Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Фенотипические и генотипические характеристики вируса бешенства 10
1.2 Эпизоотологические особенности бешенства 14
1.2.1 Распространенность бешенства в странах мира и Российской Федерации 14
1.2.2 Роль диких плотоядных, домашних и сельскохозяйственных животных в эпизоотологии бешенства 22
1.3 Специфическая профилактика бешенства 27
1.4 Заключение по обзору литературы 35
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1 Материалы й методы исследования исследований 37
2.1.1 Материалы исследований 3 7
2.1.2 Методы исследований 39
2.2 Результаты собственных исследований 44
2.2.1 Результаты изучения эпизоотической ситуации по бешенству в Республике Башкортостан 44
2.2.2 Лабораторная диагностика бешенства и изучение некоторых биологи-ческих свойств выделенных в Республике Башкортостан изолятов вируса 49
2.2.3 Модификация и применение непрямого варианта ИФА для определения специфических антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против бешенства 59
2.2.4 Усовершенствование системы противоэпизоотических мероприятий по борьбе с бешенством в РБ 66
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 77
ВЫВОДЫ 83
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 85
БИБЛИОГРАФИЯ 86
ПРИЛОЖЕНИЕ 109
- Фенотипические и генотипические характеристики вируса бешенства
- Материалы й методы исследования исследований
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Введение к работе
Актуальность темы. Реструктуризация сельскохозяйственного производства России неоднозначно отразилась на эпизоотическом состоянии животноводства и на эффективности противоэпизоотических мероприятий. Разработанные для социалистического строя и традиционно используемые сие-темы противоэпизоотического обеспечения животноводства в современных условиях оказались недостаточно действенными и надежными. В ряде субъектов Федерации возросли эпизоотическая и эпидемическая значимость зоо-нозных болезней, участились рецидивы хронических болезней животных.
К числу опасных зоонозов в РФ продолжают относиться бешенство более того - за последние годы в ряде регионов усложнилась эпизоотическая ситуация по этому зоонозу, выявлены регионы с его территориальной приуроченностью (Г. Н. Сидоров, 1995; А. В. Борисов, 2003; А. В. Савин, 2004; А. В. Иванов, 2006; С. В. Филатов, 2006).
Последние 50 лет ознаменовались в мире интенсивным развитием методологии в эпидемиологии и эпизоотологии, в систему противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий включены эпидемиологический и эпизоотический надзор. Уделяется должное внимание совершенствованию эпцзоотологической диагностики и эпизоотологического надзора при зоонозах (И.А. Бакулов, 1986; СИ. Джупина, 1983, 1991; В.П. Урбан, 1998; В.В. Макаров, 1999; В.В. Сочнев, 1998; A.M. Смирнов, 2004).
Сложилось мнение "о необходимости рассматривать заразные болезни животных не как случайное явление, а как отражение фило- и онтогенети-чески обусловленных взаимоотношений между популяциями макро- и микроорганизмов (В.В. Макаров, 1999).
Весьма актуальными для ветеринарной науки являются разработка и внедрение карт эпизоотологического надзора при зоонозах, особенностями которых являются специфичность и системный подход к конкретной нозоединице, как к сформировавшейся и функционирующей паразитарной системе. Однако
4 комплексный подход не всегда реализуется в практической ветеринарии.
По данным международных ветеринарных организаций, бешенство включено в группу трансмиссибельных болезней, имеющих существенное значение в области общественной экономики и здравоохранения в пределах конкретных стран мира, а также в организации международной торговли животными и животноводческими продуктами. В настоящее время эти зоонозы определяют эпизоотическое и эпидемическое состояние во многих странах мира, в том числе и в России, а в последние годы эпизоотическая ситуация по рабической инфекции приобрела тенденцию к усложнению. Активизируются аутохтонные и формируются антропургические очаги этой инфекции.
