Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Распространение гемобластозов крупного рогатого скота в Российской Федерации и зарубежом 9
1.2. Современные методы прижизненной лабораторной диагностики гемобластозов крупного рогатого скота 15
1.2.1. Серологические и ПЦР методы диагностики 15
1.2.2. Гематология и цитология лимфолейкоза 18
1.2.3. Иммунофенотипирование 24
1.3. Лейкозогенез 29
1.4. Лейкемоидные реакции 33
1.5. Заключение по обзору литературы 36
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1. Материалы и методы исследований 39
2.2. Динамика гемобластозов крупного рогатого скота на модели отдельных хозяйств Омской области 42
2.3. Цитоморфологическая картина крови при гемобластозах 53
2.4. Структура гемобластозов и удельный вес реактивных состояний крупного рогатого скота 76
2.5. Иммуноморфологические типы гемобластозов 82
2.5.1. Дифференциальная диагностика гемобластозов от других патологических состояний организма крупного рогатого скота 87
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 89
4. ВЫВОДЫ... 99
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 101
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ
ЛИТЕРАТУРЫ 102
- Распространение гемобластозов крупного рогатого скота в Российской Федерации и зарубежом
- Современные методы прижизненной лабораторной диагностики гемобластозов крупного рогатого скота
- Материалы и методы исследований
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение морфологических показателей периферической крови при разнообразных физиологических и патологических состояниях с учетом индивидуальных особенностей организма имеет огромное значение для исключения ошибок при диагностике заболеваний системы крови (К.А. Акопян, 1939; В.Н. Никитин, 1956; Г.С. Петровский, 1965; Э.М. Нымм, 1971; А.А. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева, 1974; Н.С. Петракова, 1986; Г.А. Симонян, 1995; Ю.П. Смирнов, 1998; L. Marcson, 1980; М. Mammerickx et al., 1985; L. Dimitriadis et al., 1987;C.Parrishetal., 1988).
В большинстве своем прижизненный диагноз на гемобластозы в начальной их стадии ставится количественным методом и не подтверждается патоморфо-логическим исследованием (Е.А. Дун, 1991; Х.С. Салимов, 1991; А.Г. Незави-тин, 1995; М.И. Гулюкин, П.Н. Смирнов, 1999). Ряд авторов (Б.Б. Ермолаев, 1967; О.Ч. Парчинский, 1974; R. Gotze et al., 1954; Е. Wiesner, 1967 и др.) признавая гематологическую диагностику, подчеркивают, однако, ее недостаточность для выявления алейкемических и сублейкемических форм, которые составляют от 4,1 до 30% и даже выше, при диагностике гемобластозов по стаду.
Обнаруживаемые лейкоцитоз и лимфоцитоз в крови можно объяснить во многих случаях наличием всевозможных патологий. Согласно данным Г.В. Зверевой (1951), Б.Б. Ермолаева (1967, 1972), Н.М. Хилькевича (1970), Ю.А. Козырева (1972), П.В. Филатова с соавт. (1972), А.П. Горбунова (1972), Г.А. Симоняна (1975) и др., лимфатический тип лейкемоидных реакций отмечается при анаплазмозе, травматическом ретикулите, туберкулезе, бруцеллезе, маститах, нефритах, миокардитах, пневмониях, гепатохолангитах, гепатитах, циррозах, абсцессах. Сходная с гемобластозами картина крови по данным Н.Т. Васильева с соавт. (1966) возможна при некоторых хронических, относительно доброкачественно протекающих инфекциях, поражающих лимфатические узлы.
Во многих случаях изменения состава крови являются вторичными, обусловленными нарушениями физиологической деятельности различных систем
или органов (В.М. Лемеш с соавт., 1986; М.А. Амироков с соавт., 1997 и др.).
И.А. Кассирский с соавт. (1970) также указывает, что кровь в определенной степени отражает как в зеркале многое из того, что происходит в организме.
Ряд исследователей (И.В. Давыдовский, 1958; Н.А. Краевский с соавт., 1961; Э. Попеску, 1965; Н.Н. Доронин с соавт., 1976; Л.Г. Бурба с соавт., 1977; Г.А. Симонян, 1995) сообщают, что при лимфопролиферативных опухолевых процессах в кровяное русло может поступать большее или меньшее количество незрелых форм клеток - пролимфоцитов, лимфобластов, миелоцитов, промие-лоцитов, миелобластов, промоноцитов, гемоцитобластов и ретикулярных клеток, а также клеток с делящимся ядром.
