококкоза птиц.
Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
• освоить методику выделения, выделить бактериофаги из внутренних органов птицы и сточных вод и предложить оптимальную питательную среду для получения максимального количества бактериальной массы культуркормилок;
• определить фазу логарифмического роста чувствительных к бактериофагам культур-кормилок Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus для максимального выделения бактериофагов;
• провести электронную микроскопию полученного бактериофага против Salmonella enteritidis и изучить его биологические свойства;
• изучить безвредность и эффективность выделенных бактериофагов в экспериментальных и производственных (на ограниченном поголовье) условиях.
разработать методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.
Научная новизна. Впервые выделены бактериофаги из внутренних органов гусей против Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus и из сточных вод гусеводческого хозяйства против Pseudomonas aeruginosa.
Впервые в сравнительном аспекте была определена фаза логарифмического роста Salmonella enteritidis^ Escherichia coli и Staphylococcus aureus при культивировании на агаре из панциря криля (АПК), агаре из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонном агаре (МПА) и модифицированных нами средах: кровяном агаре Левинталя (МПАкр), среде Блаурокка (АПБ) и агаре на основе мяса курицы (КА), Установлены сроки наступления фаз логарифмического роста и выхода бактериальной массы для этих культур в зависимости от питательности среды.
Предложена методика качественного определения чувствительности исследуемых культур к бактериофагам методом дисков.
Изучена эффективность выделенных бактериофагов в отношении Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus методом выпаивания цыплятам разного возраста в экспериментальных условиях.
Показана эффективность применения выделенного нами бактериофага «IBP-1» против-сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях; Получен патент на штамм бактериофага «IBP-1» против сальмонеллаэнтеритидис инфекции птиц.
Практическая значимость. Разработанные «Методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц» и качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий.
Предложенная нами питательная среда для получения бактериальной массы культур-кормилок в процессе изготовления бактериофага может быть приготовлена и использована в лабораторных условиях птицехозяйств; Предложенный нами бактериофаг против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц «IBP-1» можно рекомендовать как эффективную альтернативу антибиотикам.
Основные положения, выносимые на защиту:
• методика выделения бактериофага из внутренних органов птицы и сточных вод;
• определение фазы логарифмического роста чувствительных к фагам культур-кормилок Salmonella enteritidis, Escherichia соН и Staphylococcus aureus при культивировании на агаре из панциря криля (АПК), агаре из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонном агаре (МПА) и модифицированных нами средах: кровяном агаре Левинталя (МПАкр), среде Блаурокка (АПБ) и агаре на основе мяса курицы (КА);
• бактериофаг «IBP-1» против Salmonella enteritidis инфекции птиц;
• качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов;
• методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований заслушаны на заседаниях Методических Советов отделов микробиологии и паразитологии ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); Учёных Советов ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); на конференции-школе молодых ученых и аспирантов Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии (Санкт-Петербург - Пушкин, 2005 г.); на XIX Международной научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2007г.); на научно-практической конференции «Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы», посвященной памяти академика Росссельхозакадемии Р.Н.Коровина (5-6 июня 2007 г., ГНУ ВНИВИП
Россельхозакадемии).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 27 рисунками, из них: 10 фотографий, 7 таблиц, 10 графиков. Список использованной литературы включает 219 источников, в том числе 56 работ иностранных авторов.