Несмотря на проводимые мероприятия в стране ограничить распространение рабической болезни, полностью ликвидировать бешенство животных на территории конкретных субъектов РФ до сих пор не удалось, а многие аспекты функционирования паразитарных систем бешенства до сих пор остаются недостаточно изученными (В.А. Седов, 1972; В.Ю. Литвинов, 1999; Н.А. Хисматуллина, 1999, 2001; Н.В. Филиппов, 2001; В.В. Не-досеков, К.Н. Груздев, 2000; В.В. Макаров, В.А. Ведерников, СИ. Джупи-на, 2002; В.М. Авилов и Др., 2004).
Широкое распространение бешенства в регионах Среднего и Нижнего Поволжья, а также потребность совершенствования системы антирабических мероприятий определили выбор темы и направления наших исследований.
Бешенство занимает исключительно важное место в инфекционной патологии. Восприимчивость к заболеванию им всех видов домашних и диких животных, огромная опасность для человека определяют его социальное и экономическое значение и привлекают к нему пристальное внимание ветеринарной, медицинской науки и практики (С. И. Джупина, 1994; В. С. Иванов, 2001, 2006; А. В. Саввин, 2004; С. М. Попандуполо и др., 2007; А.ЧЗ. Метлин, 2008; С. Р. Янбарисова и др., 2008; К. Gamoh, 2007; М. Smreszak et al., 2008; Н. В. С. R. Batista, 2008). Несмотря на значительные успехи в его изучении борьба с ним затруднена из-за широкой циркуляции вируса в
5 природе. В некоторых зонах нашей страны это привело к росту заболеваемости сельскохозяйственных животных (В.А. Седов, 1972; В.Ю. Литвинов, 1999; Н.А. Хисматуллина, 1999,2001; Н.В. Филиппов, 2001; В.В. Недосеков, К.Н. Груздев, 2000; В.В.'Макаров, В.А. Ведерников, СИ. Джупина, 2002; В.М. Авилов, В.В. Сочнев и др., 2004; Р. В. Галлиулина и др., 2005; В. В. Макаров, 2005).
Видное место в борьбе с бешенством принадлежит ранней диагностике, которая служит основанием о необходимости проведения лечебно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий (М. А. Селимов, 1975; М. М. Kaplan,1975).
Для диагностики и выявления возбудителя бешенства разработаны и предлагаются различные методы: морфологическое исследование (Babes, 1892; A. Negri, 1903; P. Lepine,1975), реакция диффузионной преципитации в агаровом гелег(Г. А. Коломакин и др., 1970; К. Н. Бучнев,1971; СмирМ. М. Смирнова, 1973; Villemot et Provost, 1958); метод иммунофлуоресценции (К. Ф. Бусыгин,1983; М. А. Селимови др.,1978; А. С. Шашенъко, 1971,1990; Р. X. Юсупов и др., 1986;Coons et Kaplan,1950, Goldvasser et Kissling, 1958 et al.); биологическая проба на лабораторных животных (С. А. Барановская и др.,1936; L. Т. Webster; G. R. Dawson, 1935). В целом, указанные лабораторные методы обеспечивают постановку диагноза бешенства. Однако, все они в той или иной степени обладают различными недостатками. Так, тельца Бабеша-Негри, их' величина и количество непосредственно зависят от продолжительности клинического периода болезни. При проведении ре-акции диффузионной преципитации положительный результат регистрируется только в тех случаях, когда имеется достаточная концентрация вирусного антигена. Метод иммунофлуоресценции уступает по чувствительности биопробе. Биологическая проба требует продолжительного времени наблюдения за подопытными животными до 30 суток (ГОСТ 26075-84).