Однако, в доступной литературе мы не нашли единого мнения авторов о появляющихся в периферической крови стабильных цитоморфологических изменений лимфоцитов. Дифференциальная диагностика лимфопролиферативных процессов от распространенных болезней крупного рогатого скота, протекающих с подобными изменениями в крови, также освещена недостаточно, что и предопределило направление наших исследований.
Цель работы. Дифференциальная диагностика гемобластозов крупного рогатого скота по данным морфологической картины крови. Задачи исследований:
Установить динамику распространения гемобластозов в Сибирском регионе на модели отдельных хозяйств Омской области;
Выявить устойчивые морфологические признаки и иммунофенотипический профиль лимфоцитов крови крупного рогатого скота больного гемобластозами;
Определить удельный вес реактивных и опухолевых состояний среди животных с патологическими сдвигами в гемограмме;
Изучить структуру хронических лимфопролиферативных заболеваний крупного рогатого скота;
Дифференцировать лимфопролиферативный процесс у коров от других патологических состояний.
Научная новизна. Впервые в этой работе проанализирован иммунофено-типический профиль лимфоцитов при лимфопролиферативных процессах крупного рогатого скота. Выявлена неоднородность лимфопролиферативных заболеваний и определены основные типы лимфом и лейкозов, распространенных в хозяйствах Омской области.
Установлено, что 50-60% животных с увеличенным количеством лейкоцитов и лимфоцитов до уровня «подозрительных» по заболеванию лейкозом при повторном исследовании (через месяц) имеют картину крови в пределах нормы. Полученные данные свидетельствуют о влиянии ряда факторов (заболевания разной этиологии, стельность) на картину крови животных, которые необходимо учитывать, проводя диагностические исследования на лимфопро-лиферативные заболевания, чтобы исключить ошибки.
На модели ряда хозяйств с разной эпизоотической ситуацией по гемобла-стозам впервые изучены особенности их годовой динамики с учетом факторов внешней среды, условий содержания и индивидуальных особенностей организма.
Установлено, что появление в крови незрелых и патологических форм лимфоцитов свыше 15% от общего числа лимфоцитов, свидетельствует о развитии лимфопролиферативного процесса.
Изучены цитоморфологические особенности лейкоцитов крови у больного гемобластозами крупного рогатого скота и установлены специфические варианты лимфоидных клеток при определенных типах лимфопролиферативных заболеваний. Выявленные количественные и качественные изменения в периферической крови позволяют дифференцировать реактивные процессы от лимфопролиферативных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Показана возможность использования иммунофенотипирования лимфоцитов для дифференциальной диагностики лимфопролиферативных заболеваний крупного рогатого скота.
Описанные цитоморфологические особенности лимфоцитов позволяют дифференцировать лимфопролиферативные и реактивные процессы. Доказана взаимо-
связь морфологических и иммунофенотипических характеристик лимфоидных элементов разных этапов дифференцировки. Дана классификация гемобластозов крупного рогатого скота распространенных на территории Омской области.
Разработаны методические рекомендации по дифференциальной диагностике гемобластозов крупного рогатого скота от других патологических состояний (Омск, 2004). Научно обоснованы планы и программа по созданию свободных от инфекции ВЛКРС стад крупного рогатого скота в племенных хозяйствах и фермах Омской области.
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней животных ИВМ ОмГАУ, Новосибирского ГАУ, Уральской ГАВМ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Динамика заболеваний лимфопролиферативной природы крупного рогатого скота на модели ряда хозяйств Омской области;
Цитоморфологические особенности лимфоцитов крови у больного ге-мобластозами крупного рогатого скота и иммунофенотипическая характеристика основных типов лимфом, распространенных в хозяйствах области;
Критерии и эффективность дифференциальной диагностики гемобластозов крупного рогатого скота по морфологической картине крови.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов Сибирского федерального округа (Омск, 2003); международной конференции, посвященной 175-летию аграрной науки Сибири (Омск, 2003); научно-практической конференции, посвященной 85-летию ИВМ ОмГАУ (Омск, 2003); международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (Омск, 2004); международной научно-практической конференции, посвященной профилактике и мерам борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Российской Федерации (Екатеринбург, 2005); совместном заседании кафедр эпизоотологии и парази-
тологии с.-х. животных ИВМ ОмГАУ (Омск, 2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 242 источника, из них 74 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками.
