Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Распространение и источники вируса бешенства 9
1.2.Биологические свойства возбудителя бешенства 12
1.3 .Методы диагностики и эпизоотологического мониторинга бешенства 15
1 4 Профилактика и меры борьбы с бешенством 30
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1.Материалы и методы исследований 34
2.1.1 . Материалы исследований 34
2.1.2.Методы исследований 36
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
3.1. Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Татарстан 39
3.2.Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для
контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства 47
3.3. Анализ ситуации, мер борьбы с бешенством и совершенствование эпизоотолого-эпидемиологического надзора за
ним в Республике Татарстан 53
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 103
Выводы 127
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 129
Список ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 130
ПРИЛОЖЕНИЕ 158
- Распространение и источники вируса бешенства
- Материалы исследований
- Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Татарстан
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на определенные достижения в изучении бешенства, борьба с этим зоонозом продолжает оставаться важной проблемой ветеринарии и медицины.
В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди различных видов животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом (Ведерников В.А. и соавт., 2002; Хадарцев О.С. и соавт., 2006 и др.).
Научно обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемические мероприятия, по данным ряда авторов (Хисматуллина Н.А. и соавт., 1995; Авилов B.C. и соавт. 1998; Иванов А.В. и соавт., 2005) должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии, прогнозировании ситуации по этому зоонозу, своевременном выявлении возбудителя бешенства и изучении его биологических свойств, а также контроле иммунного состоянием животных и людей, вакцинированных против бешенства.
В последнее время показана также перспективность использования твердофазного ИФА для обнаружения антител в сыворотке крови людей, привитых антирабическими вакцинами, а также у иммунизированных животных (Сазанова Э.Я. и соавт., 1988; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1990; Atanasiu P. et al., 1977; Nicholson К. et al., 1982 и др.).
Вместе с тем, совершенствование эпизоотолого-эпидемиологического надзора за бешенством, а также разработка новых средств контроля эффективности вакцинопрофилактики этого зооноза по-прежнему остаются актуальными.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить иммунобиологические свойства эпизоотических изолятов рабического вируса, циркулирующих на территории Республики Татарстан (РТ) и
6 усовершенствовать эпизоотолого-эпидемиологический надзор за бешенством.
Исходя из поставленной цели, решались следующие задачи:
Провести идентификацию и изучить иммунобиологические свойства эпизоотических изолятов рабического вируса, циркулирующих на территории РТ.
Разработать иммуноферментную тест-систему на основе гликопротеина рабического вируса для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства.
3. Изучить эпизоотолого-эпидемиологическую ситуацию по
бешенству в Республике Татарстан за период 1997 - 2005 гг.
4. Изучить влияние биотических и абиотических факторов на
энзоотию бешенства в РТ для прогнозирования ситуации по данному
заболеванию.
Научная новизна. Впервые изучены иммунобиологические свойства эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Татарстан. Установлено антигенное родство их с вакцинным штаммом «Овечий» ГНКИ рабического вируса. Показана возможность применения средств и методов, разработанных в ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» на основе поликлональных антител к вакцинному штамму «Овечий» ГНКИ для прижизненной диагностики бешенства.
Впервые разработана и апробирована иммуноферментная тест-система на основе гликопротеина для контроля уровня специфических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных и людей.
Проведен ветеринарно-географический анализ распространения бешенства на территории Татарстана за 1997-2005 гг., разработана карта эпизоотологического районирования территории республики. Представлена математическая модель прогнозирования энзоотии бешенства в Республике Татарстан.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований вошли в «Наставление по применению набора препаратов для выявления антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства методом иммуноферментного анализа» (от 21.11.2003г.) и Методическое руководство «Эпизоотолого-эпидемиологический надзор за бешенством» (от 4.07.2006 г.), утвержденные в установленном порядке.