В последнее время для ускоренной лабораторной диагностики вирусных болезней животных интенсивно развивается метод иммуноферментно-
го анализа, основанный на соединении антигена с антителом с последующим выявлением иммунного комплекса с помощью меченных ферментом антител (И. Ф. Вишняков и др., 1983; Н. А. Хисматуллина и др.,1985,1995; Р. X. Юсупов и др., 1989,1995; Engvall Е. and Perlman P., 4971). Явными преимуществами этого теста являются простота и быстрота выполнения, высокая чувствительность, доступность и стабильность реагентов, возможность автоматизации процесса и объективность инструментального учета результатов (В. А. Мищенко и др., 1990,1993).
В плане усовершенствования способов обнаружения возбудителя бешенства в последние годы предлагается использовать метод выделения уличного рабического вируса в культуре клеток неврального происхождения (A. L. Smith et all., 1978; R. G. Rudd et al. 1983; W. A. Webster, 1987). Обнадеживающими в этом отношении оказалась линия клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1). Показано, что в данной культуре клеток уличный рабический вирус может быть выделен в значительно более ранние сроки (3 суток), чем при интрацеребральной инокуляции мышей (до 30 суток) (П. А. Авцын и др., 1984; А. Г. Татаров и др., 1987,1988; Н. А. Хисматуллина, 1989; Р. X. Юсупов и др.).
Перспективным направлением в диагностике бешенства является использование моноклональных антител, обладающих моноспецифичностью по сравнению с обычными антисыворотками и позволяющими выявлять антигенные различия между штаммами вируса бешенства и лиссаподобны-ми вирусами (М. А. Селимов, 1987; А. Д. Ботвинкин и др., 1989; Wiktor Т. et all, 1978, 1980).
По данным ряда авторов (В. П. Бычкова и др., 1996; В. Л. Крупальник, 2006; М. В. Фоменко, 2006; Г. Г. Скворцов и др., 2007; В. И. Жестерев и др., 2007; Н. А. Ковалев, 2007; В. И. Клюкина и др., 2008; И. П. Барышников и др., 2008; В. В. Макаров в соавт., 2008), научно-обоснованные противоэпизооти-ческие и противоэпидемиологические мероприятия должны основываться на изучении особенностей расселения вирусоносителей в регионе, их эко-
7 логии, пространственной структуры нозоареала с учетом территориальных и временных особенностей возможного распространения болезни, а также на своевременном выявлении возбудителя бешенства и изучении его биологических свойств.
Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить и представить комплексную характеристику эпизоотической ситуации по бешенству в Республике Башкортостан и разработать на её основе предложения по усовершенствованию системы противоэпизоотических мероприятий.' В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить эпизоотическую ситуацию по бешенству в Республике Башкортостан за период с 2000 по 2007 гг. с оценкой интенсивности эпизоотиче-ского процесса по годам и сезонам, особенностей территориальной приуроченности вспышек болезни.
Выяснить роль разных видов животных в сохранении и распространении рабического вируса в природе.
Исследовать биологические свойства эпизоотических штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Башкортостан.
Модифицировать метод иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при бешенстве.
Проанализировать эффективность профилактических мероприятий клинико-эпизоотологическими и лабораторными методами.
Усовершенствовать систему организационных и специальных мероприятий по борьбе с бешенством в Республике Башкортостан.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые проведен ветеринарно - географический анализ распространения бешенства на территории Республики Башкортостан за 2000-2007 гг. На основе изучения территориальной дифференциации динамики количественных показателей бешенства, а также сопряженного картографическо-эпизоотологического исследования ветеринарно-экологической ситуации по бешенству, разработана карта эпизоотологического районирования территории республики. Изучена био-
8 логия, выделенных на территории Республики Башкортостан изолятов вируса бешенства, и установлено их антигенное сходство с вакцинным штаммом. Модифицирован непрямой метод иммуноферментного анализа для выявления антирабических антител в крови иммунизированных животных.