Распространение гемобластозов крупного рогатого скота в Российской Федерации и зарубежом
Лейкоз крупного рогатого скота регистрируется больше чем в одной трети стран земли. Следует отметить общее мнение исследователей по эпизоотологии лейкоза КРС, указывающих, что заболевание имеет неодинаковую распространенность не только в разных странах, но и в различных климатогеографических районах (В.М. Нахмансон, 1986). Родиной лейкоза считаются страны Западной Европы с развитым животноводством: Голландия, Англия, Бельгия.
Данные П.Н. Смирнова с соавт. (1989), Н.И. Петрова (2003) показывают, что в России в последние годы лейкоз занимает первое место среди болезней крупного рогатого скота. На данное заболевание приходится более 53% учтенных у КРС случаев инфекционной патологии. Анализируя причины этого явления, авторы утверждают, что широкое распространение лейкоза связано с завозом племенных животных из неблагополучных территорий. В хозяйствах Ленинградской области лейкоз в 1990 году по результатам проведения широкомасштабной диагностики стад КРС выявлено 41% вирусоносительства (Л.С. Фогель, 2000). Так, по официальным данным, количество хозяйств, где зарегистрированы больные лейкозом животные, увеличилось с 1.476 в 1990г. до 2.989 в 2001г. Согласно данным М. И. Гулюкина с соавт. (2002), болезнь приняла характер эпизоотии и получила повсеместное распространение.
По данным В.В. Смирновой (1984), П.Н. Смирнова (1988), А.Г. Незавитина (1990), В.В. Храмцова (1995), наиболее неблагоприятна обстановка по лейкозу в 18 регионах страны: Новгородской, Ленинградской, Тюменской, Новосибирской и других областях. С.Я. Логановский с соавт., (1982) провели сравнительные серологические и гематологические исследования животных в хозяйствах с различной степенью поражения лейкозом. Наибольшее распространение ВЛКРС инфекция получила в зоне Нечерноземья.
Согласно данным Н.И. Петрова (2003), на 1 января 2003 года было зарегистрировано 3125 неблагополучных пунктов, из них, например, в Тюменской области - 287, Новгородской области - 179, Удмуртской Республике - 167, Московской -160, Владимирской - 164, Алтайском крае - 133, Республике Татарстан - 124, Ставропольском крае - 106, Воронежской - 101, Ленинградской - 100, Самарской - 92. От одного до пяти неблагополучных пунктов зарегистрировано на территориях Мурманской области, Ярославской, Волгофадской, Саратовской, Ростовской, Амурской, Читинской областей, Ямало-Ненецкого АО и Республики Саха.
Лейкоз крупного рогатого скота получил широкое распространение в районах Западной Сибири. По результатам П.Н. Смирнова (1983), В.В. Смирновой (1984), Ю.В. Федорова, О.В. Гордеева (1995), B.C. Федорова, А.Г. Иванова (1995) и др., в районах Западной Сибири в неблагополучных по лейкозу стадах выявляется от 26 % до 40 % коров — онковирусоносителей.
Анализ (Ю.С. Притужалов, 2000) эпизоотической ситуации по лейкозу в Омской области показал, что по основным хроническим инфекциям (туберкулезу, бруцеллезу, некробактериозу и лейкозу) крупного рогатого скота, на протяжении последних 10 лет на первом месте стоит лейкоз. Так, заболеваемость с 1966 по 1975 годы в среднем не превышала 1,2%, в последующие 10 лет (1976-1985 годы) показатель больных снизился до 0,6%, с 1986 по 1992 годы (8 лет) -не превышал 1% . Однако с 1993 по 1998 годы показатель заболеваемости вырос в среднем по области до 3,6%.
Регистрируется лейкоз крупного рогатого скота и на Урале. При выполнении плановых серологических исследований крупного рогатого скота более чем из 320 хозяйств Свердловской области было выявлено от 7 до 27,2% животных, инфицированных вирусом лейкоза (А.Т. Татарчук, 1997; В.А. Краснопёрое, 1999; И.М. Донник, 2000). При этом наибольшее количество животных-носителей ВЛКРС выделяется в южных и юго-восточных районах области, являющихся зоной интенсивного ведения животноводства. Обследования, проводимые Волгоградскими областными ветеринарными службами, показали, что 17,8% дойного стада области инфицировано лейкозом. Отмечена тенденция к росту заболеваний. В 2001 году было инфицировано 13,7% дойного стада, в 2002-м - 14,9%. Если в частном секторе лейкозом инфицированы 13% коров, то в общественном - 20%.
