Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литератуы 9
1.1. Этиологические аспекты ассоциативного урогенитального микоплазмоза крупного рогатого скота 9
1.2. Методы индикации и идентификации микоплазм 15
1.2.1 .Питательные среды для культивирования микоплазм 20
1.2.2. Серологические и иммунологические методы диагностики микоплазмоза 25
1.3.Чувствительность микоплазм к химиотерапевтическим препаратам и лечение больных микоплазмозом 33
1.4.Заключение 37
2. Собственные исследования 39
2.1. Материалы и методы 39
2.2. Изучение эпизоотической ситуации по урогенитальному микоплазмозу крупного рогатого скота и ассоциативным формам
его проявления в хозяйствах Омской области 42
2.3. Бактериологические методы диагностики урогенитального микоплазмоза 54
2.3.1. Индикация и идентификация микоплазм на питательных срдах 54
2.3.2. Основные биологические свойства микоплазм
2.3.2.1 Морфологические свойства 57
2.3.2.2 Биохимические свойства 57
2.3.2.3 Ультраструктурные свойства 58
2.3.2.4 Патогенные свойства 61
2.4. Серологические методы диагностики урогенитального микоплазмоза з
2.4.1. Получение микоплазмозных антигенов и диагностических кроличьих сывороток для РНИФ 63
2.4.2. Изучение специфичности и активности сывороток и антигенов в РНИФ 66
2.4.3. Определение диагностической ценности бактериологического и серологического (РНИФ) методов диагностики в производственных условиях 68
2.4.4. Получение эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемаглютинации (РИГА) 72
2.5. Изыскание средств и методов лечения животных репродуктивного стада при ассоциативном урогенитально микоплазмозе 75
2.5.1. Определение чувствительности полевых культур микоплазм к антибактериальным препаратам in vitro 75
2.5.2. Изучение различных схем лечения и лабораторных методов контроля их эффективности 77
2.5.3.Экономическое обоснование схем лечения 89
Обсуждение результатов 94
Выводы 102
Практические предложения 104
Список литературы
- Методы индикации и идентификации микоплазм
- Бактериологические методы диагностики урогенитального микоплазмоза
- Получение микоплазмозных антигенов и диагностических кроличьих сывороток для РНИФ
- Изучение различных схем лечения и лабораторных методов контроля их эффективности
Введение к работе
Актуальность темы.
В последние годы возросло значение в возникновении заболеваний ус-ловнопатогенных микроорганизмов, в том числе микоплазм. Микоплазмоз является типичной хронической инфекцией с присущей ей длительной персистенци-ей возбудителя в организме. При этом микоплазмы способны сохранять жизнеспособность в фагоцитах и оказывать повреждающие действие на макрофаги, что приводит к нарушению их функции и снижению резистентности организма. Вступая в синергические отношения с вирусной, бактериальной и условно-патогенной микрофлорой, микоплазмы создают условия для ее активного роста и развития, что усиливает тяжесть течения данного заболевания. (СВ. Прозоровский и др.,1997) Все это приводит к снижению продуктивности, бесплодию и яловости коров. Данная инфекционная болезнь наносит хозяйствам значительный экономический ущерб. Поэтому, следует проводить своевременную диагностику микоплазмоза в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами с использованием экспресс-методов, что позволит выявлять больных животных, а также микробоносителей и своевременно лечить их.
Для лечения больных микоплазмозом людей животных и птиц применяют различные антибиотики. Однако бессистемное применение их без определения чувствительности возбудителей к лекарственным препаратам не позволяет добиться желаемых результатов. В настоящее время не разработаны эффективные и рациональные схемы лечения крупного рогатого скота при урогениталь-ном микоплазмозе и ассоциативных формах его проявления.
В связи с этим весьма актуальным является: выяснить распространение урогенитального миоплазмоза крупного рогатого скота с помощью экспресс-методов диагностики, а также разработать эффективные и рациональные схемы лечения крупного рогатого скота при ассоциативном урогенитальном микоплазмозе с учетом всех сочленов ассоциаций микроорганизмов, учавствующих в инфекционном процессе. Все это предопределило тему данных исследований.
Цель работы. Разработка методов диагностики и лечения при ассоциативном урогенитальном микоплазмозе крупного рогатого скота.