Апробация результатов исследований. Основные положения диссертации доложены на: 1) Ежегодных отчетных научных сессиях ФГУ «ВНИВИ-ФЦТРБ» по итогам НИР а также ежегодных семинарах-совещаниях с врачами хирургами и эпидемиологами районов и городов Республики Татарстан за 2002-2006 гг.; 2) Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию создания ВНИИВВиМ «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (Покров, 2003); 3) Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИВИ (Казань, 2005); 4) Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); 5) Первой международной конференции «Бешенство в Европе» (Киев, 2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
-выделение и идентификация эпизоотических изолятов возбудителя бешенства, циркулирующих на территории РТ, изучение их иммунобиологических свойств и соответствия вакцинному штамму;
-разработка и применение иммуноферментной тест-системы для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства;
-характеристика эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по заболеваемости бешенством в Татарстане за 1997-2005 гг. и районирование территории республики по степени распространения заболевания;
-разработка математической модели прогнозирования энзоотии бешенства по биотическим и абиотическим факторам;
-усовершенствование мероприятий по эпизоотолого-эпидеми-ологическому надзору за бешенством.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы (всего 240 источников, в том числе 68 иностранных) и приложение. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 9 рисунками.
Распространение и источники вируса бешенства
Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира, где ежегодно свыше 10 млн. человек получают различные повреждения от животных и более 4 млн. человек - специфическую антира-бическую помощь (Черкасский Б.Л. и соавт., 2003).
Бешенство встречается как в тропических, так и полярных широтах. Были выделены штаммы лиссаподобных вирусов в Австралии и Великобритании, считающиеся свободными от этой инфекции (Tsiang Н., 1995).
Сегодня известны районы мира, наиболее опасные по бешенству: значительные территории в Южной Америке, обширные районы США, Канады, Центральной Европы, некоторые регионы Африки и Среднего Востока (Таршис М.Г. и соавт., 1990; Крупальник В.П. и соавт., 1995; Селимов М.А., 1998; Zimmermann Th., 1971; Barrat I., 1990; Aubert M., 1993; Nadin-Davis S.A., 1993; Cortes Valdson de Angelis, 1994; Cleaveland S., 1995; Casey G.A., 1996; Kat P.W., 1995; Martorella Luzia Fatima Alves, 1996; Thraenhart 0., 1996;).
Несколько десятилетий назад бешенство было типичной болезнью собак. В настоящее время в его распространении увеличилась роль диких животных. В Европе как переносчики бешенства опасны лисицы и енотовидные собаки (Шустерман С.З. и соавт., 1987; Адамович В.Л. и соавт., 1995; Большаков И.М., 1996; Павлов М.П., 1999;), в Америке - скунсы, лисицы, летучие мыши-вампиры, передающие скоту паралитическую форму бешенства (Nandi S., Maiti S., 1994), а в Африке - шакалы, мангусты, гиены и другие животные. В тоже время собака по-прежнему остается основным источником рабической инфекции в Азии, Африке и некоторых странах Латинской Америки, где за год погибают от бешенства до 35 тыс., 5 тыс. и 200 человек соответственно. (Селимов М.А., 1998; Rohman А., 1997). Современная ситуация по бешенству на территории стран СНГ и Российской Федерации (РФ) определяется, в основном, как эпизоотия природного типа. По данным ряда исследователей (Хисматуллина Н.А. и соавт., 2000; Ведерников В.А. и соавт., 2005), главным резервуаром и распространителем рабического вируса была и остается лисица. В последние годы выявляли бешенство и у других хищников - волков, хорьков, корсаков, куниц, диких кошек и норок. Продолжался рост заболеваемости барсука. Бешенство диагностировали у крыс, хомяков, лося, косули, белки, ондатры, кролика и летучей мыши. Такая картина типична для периода подъема природной эпизоотии (Ведерников В.А, Балдина И.В., Шабейкин А.А. и др., 2002).
Прямым следствием подъема природной эпизоотии явилось учащение случаев заболевания собак и кошек. Ни одно из погибших домашних животных не было вакцинировано. Важен и другой факт - участилось выявление бешенства у бродячих, безнадзорных собак и кошек.