Так, по данным исследований В.М. Нахмансон с соавт., (1996) количество зараженных животных составило в Московской области около 14%, в Ростовской и Владимирской - по 25%, в Брянской - 18%, в Краснодарском крае - до 45%. В некоторых хозяйствах количество инфицированных животных достигает 80-90%.
В. А. Апалькин (1993) и В. В. Разумовская (1995) сообщают, что в четверти районов Алтайского края сложилась неблагополучная обстановка с инфекционным заболеванием животных — лейкозом.
На начало 2001 года в 223 хозяйствах края уровень инфицированности маточного поголовья составляет более 50%.
По данным официальной статистики, полученной в Департаменте ветеринарии РФ, наибольшее количество инфицированных ВЛКРС животных выявлено в Хабаровском, Краснодарском, Приморском краях, а также в Ростовской и Курганской областях. В последних регионах -31,8 и 29,2% соответственно (В.М. Авилов, В.М. Нахмансон, 1995; B.C. Федоров, А.Г. Иванов, 1995).
По сообщениям ряда исследователей, лейкоз крупного рогатого скота получил широкое распространение и в странах СНГ.
На Украине в 99,4% хозяйств Ровенской области выявляются серологически положительные животные. При отсутствии оздоровительной работы инфициро-ванность стад в отдельных районах достигает 80%, но заболеваемость не превышает 5%. Это объясняется, по мнению автора, медленным развитием (годами) гематологических и клинических признаков болезни (В .А. Бусол, 1987).
В республике Молдова установлена прямая зависимость между возрастом и количеством зараженных животных. Уровень инфицированности (по всем административным районам республики) составляет от 40% до 85% (Р.С. Москалик, 1992). В Белоруссии по данным В.А. Бусол (1983), во всех исследуемых хозяйствах у животных выявляли от 14% до 28% случаев антителоносительства к полипептидному антигену.
. В Казахстане отчетливо просматривалась тенденция роста неблагополучия - от 22 (в 1969 г) до 178 хозяйств (в 1985 г.). По данным Г.К. Таубекова, А.И. Испуллаева (1995), лейкоз зарегистрирован в 15 областях республики.
В Узбекистане самый низкий процент вирусоносительства крупного рогатого скота 2,8-6%, вьывляется в хозяйствах Андижанской области, а самый высокий 11,0-18 % в Ферганской области (Х.С. Салимов, В.А. Крикун, 1985).
Лейкоз крупного рогатого скота получил широкое распространение и в странах Восточной Европы. В Чехословакии, заболевание зарегистрировано в 22 районах страны. Из 15 тыс. животных, исследованных гематологически, лейкоз диагностирован у 548, что составляет 3,6%. Аналогичная ситуация складывалась в Болгарии, Венгрии и Польше (N. Belev et al., 1978; М. Grundbock, 1982).
Современные методы прижизненной лабораторной диагностики гемобластозов крупного рогатого скота
Одним из приоритетных направлений современных исследований является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики лейкоза (Л.А. Иванова, 1996; В.Н. Нахмансон, 1997; В.А. Бусол, 1997; Р.В. Облап и др., 1998; Л.Б. Прохватилова с соавт., 2000; О.А. Верховский с соавт., 2002; М.И. Гулюкин с соавт., 2002).
В патогенезе лейкоза крупного рогатого скота, согласно данным многих исследователей (В.Б. Бронштейн, М.Н. Данилов, 1982; П.Н. Смирнов, 1983; Л. Г. Бурба, А. Н. Федорченко, 1984), диагностируют три основные стадии: серологическую (стадия вирусоносительства), гематологическую (гематологическая стадия) и патологоанатомическую с гистологическим подтверждением (опухолевая стадия).
Продолжительность инкубационного периода, по данным П.Н. Смирнова (1983), Л.Г. Бурбы, А.Н. Федорченко (1984), при экспериментальном заражении может быть 8—14 суток, в естественных условиях 60-90 и более суток. Бессимптомная стадия при лейкозе определяется временем обнаружения антител ВЛКРС до появления гематологических изменений, характерных для начала развития патологического процесса.