Задачи исследований.
Выяснить эпизоотическую ситуацию по урогенитальному мико-плазмозу крупного рогатого скота и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской области.
Изучить культуральные, морфологические, биохимические и патогенные свойства выделенных микоплазм.
Изыскать экспресс-методы диагностики урогенитального микоплазмоза и испытать их в производственных условиях
Разработать эффективные и рациональные схемы лечения коров при урогенитальном микоплазмозе и его ассоциации с другими инфекциями.
Грос. национальная]
БИБЛИОТЕКА
С.-Петербург 1
3 ОЭ20ак00]
Научная новизна. Установлено широкое распространение урогенитального микоплазмоза крупного рогатого скота, проявляющегося чаще в ассоциативных формах, в хозяйствах Омской области. Доказана чувствительность элективных питательных сред для индикации глюкозо- и аргинин ферментирующих микоплазм и уреаплазм крупного рогатого скота. Определены виды и основные свойства выделенных микоплазм. Получены антигены из полевых штаммов микоплазм и диагностические сыворотки для РНИФ. Предложены методы и способы индикации и идентификации возбудителей, основанные на комплексном подходе к изученшо всех сочленов микробных ассоциаций. Они легко выполнимы в лабораторных условиях, могут быть использованы для определения видовых характеристик выделяемых культур микроорганизмов. Изучена чувствительность к антибиотикам полевых культур микоплазм, на основании чего разработаны эффективные и рациональные схемы лечения.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Материалы диссертации вносят определенный вклад в развитие науки микоплазмологии и в изучение микропаразитоценозов урогенитального тракта крупного рогатого скота. Разработанные методы индикации и идентификации микоплазм на питательных средах, методики получения микоплазмозных антигенов и антисывороток для РНИФ и эритроцитарного диагностикума позволят внедрить данные рациональные экспресс- методы диагностики микоплазмоза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства.
На основании проведенных исследований разработаны для внедрения в практику методические рекомендации «Комплексная система мер борьбы и профилактики с ассоциативными инфекционными болезнями животных» и «Диагностика и лечение при ассоциативном урогенитальном микоплазмозе крупного рогатого скота», которые позволят ветеринарным специалистам своевременно диагностировать урогенитальный микоплазмоз крупного рогатого скота и его ассоциативные формы. Применение испытанных при ассоциативном микоплазмозе крупного рогатого скота схем лечения позволит наиболее эффективно бороться с данной инфекцией.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУВПО ОмГАУ 2004, 2005, 2006 гг. «Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе» (Омск, 2004, 2005, 2006); Межрегиональной научно-практической конференции «Эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных» (Омск, 2004, СО РАСХН ВНИИБТЖ); Межригеональ-ной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Омск, 2005, 2006, СО РАСХН ВНИИБТЖ); Международной научно-практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006г); Международной научно-практической конференции посвященной 60-ти летаю Краснодарского НИВИ (Краснодар, 2006).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложения. Список использованной литературы включает 145 наименований, в том числе 50 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 6 рисунками.
Методы индикации и идентификации микоплазм
Микоплазмы - это мельчайшие прокариоты, занимающие промежуточное положение между фильтрующимися бактериями и вирусами, без регидной клеточной стенки, ограниченные лишь трехслойной цитоплазматической мембраной. Они относятся к классу - Mollicutes, состоящему из трех семейств: Mycoplasmatoceae, Acholeplasmataceae играющие роль в патологии животных, человека и птиц, а так же Splroplasmatoceae, участвующие в патологии растений и насекомых.
Этиологическое значение микоплазм в патологии животных установили впервые в 1898 г при контагиозной перепневмонии крупного рогатого скота Nocard и Roux. Они изолировали из плеврального экссудата больных животных фильтрующийся агент и разработали способ его выращивания на Мартеновском бульоне с сывороткой крови. Это открытие, дало толчок для дальнейших исследований, которые увенчались успехом - были выделены новые виды микоплазм животных и человека требующие дальнейшего изучения.