Теоретическая и практическая значимость, работы. В результате проведенных исследований модифицированы методические указания по лабораторной диагностике бешенства, наставление по применению набора для выявления антирабических антител; планы организации мероприятий по борьбе с бешенством в Республике Башкортостан, которые применяются в ветеринарной практике согласно утвержденным нормативно-техническим документациям Управления ветеринарии при МСХ Республики Башкортостан.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Характеристика эпизоотической ситуации по_бешенству в Республике Башкортостан за 200072007 гг. и районирование территории республики по степени распространения заболевания.
Анализ заболеваемости бешенством среди разных видов животных и их роль в развитии эпизоотического процесса.
Научно-теоретическое обоснование путей усовершенствования антирабических мероприятий с учетом эпизоотической ситуации и результатов мониторинга болезни в Республике Башкортостан.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на научной конференции, посвященной 105-летию образования БашНПВЛ в Башкортостане (Уфа, 2002 г.); 110-ой научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и аспирантов университета «Достижения аграрной науки - производству» (Уфа, 2004 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ и РБ, доктора ветеринарных наук, профессора X. В. Аюпова и 55-летию кафедры паразитологии, микробиологии и виру-сологии БГАУ «Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики
9 борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями с.-х. животных» (Москва - Уфа, 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: «Интеграция агарной науки и производства: состояние, проблемы и пути решения», (Уфа, 2008 г.); расширенном заседании кафедры «Паразитология, микробиология и вирусология» ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (протокол №12 от 27 июня 2007 г.).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь статей, в т. ч. две в центральных изданиях, рекомендованных ВАК Российской.Федерации для публикации материалов кандидатских диссертаций («Известия Оренбургского государственного аграрного университета», «Ветеринарный врач»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов полученных исследований, выводов и практических предложений. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 3 рисунками. Библиографический список включает 242 работы, в том числе 64 иностранных авторов.
Фенотипические и генотипические характеристики вируса бешенства
Бешенство - остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Восприимчивы все виды домашних и диких животных, а также человек (Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В., 1991).
Появление бешенства связано с экономическими убытками, обусловленными гибелью заболевших животных, затратами на проведение специальных и общих мер профилактики. Большая опасность бешенства сопряжена с возможностью заражения человека от больного животного. А современная наука еще не располагает средствами лечения уже развившейся болезни (Алимов Д.М., 1984).
Бешенство давно известно как инфекционное заболевание. В Индии и Китае о нем знали много тысячелетий назад. Контагиозный характер бешенства был доказан в 1804 г. Zinke, который заразил здоровую собаку путем нанесения на свежую рану слюны бешеной. В настоящее время бешенство регистрируют в 109 странах на всех континентах, за исключением Антарктиды и Австралии (Апатенко В.М.,1991).
Вирус бешенства является представителем рода Lissavirus, в семействе Rabdoviridae.
В настоящее время, согласно 5-му докладу Международного комитета по таксономии вирусов (1991), к роду Lissavirus относят 32 возбудителя - 17 выделенных от человека или позвоночных животных (вирусы бешенства, Аделайда-Ривер, Берримах, Костал-Алейнс, Дювенхаге, угря В 12, европейских летучих мышей (EBV 1 и EBV 2), рабдовирус Хирам, вирус инфекционного гемопоэтического некроза, Колонго, летучих мышей Лагоса, Мокрла, Насул, Санджимба, геморрагический септицемии, рабдовирус снейкхед), 3 вируса, изолированных как от позвоночных, так и от беспозвоночных животных (вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, Чарлевилъ, Кимберли) и 12 обнаруженных только у беспозвоночных (вирус Бивенс-Арм, Хамити-Ду, Котошсан, Нгайнген, Оак-Вейл, Ободьянг, Перри-Крик, Пухонг, Рохамбо, Свитуотер-Бранч, Ти Брогарн). Имеются еще 44 агента, отнесенные к роду лиссавирусов пока предположительно.