По мнению Г.А. Симоняна (1972) состояние антителоносительства не вызывает у животных видимых физиологических или патологических отклонений. У коров не наблюдают нарушение воспроизводительной функции и деятельности молочной железы, сохраняется масса, и полностью сохраняются поведенческие рефлексы. В состоянии вирусоносительства животные могут находиться на протяжении всей своей жизни. Только у незначительной части животных-антителоносителей при систематических клинико-гематологических исследованиях определяют изменения крови в виде относительного и абсолютного лимфоцитоза.
Животных, находящихся в этой стадии, определяют при помощи вирусологических (все чаще для прямого обнаружения вируса используется ПНР анализ) и серологических (РИД, РОС, РИФ, РИП, РНГП) методов.
Доступными и легкими в применении серологическими методами являются РСК и РИД. М. Mammerickx et al. (1978), Р. А. Кукайна и соавт. (1979) отмечают при постановке реакции связывания комплемента весьма часто антикомплемен-тарность многих сывороток крови крупного рогатого скота, по своей диагностической ценности РСК значительно уступает РИД.
По мнению многих авторов (Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов, 1976; А.Ф. Валихов, 1976; Н.Б. Езовитов с соавт., 1979; В.А. Крикун с соавт., 1979; С.Я. Лаганов-ский, O.K. Приедниекс, 1979; В.П. Шишков с соавт., 1998), накопленный опыт по использованию РИД для выявления животных, инфицированных ВЛКРС, показал, что этот метод отличается простотой постановки и специфичностью.
Ввиду длительной персистенции материнских антител у большей части телят диагностику в РИД проводят не ранее, чем с 6-месячного возраста (А.Ф. Валихов с соавт., 1978; У.Т. Бандрес с соавт., 1979; Р.С. Москалик, 1992; Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин, 1996).
Однако при его массовом использовании необходимо учитывать ряд особенностей. В отдельных случаях учет этой реакции затруднен из-за значительного количества неспецифических реакций, связанных с использованием различных серий антигенов для РИД (до 37%) и в какой то степени из-за применения биопрепаратов (до 2%), и в связи с диагностическими исследованиями на туберкулез (до 10%). В.А. Крикун (2002) обнаружил, что в процессе оздоровления хозяйств от лейкоза с использованием реакции иммунодиффузии (РИД), в некоторых случаях возникают трудности, связанные с так называемым выпадением реакции: ограниченный диапазон чувствительности (выявление только преципитирующих антител), длительность постановки (не менее 2 суток) и невозможность автоматического учета результатов.
И.М. Донник с соавт., (2000), В.А. Крикун (2002), С.А. Мурватуллоев (2002) объясняют выпадение серологической реакции передачей антител с молозивом потомству. За 2-3 недели до и после отела у коров в сыворотке крови противовирусные антитела в РИД не обнаруживают. В.А. Апалькининым (1998), П.Н. Смирновым, В.В. Храмцовым и др. (2000), выявлено влияние факторов биологической природы (паразиты, вирусы, бактерии, грибы) на выпадение серологических реакций у животных-носителей ВЛКРС.
Несмотря на то, что РИД уже много лет остается одним из основных методов диагностики лейкоза, именно ИФА в последние годы исследователи отдают предпочтение во многих странах мира (Р.З Файзулин с соавт., 1997; Т.В. Щекотурова с соавт., 1999; В.А. Крикун, 2002; О.А. Верховский с соавт., 2002; Н.А. Мальцева с соавт., 2003).
Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов. Исследователи (Л.А. Иванова, 1996; Т.В. Щекотурова с соавт., 1999) описывают две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный. Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования (МТП). В последние годы все больше исследователей (М.И. Гулюкин с соавт., 1999; Н.А. Мальцева, и др., 2003; S. Oka, U. Kyoko et al., 1990; G. Sarcar, 1990; D.K. Wright et al., 1990; S. Chou, 1990; J.S. Robertson, 1990; R.E. Gale et al., 1997) отдают предпочтение молекулярно-биологическому исследованию с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод обладает высокой специфичностью и позволяет выявить инфицированных животных на более ранних стадиях заражения. По данным R.E. Gale (1997), вирус лейкоза крупного рогатого скота присутствует в организме в виде ДНК - копий (провируса), встраиваясь в геном клетки - хозяина. Это делает возможным выявление ВЛКРС с помощью современных молекулярно-биологических методов, в частности, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (В.А. Бусол, О.Ю. Лиманская, А.П. Лиманский, В.И. Цымбал, 1997; Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин, С.Н. Колосов и др., 1998; М.И. Гулюкина, В.А.Храмцова, А.С. Донченко и др., 2002; D. Shibata et al., 1988; R.K. Saiki et al., 1988). Для обнаружения провируса с помощью ПЦР используется геномная ДНК, выделенная из крови животных. ПЦР может использоваться для диагностики лейкоза крупного рогатого скота наряду с серологическими методами, а также в качестве подтверждающего теста.