В целом в Российской Федерации за период с 2001 по 2005 гг. произошел рост количества случаев заболевания бешенством среди животных в 2 раза с 2442 в 2001 году до 5253 в 2005 г. Наибольшее количество неблагополучных пунктов зарегистрировали среди КРС - 34,9%, диких зверей - 30,8%, собак - 18,3%, кошек - 9,5%, мелкого рогатого скота, лошадей и свиней - менее 4%. Неблагополучие среди диких животных определяет на сегодняшний день ухудшение общего эпизоотического состояния регионов. В большинстве регионов России численность диких животных, и прежде всего лисиц, возросла в 1,5-2 раза. (Авилов В.М. и соавт., 2002; Хадарцев О.С. и соавт., 2006).
За последние пять лет в Российской Федерации в 67 субъектах отмечается рост количества случаев бешенства среди животных. Так, за 2001 год было зарегистрировано 2442, в 2002 г. - 3950, в 2003 г. - 4293, в 2004 г. -3268, в 2005 г. - 5253 случая бешенства. В Центральном федеральном округе РФ бешенство регистрировали в 17 из 18 субъектов. Сохранила благополучие лишь Костромская область.
Значительный рост заболеваемости среди диких животных в 2005 г. по сравнению с 2000 г. отмечался в Центральном и Приволжском федеральных округах в 3,2 - и 6,7 раза соответственно. Неблагополучная эпизоотическая обстановка сохранялась в Уральском, Сибирском, Южном, Северо-Западном и Дальневосточном федеральных округах.
Параллельно с заболеваемостью животных возросла и заболеваемость людей. Так, в целом по Российской Федерации за период с 2001 по 2005 гг. регистрируется ежегодно от 14 до 21 случая гидрофобии, тогда как за предыдущие 5 лет ежегодное число гидрофобии было в пределах от 7 до 12 случаев (Мовсесянц А.А., Агеенко Г.Б., 2002).
В то же время, по данным ряда исследователей (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1981 1988; Савицкий В.П. и соавт., 1982; Мальков Г.Б. и соавт., 1983;), в степной, лесостепной зонах и горных районах Сибири и Дальнего Востока основными природными резервуарами вируса бешенства и источниками заражения животных и людей являются волк, лисица, корсак и енотовидная собака.
Бешенство, как природно-очаговое заболевание характеризуют многие ученые (Ивановский Э.В., 1991; Седов В.А. и соавт., 1992; Юсупов Р.Х. и соавт., 1992). При изучении особенностей бешенства в определенных районах России ими обобщены: время, место вспышек эпизоотии, пути распространения. Все эти данные вносились в эпизоотологический кадастр неблагополучных пунктов. На основе картографирования обобщенного материала были определены пути и направления развития эпизоотии бешенства, что позволило установить определенную связь во времени и пространстве.
По данным ряда исследователей (Юсупов Р.Х. и соавт., 1992; Хисамутдинов Ф.Ф. и соавт., 1996; Хисматуллина Н.А. и соавт., 1995 -2000;), установлено, что Республика Татарстан неблагополучна по бешенству, где имеет место эпизоотия бешенства природного типа.
Источником инфекции являются дикие животные, главным образом лисицы, на долю которых среди заболевших бешенством диких животных приходится 89%. При этом отмечается 3-5-летняя цикличность с максимальным числом случаев в весенний период года (40%). Сезонность заболеваемости бешенством животных авторы связывают с биологией лисиц.
Неблагополучие по заболеваемости бешенством отмечается в областях и республиках, граничащих с Татарстаном: Башкортостане, Удмуртии, Марий Эл, Кировской области (Тятигачев Ш.А. и соавт., 1995; Патраков Г.Г. и соавт.,1996; Тятигачев Ш.А., 1998; Новокшонова Г.И., Кощеев А.П., 1999; Павлов М.П. 1999; Русских Г.А. и соавт., 1999; Григорьев Г.А. и соавт., 1999;).
Материалы исследований
1. В опытах использовали 2 штамма вируса бешенства: производственный, фиксированный - "Овечий" ГНКИ и стандартный - С VS.