Множество ученых второй половины двадцатого века изучали возбудители микоплазмозной инфекции разных видов животных Я.Р. Коваленко, Э. А. Шегидевич, И. А Яблонская, М. А. Сидоров (1972, 1976, 1977, 1980) П. М. Митрофанов, К. М. Хакимова, X. 3. Гаффаров -микоплазмоз крупного рогатого скота (1977, 1978, 1982, 1984). В. П. Бердник, В. Д. Настенко - микоплазмоз свиней (1985,1986). В 90-х годах микоплазмология стала широко изучаемой наукой как в ветеринарии - В. Г.Ощепков, М. Н. Шадрина, Н. Н. Шкиль (2000,2001), так и в медицине, работали над данной проблемой сотрудники института им. Н. Ф. Гамалея: Ю. В Вульфович., С. В.Прозоровский, и др. (1995, 1997); по разработке питательных сред Э. М Ахмедова, М. М. Меджидов, П. М. Муртузалиева (1998) и Н. В. Рудаков, И. Е. Самойленко, О. Б. Калмин, Т. А. Решетникова, Г. В. Березкина из Омского НИИПОИ (1998); В. М. Чернов и О. А. Чернова изучали патогенетические основы микоплаз-мозной инфекции (1996,1997); современные методы диагностики - Е. В. Белоусова (1999), В. В. Мананков, В. П. Смелянский, Т. П., Пашнина, Р. А. Рыбкина.(1998), А. А. Астапова, Э. А. Мельникова, А. А. Зборовская (2000), Д.Н. Балабанов, И.В. Раковская и др. (2006).
В природе чаще всего встречаются именно смешанные инфекции, и имеют место многосторонние взаимодействия макроорганизмов со многими микроорганизмами. То, что микоплазмоз чаще проявляется в ассоциативной форме отмечали многие ученые. (Д.Б. Алымбаева, Г.Г. Миллер и др., 1985; П. М. Митрофанов, К. М. Хакимова, Х.З. Гаффаров, 1978; А. Я. Пустовар, 1995; 3. X. Ахмедшин и др., 1996; Л. И. Мальцева, 1996; Л. А. Газовская , 1997; Н. Н. Шкиль, 1999, 2000).
Наиболее хорошо изученным примером микоплазма-вирус-высший организм являются взаимоотношения М. arthitidis и (или) А. laidlawii и вируса Раушера в организме мыши, выявленных в сериях работ сотрудниками Института Эмбриологии и Микробиологии АМН СССР (В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган, 1973). В этих работах показано, что заражение мышей определенной линии, устойчивой к вирусу Раушера, не приводит к развитию лейкоза, но при одновременной инфекции этих мышей микоплазмами и вирусом Раушера у животных наблюдаются спленомегалия, инфильтрация селезенки незрелыми бластными клетками и другие проявления, которые у 20 - 40% зараженных мышей переходят в классический лейкоз. Авторы цитируемых работ связывают этот эффект с особой ролью мембранных белков микоплазм и возможным изменением проницаемости мембран клеток мыши (С. В. Прозоровский, И. В. Раковская, Ю. В. Вульфович,1995).
Другими авторами (П. М. Митрофанов , 1978; К.Б. Теохаров, 1998; Н. Н. Шкиль, 2000; L.J. Kusiluka , В. Ojeniyi, N.F. Friis, 2000), при проведении исследований на микоплазмоз было обнаружено, что мико-плазмы в большинстве случаев выделяются в ассоциативной форме с бактериальными агентами.
Большой интерес для практической ветеринарии представляет изучение микоплазма-вирусных и микоплазма-бактериальных ассоциаций. Особого внимания заслуживают смешанные микоплазма-вирусно-бактериальные инфекции, изучением которых занимались многие исследователи (Г. Г. Миллер, И. В. Раковская, В. Э. Березин , 1991; А. Я. Пус-товар , 1995; П. П. Фукс, Н. В. Калашник, Г. Б. Герус , 1995; Е. Э. Плот-ко, 1996; Е. И. Васильева и др., 1997).
В 1961 году В. Д. Тимаков и Г. Я. Каган предложили новый принцип классификации - этиологический, основанный на торопизме микоплазм к одинаковым органам и тканям разных хозяев, который был дополнен в 1968 году Г. Я. Каганом и И. В. Раковской. Согласно их классификации микоплазмы подразделяются в зависимости от локализации патологического процесса.