Вирус .бешенства и так называемые «бешенствоподобные» (rabies -like) возбудители были объединены в одну группу, включающую несколько серотипов (генотипов): тип 1-вирус бешенства, тип 2 - вирус летучих мышей Лагоса, тип 3 - вирус Мокола, тип 4 - вирус Дювенхаге, типы 5 и 6 -вирусы европейских летучих мышей. Наиболее филогенетически далекими от вируса бешенства являются из этой группы вирус летучих мышей Лагоса и Мокола, а наиболее близкими - вирусы европейских летучих мышей типа 6. Близкими оказались также вирус Дювенхаге и вирусы европейских летучих мышей типа 5. Патогенностью для человека из представителей этой группы обладают вирусы серотипов 1, 3-6 (Пилле Э.Р., 1996).
Как и все другие рабдовирусы, вирус бешенства имеет пулеобразную форму. Вирионы состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липо-протевидной оболочки, на" поверхности которой имеются выступы длиной 6-7 нм с утолщением на конце. Средний размер вирионов составляет 180x75 нм, диаметр спирали нуклеокапсида равен 10 нм, длина спирали в вытянутом состоянии около 4 мкм. Геном представлен единой односпиральной линейной минус - РНК с молекулярной массой 4,4-4,6 ВД. В вирионах вируса бешенства содержится 74 % белка, 22 % липидов, 3 % углеводов и 1 % РНК. Липиды и углеводы имеют клеточное происхождение. Молекулярная масса вирионов составляет 475 МД, плавучая плотность в сахарозе 1,16-1,17 г/смЗ, коэффициент седиментации 550-650 S . Вирус бешенства чувствителен к жи-рорастворителям, быстро инактивируется при 60С, УФ-облучении и рН ниже 3,0 и выше 11,0; устойчив к рН в пределах 5,0-10,0.
В вирионах вируса бешенства содержится пять белков с молекулярной массой от 21 до 200 кД. В состав наружного слоя оболочки ви 12 рионов входит только один гликопротеид G , который образует выступы. В вирионе находится примерно 1700 молекул этого белка. Он играет ведущую роль в прикреплении вирионов к клетке и обуславливает гемагглюти-нирующую активность вируса. Гликопротеид G является единственным структурным белком, индуцирующим образование вируснейтрализущих антител и определяющим развитие иммунитета у животных. Негликозили-рованный мембранный М белок составляет внутренний слой оболочки вирионов. В состав нуклеокапсидов входит РНК (4 %) и три белка (L, N, NS), которые составляют 96 % массы нуклеокапсида. Белок N является основным белком нуклеокапсида, тесно связан с РНК и образует вместе с ней спиральные витки. Небольшой белок NS входит в состав нуклеокапсида. Высокомолекулярный белок L также входит в состав нуклеокапсида, вероятно, является компонентом транскриптазы. Отмечена корреляция между содержанием его в вирионе и патогенностью вируса бешенства.
Таким образом, все известные уличные и фиксированные штаммы вируса бешенства имеют общий поверхностный гликопротеидный и нук-леокапсидный антигены. Поверхностный гликопротеидный антиген индуцирует синтез нейтрализущих и подавляющих гемагглютинацию антител и обеспечивает развитие иммунитета у животных. Нуклеокапсидный антиген вызывает образование комплементсвязывающих и преципитирующих антител, которые не обладают вируснейтрализующей активностью. Серологические различия между различными штаммами вируса бешенства незначительны (В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин,1983).
Материалы й методы исследования исследований
1. В работе использовали животных:
- кроликов, живой массой 3,5-4,0 кг, 60 голов;
- морских свинок, живой массой 0,3-0,35 кг, 20 голов;
- белых мышей, живой массой 6-7 г, 4000 голов.
2. В опытах применяли линию культуры клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) (Авцын А.П. и др., 1984). В качестве среды роста использовали среду Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов, рН 7,2-7,4, с 65 %-ным глютамином, 7 % сыворотки крови эмбриона крупного рогатого скота (ВНИВИ г. Казань). В питательную среду добавляли пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл и 1 мг/мл соответственно.