2. В работе использовали животных: 5 овец, живой массой 40-50 кг; 20 кроликов 3,0-3,5 кг; 30 морских свинок 0,3-0,35 кг; 2000 белых мышей беспородных, живой массой 6-7 г.
3. В опытах применяли перевиваемую культуру клеток невриномы Гассерова узла крысы (Авцын А.В. и соавт.,1984).
4. Проводили исследования 58 проб патологоанатомического материала (головной мозг, подчелюстные слюнные железы), доставленного из неблагополучных по заболеваемости бешенством районов Татарстана, из них 21 - от сельскохозяйственных, 6- от домашних животных, 29 - от лисиц, а также 1 - от человека, поступившего из инфекционной больницы №1 г. Казани. Контролями в опытах служили суспензии головного мозга интактных белых мышей (контрольные отрицательные антигены), а также иммуноглобулин (Ig) сывороток крови неиммунизированных животных и человека. В качестве контрольных положительных антигенов использовали мозг белых мышей, зараженных вирусом бешенства (штамм "Овечий" ГНКИ). В качестве гетерологичного антигена - мозг мышей, зараженных вирусом болезни Ауески (штамм ВГНКИ). Все контрольные и испытуемые образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга или подчелюстных слюнных желез на 0,85%-ном физиологическом растворе с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800g в течение 15 мин, инактивировали при 56 С в течение 30 мин.
В опытах исследовали 12 проб сывороток крови людей, вакцинированных культуральной антирабической вакциной из штамма "Внуково-32", а также 44 пробы глазной жидкости лисиц, доставленных в период отстрела из неблагополучных по заболеваемости бешенством районов РТ, для определения антирабических антител.
5. В экспериментах использовали диагностические наборы препаратов, разработанные в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»: «Флуоресцирующий антирабический глобулин» (ТУ 9388-012-00492374-99) и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ТУ 9388 - 083 - 00008064-98), а также диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и человека, меченные пероксидазой хрена и флуоресцеинизотиоционатом производства НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи (Москва). Кроме того, для электрофореза в опытах применяли калибровочный набор белков (Pharmacia Biotech, США), блокирующий раствор "NEW LAV BLOT I R2", 5X ("Sanofi diagnostics pasteur" Франция) и др.
6.B исследованиях применяли следующее оборудование: спектрофотометр СФ-16; сканирующий спектрофотометр "Titertek multiskan" (Швейцария); центрифуги (различные); термостат; холодильные установки; световой микроскоп (Биолам); люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-И2, рН-метр; аналитические весы, автоматическую многоканальную пипетку с переменным объемом от 50 до 200 мкл.
Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Татарстан
Обнаружение и идентификацию антигена рабического вируса проводили методами ИФА, ИФ, РН, а выделение возбудителя бешенства - в культуре клеток НГУК-1 с применением диагностических препаратов, разработанных в ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ", г. Казань.
В качестве специфических антител применяли антирабический иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови овец, иммунизированных вакцинным штаммом «Овечий» ГНКИ вируса бешенства с индексом нейтрализации равным 2 и более.
Исследовали патологический материал от различных видов животных, поступивших с подозрением на бешенство из неблагополучных по заболеваемости бешенством районов Татарстана (Лаишевский, Сабинский, Арский, Кукморский, Мамадышский и др.).
Параллельно с ИФА и ИФ проводили биопробу на белых мышах. Всего исследовано 58 проб головного мозга различных видов животных из различных административных районов Татарстана.
Отмечено полное совпадение результатов ИФА и ИФ с биопробой на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1 (табл. 1).
Из данных таблицы 1 следует полное совпадение результатов методов ИФА, ИФ и биопробы на белых мышах. При этом титры специфического антигена уличного вируса бешенства, в зависимости от содержания его в патматериале, в ИФА варьировали в пределах от 1:10 до 1:160, при Ксп= 2,1 и более.
Изучаемые изоляты вируса бешенства выделялись в культуре клеток НГУК-1 с последующим обнаружением рабического антигена в реакции ИФ и ИФА через 72-96 часов после заражения без проявлений цитопатического действия.