Микоплазмы в организме как человека, так и животных могут вызывать воспаления легких, суставов и урогенитального тракта. Так, у человека установлена патогенность М. Genitalium, Ureaplasma Urealiticum, часто в сочетании с хламидийной инфекцией (Ю. В. Вуль-фович, 1995) и реже в виде моноинфекций, например, они являются возбудителями негонококковых уретритов. К патогенным относят некоторые из штаммов М. hominis, часто выделяемые при инфекционном процессе (Freund, 1973).Многочисленные штаммы Ureaplasma Urealiticum выделяются от больных с воспалительными процессами урогенитальных путей и нарушением репродуктивной функции, а иногда и от практически здоровых людей (A. Bihari, 1997; М. Abele-Horn et al, 1997; М. Luo , L. Zhang ,Y. Xiao , 1998; L. Cedillo-Ramirez et al, 2000).
Выделение уреаплазм и микоплазм от здоровых людей рассматривается, как микоплазмоносительство, которое представляет значительную потенциальную опасность, так как Ureaplasma Urealiticum признанный этиологический агент негонококковых уретритов. М. Hominis, также может быть причиной уретритов, простатитов, пиелонефритов, играть некую роль в генезе патологии беременности, плода и новорожденных (3. П. Наумец с соавт., 1977; П. М. Митрофанов , 1982; 3. X. Ах-медшин с соавт., 1996; Е. С. Мальцева, 1996; Е. Э. Плотко, 1996; Е. И. Васильева с соавт., 1997 Дерябин Д. Г., 2000).
Значение микоплазм в решении проблемы бесплодия крупного рогатого скота начали изучать с начала 50-х годов после того, как в 1947 году D. Edward выделил из вагинальной слизи коров и спермы быков микоплазмы. С помощью этих штаммов ему удалось воспроизвести искусственный вагинит у коров (D. Edward, 1954).
Бактериологические методы диагностики урогенитального микоплазмоза
Работа проводилась в лаборатории микстинфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней ИВМ Ом ГАУ и хозяйствах Омской области.
Для изучения эпизоотической ситуации по урогенитальному микоплазмозу крупного рогатого скота и его ассоциативным формам были проведены комплексные обследования хозяйств с применением эпизо-отологического, клинического, бактериологического и серологических методов (РНИФ И РНГА). Для лабораторных исследований брали цер-вико-вагинальную слизь, молоко и сыворотку крови коров родильно-профилакторного периода; препуциальные смывы, сперму и сыворотку крови быков-производителей; патологический материал от абортированных плодов.
На основании полученных результатов установлено, что уроге-нитальный микоплазмоз крупного рогатого скота широко распространен в Омской области (табл. 2.2.1.) Из 34 обследованных хозяйств микоплазмоз отсутствовал только в трех, при этом в виде моноинфекции данная болезнь проявлялась лишь в 16% хозяйств, а в остальных инфекционный процесс носил ассоциативный характер.
Так, наиболее насыщенный микробный пейзаж имел место в к-зе «Россия» Любинского райнона, там выделяли в тех или иных сочетаниях возбудителей микоплазмоза и 10-ти сопутствующих инфекций, притом, что микоплазмы присутствовали у всех обследованных животных. В другом хозяйстве этого же района - ЗАО им. «Розы Люксембург» микоплазмы выделяли у 75% коров и телок, при этом ассоциации мико-плазм с возбудителями ИРТ-ПВ, хламидиоза, ку-лихорадки (риккет 43 сиоза) встречались в 20% случаев, ИРТ-ПВ и хламидиоза в 10%; ми-коплазмоз в виде моноинфекции встречался только у 10% животных.
Высокий процент пораженных микоплазмами животных отмечали в хозяйствах Кормиловского района. Так, в ЗАО «Знамя» и ООО «Молзавод Кормиловский» микоплазмы выявляли у 100% обследованных коров, в хозяйстве Агрофирма «Кормиловская» у 90%, в ООО «Со-сновское» и «Ачаирский-1» по 80%. В других хозяйствах: ЗАО «Русский хлеб», к-з им. Карбышева, СПК «Ермолаевское», ЗАО «Алексеевское» поражено микоплазмами было меньшее количество животных - от 20 до 60%. В виде моноинфекции микоплазмоз присутствовал только в одном хозяйстве - ЗАО «Русский хлеб», в остальных же хозяйствах наблюдались всевозможные ассоциации микоплазм с сальмонеллами, хламидия-ми, листериями, лептоспирами, риккетсиями, вирусом ИРТ-ПВ и кокками. Так, в колхозе им. «Карбышева» у животных обнаружены ассоциации микоплазм с хламидиями в 60% и с риккетсиями в 10% случаев.