Материалы и методы исследований
Исследования проводились в течение 2002-2005 гг. в лаборатории диагностики лейкоза крупного рогатого скота ИВМ ОмГАУ и лаборатории ассоциированных с туберкулезом болезней крупного рогатого скота Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных. Тема диссертации является разделом плановой научно-исследовательской работы ИВМ ОмГАУ «Диагностика лейкоза и постинтоксикационных лейкемоидных реакций у животных», имеет номер государственной регистрации № 01.2.00305308.
Проведены серологические, гематологические и иммунофенотипические исследования 60 000 голов крупного рогатого скота из семи хозяйств шести районов Омской области, с разной эпизоотической ситуацией по ВЛКРС-инфекции и гемобластозам.
Для проведения цитоморфологического анализа мазков крови были подобраны 3 группы животных 3-5-ти летнего возраста, из которых в первую вошли 100 голов РИД-позитивных на ВЛКРС общественного сектора; во вторую - 100 голов РИД-негативных на ВЛКРС общественного сектора, и в третью - 100 голов РИД-негативных животных частного сектора. Третья группа была контрольная, чтобы исключить действие техногенных факторов животноводческих комплексов, а также влияние экологических факторов.
Наблюдение проводили в течение 9 мес. Ежемесячно по сезонам (весна, осень) проводили клинические обследования животных, гематологические и серологические исследования, анализ условий кормления и содержания, учет профилактических и лечебных мероприятий. Всего на этом этапе исследовано 300 голов крупного рогатого скота.
Для подтверждения наличия стабильных цитоморфологических изменений лимфоцитов было подобрано 4 группы животных по 15 голов. Первая группа - условно-здоровые животные, вторая группа - подозрительные по «лейкозному ключу» животные с реактивными процессами, третья группа - больные лейкозом по «лейкозному ключу» без реактивных процессов, четвертая группа — больные лейкозом по «лейкозному ключу» с реактивными процессами. Наблюдения за животными длились 7 месяцев (апрель-октябрь). Гематологические исследования проводились четыре раза (апрель, июнь, август, октябрь).
Кроме того, определяли иммунофенотипический профиль лимфоцитов у коров гематологически больных и подозрительных по «лейкозному ключу». Всего исследовано 60 проб сыворотки и крови от крупного рогатого скота.
Гематологические исследования включали подсчет форменных элементов крови с помощью микроскопирования (тринокулярный светооптический микроскоп «MICROS» серии МС 200 с TV-камерой, увеличение 10x100) в камере Горяе-ва и выведение лейкоцитарной формулы (согласно действующим методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 2000 года). Мазки окрашивали по методу Паппенгейма.
Реакцию иммунодиффузии (РИД) проводили общепринятым методом.
Иммунофенотипирование крови проводили с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции на суспензиях живых лимфоцитов, выделенных градиентным центрифугированием в растворе Ficoll-Paque (коммерческий раствор). Анализ результатов проводили на люминесцентном микроскопе «Люман Р8» (увеличение 15x90). Учет результатов исследований проводили путем подсчета количества светящихся лимфоидных клеток из крови животных: отсутствие позитивных клеток (—), умеренное количество позитивных клеток (±) и большое число позитивных клеток (+). Для исследования использовали стандартную панель моно-клональных антител «anti-bovi» (аналог «anti-human», предоставленных Centre for Animal Biotechnology, Australia) к антигенам CD3, CD4, CD5, CD8, CD 16, CD 19, CD20, CD23, CD25, CD38, CD95 и HLA-DR (CD - cluster differentiation). Иммуно-фенотипические исследования проб крови от коров проводили в иммунологической лаборатории областной клинической больницы №1 г. Омска.