При сравнительном исследовании 8 проб от животных, доставленных из различных административных районов РТ, установлено полное совпадение результатов биопробы на мышах и в культуре клеток. Антиген вируса бешенства в реакции ИФ выявлялся в цитоплазме клеток НГУК - 1 в виде ярких гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15-20 мкм в диаметре. Иногда отмечалось небольшое количество мелких желто-зеленых частиц ( размером до 0,5 мкм) округлой и овальной формы.
В контроле, где клетки НГУК -1 инкубировали с мозговой взвесью от клинически здоровых животных, при окрашивании их флуоресцирующим глобулином, специфических гранул не обнаруживали.
Примечание: "-"-отрицательный результат На следующем этапе экспериментов изучали патогенные свойства эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих в регионе. Экспериментальным заражением была установлена патогенность изучаемых изолятов для лабораторных животных - белых мышей, морских свинок и кроликов.
Специфичность клинических проявлений бешенства была подтверждена методами ИФА и ИФ. Результаты представлены в таблице 2.
Исследуемые изоляты вируса бешенства вызывали заболевания белых мышей с летальным исходом как при интрацеребральном, так и при подкожном способах заражения.
Продолжительность видимых проявлений болезни (взъерошенность шерсти, горбатость спины, тремор при поднятии на воздух пинцетом за кончик хвоста, нарушение координации движений задних конечностей, паралич), обычно составляла менее суток и в редких случаях - 2-3 суток.
Изучение степени патогенности проведено с изолятами вируса бешенства, выделенными из мозга лисиц Лаишевского, Апастовского, Атнинского, Мамадышского, собаки Тюлячинского, крупного рогатого скота Новошешминского, Заинского, барсука Верхнеуслонского районов Татарстана.
Из данных таблицы 3 видно различие эпизоотических изолятов по степени патогенности для лабораторных животных. Индекс инвазивности варьировал от 0,9 до 2,4. При этом инкубационный период уличных изолятов вируса бешенства варьировал в среднем от 12 до 27 суток. Следовательно, в Республике Татарстан циркулируют как высоко-, так и слабопатогенные штаммы вируса бешенства.
В последующих экспериментах было установлено, что изоляты вируса бешенства, выделенные из неблагополучных районов Татарстана (Лениногорский, Азнакаевский, Муслюмовский и др.) имеют ярко выраженное преципитирующие и комплементфиксирующие свойства с активностью в реакциях диффузионной преципитации и длительного связывания комплемента 1:2 - 1:8.
Прижизненная и постмортальная диагностика случая гидрофобии в Татарстане. В 2002 г. в Муслюмовском районе республики зарегистрирован случай гидрофобии. В данном разделе представлены результаты проведения лабораторных исследований проб, взятых от больной Б. при жизни и постмортально на наличие антигена вируса бешенства с использованием диагностических наборов препаратов, разработанных в ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" (г. Казань).
Исследования проведены прямым методом ИФ и сэндвич - вариантом ИФА, световой микроскопией (окраска по Селлерсу), а также непрямыми методами ИФ и ИФА. Лабораторными исследованиями методом прямой ИФ отпечатков с роговицы глаза пострадавшей в нескольких полях зрения был обнаружен специфический антиген вируса бешенства в виде типичных, отчетливо выраженных ярких, желто-зеленых гранул различной формы и величины с интенсивностью свечения в три креста. В контрольных препаратах подобных образований не отмечено.
Активность сыворотки крови у больной Б. составила в непрямом методе ИФ 1:10, оцениваемая в два креста и 1:10 в непрямом ИФА (Ксп=2,3).
Постмортальный анализ различных отделов головного мозга прямым методом ИФ дал положительный результат по обнаружению специфического антигена вируса бешенства, оцениваемый в крестах: в аммоновом роге -множество специфических комплексов-включений (+++); коре больших полушарий, мозжечке и продолговатом мозге - единичное количество ярко светящихся комплексов-включений (+++).