3. В исследованиях применяли разработанные во ВНИВИ (г. Казань) «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа», утвержденный ГУВ ГАП СССР 30.12.87г и «Флуоресцирующий антирабический глобулин», утвержденный ГУВ МСХ СССР 11.11.83г.
4. В качестве исследуемого материала использовали 552 пробы патологического материала (головной мозг), из них 117 - от сельскохозяйствен-ных, 96 - от различных диких, 279 - от домашних животных, поступившего , из неблагополучных по бешенству районов Башкортостана: Куюргазинский (78-неблагополучных пунктов), Бижбулякский (75), Бирский (63), Бакалин-ский (38), Зианчуринский (38), Федоровский (36), Мелеузовский (32), Буз-дякский (30), Илишевский (25), Чишминский (23) и др., кроме того, исследованы проба мозга лабораторных животных (кроликов, морских свинок, белых мышей), экспериментально зараженных эпизоотическими изолятами вируса бешенства.
Контролем во всех опытах служили суспензии головного мозга ин-тактных белых мышей (контрольный отрицательный антиген), а также иммуноглобулин сыворотки крови не иммунизированных животных (отрицательный Ig). В качестве положительного контроля использовали контрольный положительный антиген из мозга белых мышей, зараженных референс-штаммом «Овечий» ГНКИ вируса бешенства. В качестве гетерологичного антигена использовали мозг белых мышей, зараженных штаммом ВГНКИ вируса болезни Ауески. Все контрольные и испытуемые образцы готовили в виде 10 %-ной суспензии мозга на 0,85 %-ном физиологическом растворе с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин.
5. В работе использовали следующие химические реактивы: твин - 20,80, сорбиталь С2о, ацетон, этиловый спирт, глицерин, 0-фенилендиамин, трис (ок-симетил)-аминометан, нефлуоресцирующее масло, Н202 К2НР04, КН2Р04, НС1, NaCl, Na2HPC 4, MgCl2 6Н20, малахитовый зеленый, фуксин основной, метиленовая синь, аммоний молибденовокислый, натрий фосфорнокислый.
6. В исследованиях применяли следующее оборудование: сканирую-щий спектофотометр «Titertek multiskan» (Швейцария), центрифуги (различные); термостат, холодильные установки; световой микроскоп (Биолам); люминесцентный микроскоп МБИ-15; инвертированный микроскоп, ионо-мер универсальный ЭВ-74; аналитические весы; автоматическую многоканальную пипетку с переменным объемом от 50 до 200 мкл.
Обсуждение результатов собственных исследований
За последние годы роль и место рабической инфекции в формировании нозологического профиля в отдельных регионах Поволжского экономического района значительно возросли. Так, в Башкортостане в 2002 г. зарегистрированы 27 аутохтонных эпизоотических очагов рабической инфекции среди офлигатных хозяев возбудителя (лиса, волк, енот), а также смешанные и антропургические очаги среди факультативных (собаки - 29, кошки - 16) и тупиковых (крупный рогатый скот - 58, овцы - 2, лошади -1) хозяев. Значительным риск рабической инфекции оставался и в последующие годы.
Изучая подходы совершенствования эпизоотологической диагностики рабической болезни в условиях Республики, установили, что на основе клинического проявления этой патологии предположительный диагноз можно установить только в 53,2 % случаев, в то время как посмертный диагноз, в трм числе лабораторными методами, подтверждается в большинстве случаев. Основными методами рутинной лабораторной практики остаются биопроба (выделение вируса бешенства), световая микроскопия, РДП, метод флюоресцирующих антител (прямое обнаружение антигена вируса бешенства).
Изучая разрешающую способность доступных ветеринарной практике методов диагностики рабической инфекции, провели сравнительный анализ результатов диагностики бешенства, полученных по Волгоградской области, и установили, что лабораторными методами бешенство подтверждено практические 80 % случаев от числа исследований.
Подтверждена разрешающая способность методов диагностики бешенства и среди других видов животных.
Установили, что результативность диагностики (разрешающая способность) бешенства среди лис несколько выше (83 %). Известно, что бешенство диких животных (лис) в настоящий период определяет ухудшение эпизоотической ситуации по данной инфекции как в отдельных регионах, так и в РФ в целом.
Анализируя эффективность специфической профилактики рабиче-ской инфекции среди сельскохозяйственных животных, подтверждено, что в регионах, где отсутствуют аутохтонные очаги рабической болезни, благополучие по данной инфекции сохраняется даже при отсутствии их специфической иммунизации. Вакцинация против бешенства крупного рогатого скота эпизодически проводится в основном в хозяйствах, где в прошлые годы регистрировались случаи бешенства среди диких животных. Но, учитывая, что прогнозирование новых эпизоотических очагов бешенства в дикой природе пока недостаточно эффективно, «точечная» вакцинация круп-ного рогатого скота против этой болезни не дает должного эффекта. Однако там, где вакцинация крупного рогатого скота проводилась и в угрожаемой зоне, результаты получены обнадеживающие.
В настоящее время применяются диагностические наборы препара- тов, позволяющие выявлять антиген вируса бешенства в патологическом материале методом ИФА и МФА с использованием в качестве фермента у пероксидазы из корней хрена, а в качестве флуорохрома ФИТЦ (Клюева Е.В., Селимов М.А.; Ботвинкин А.Д., 1990; Сазанова Э.Я. и др., 1991; Хис-матуллина Н.А., Юсупов Р.Х. и др., 1995 и др.).
Для расширения арсенала диагностических препаратов, а также повышения чувствительности ИФА и МФА нами был испытан новый фермент пирофосфатаза из E.coli и флуорохром - ФАР-4 для изготовления ан-тирабических конъюгатов и изучена возможность их применения для диагностики бешенства методом ИФА и МФА.
В главе 2.2.3. представлены результаты усовершенствования экспресс-методов диагностики бешенства на основе нового фермента и флуорохрома.
Экспериментами, проведенными с вакцинным штаммом «Овечий» ГНКИ и 56 эпизоотическими штаммами вируса бешенства установлена высокая активность и специфичность антирабических конъюгатов, изготовленных на основе пирофосфатазы и ФЯР-4. Указанные конъюгаты давали положительную реакцию только с контрольным положительным антигеном и не реагировали с отрицательным и гетерологичным антигенами, что свидетельствовало об их специфичности. При этом активность пирофосфатаз-ного конъюгата составила 1:500, пероксидазного - 1:1000, иммунофлуорес-центных конъюгатов, изготовленных на основе ФАР-4 - 1:32 (++++), ФИТЦ - 1:32 (+++).
На положительных препаратах, окрашенных антирабическим глобулином, меченным ФАР-4, антиген вируса бешенства выявлялся в виде ярких, оранжево-красных гранул различной формы и величины. Продукт пи-рофосфатазной реакции: от светло-зеленого до интенсивно сине-зеленого, очень удобен для визуального учета.
На основании полученных нами результатов, а также анализа данных литературы необходимо отметить некоторые преимущества использования пирофосфатазы по сравнению с пероксидазой: для изготовления пирофосфа-тазного конъюгата требуется 3 часа вместо 3 суток для пероксидазного. Пи-рофосфатаза и ее субстрат стабильны и не опасны для здоровья. (Байков А.А., Кашо В.Н., Аваева СМ., 1988; Хисматуллина И.А., Юсупов Р.Х., 1992).
На примере изучения вакцинного" и эпизоотических штаммов вируса бешенства нами установлена возможность применения антирабических коньюгатов, изготовленных на основе нового фермента пирофосфатазы и флуорохрома ФАР-4 для диагностики бешенства.