В ОПХ «Боевое» Иссилькульского района наряду с микоплазмами выделяли у 30% животных хламидии, у 10% - вирус ИРТ-ПВ сальмонеллы и кокки, у 5 % лептоспиры и риккетсии. У обследованных животных ЗАО «Лесное» и СПК «Украинский» микоплазмы присутствовали в 40% проб исследуемого материала, при этом в первом хозяйстве микоплазмоз проявлял себя в виде моноинфекции, а во втором носил ассоциативный характер.
Наиболее пестрый микробный пейзаж имел урогенитальный тракт у животных из хозяйств: 1) «Новороссийское», 2) «Заря свободы», 3) «Новорождественское», 4) «Нива», 5) «Цветочное». При этом в первом хозяйстве вместе с микоплазмами выделяли в 20% случаев хламидии, лептоспиры и листерии, и в 10% вирус ИРТ-ПВ, сальмонеллы и риккетсии. Во втором хозяйстве у 10% коров выявляли ассоциативную форму проявления микоплазмоза с сальмонеллезом и хламидиозом одновре 44 менно и при этом присутствовали практически все исследуемые инфек ции, а в третьем - наряду с микоплазмами, хламидиями, вирусом ИРТ ПВ добавились в различных сочетаниях: риккетсии, лептоспиры, пасте реллы, диплококки, стрептококки и стафилококки. В четвертом хозяй стве вместе с микоплазмозом у одних и тех же животных в 10% случа ев регистрировали хламидиоз, пастереллез, стрептококкоз. В пятом хо зяйстве выделяли у 10% животных из маточно-влагалищного секрета одновременно с микоплазмами следующие ассоциации микроорганиз мов: вирус ИРТ-ПВ + лептоспиры + хламидии+ стрептококки. В хозяй стве «Новоазовское» в 20%) регистрировали микоплазмоз с ИРТ-ПВ и в 5% случаев в различных сочетаниях с ИРТ-ПВ, диплококкозом, ку лихорадкой и хламидиозом. В ЗАО «Кам-Курское» у 30% коров обна ружена хламидиозно- микоплазмозная инфекция, у 8% микоплазмо хламидиозно-сальмонеллезная инфекция, у 4% - микоплазмо хламидиозно-диплококковая и микоплазмо-хламидиозно сальмонеллезно- ИРТ-ПВ инфекции. В ЗАО «Дружба» в микропарази-тоценозе урогенитального тракта также были обнаружены ассоциации микоплазм с хламидиями у 40% и с вирусом ИРТ-ПВ у 10% коров и нетелей. В чистом виде микоплазмоз регистрировали в хозяйствах: «Колос», «Чистовское», «Рогозинское», а в «Любимовское», «Руспол» и «Береговое» отмечали ассоциации только с хламидиозом.
Результаты исследования спермы для искусственного осеменения от быков производителей во всех исследуемых хозяйствах были отрицательными. При исследовании в препуциальных смывах быков, используемых для вольной случки в СПК «Ермолаевское», были обнаружены микоплазмы в ассоциации с вибрионами, хламидиями, риккетсиями и лептоспирами. (табл. 2.2.2.).
Получение микоплазмозных антигенов и диагностических кроличьих сывороток для РНИФ
В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума были выбраны эритроциты барана, а для стабилизации 20% формальдегид. При формалинизации эритроцитов использовали свежую дефибри-нированную кровь барана- донора, которую разводили 1:1 буферным физ. раствором рН- 7,2 (0,137 М NaCl, 0,001 М двузамещенный фосфор-но-кислый К на 1л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводили по методу Фили в модификации Красикова А.П. (1996), которая заключалась в более щадящем способе воздействия формалина на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего, к 100 мл разведенной крови формалин добавлялся к эритроцитам не сразу, а порциями в возрастающих объемах, через определенный промежуток времени. Вначале вносили 6 мл 20%) формальдегида, затем через каждые 15минут 7, 8, 9, 10 мл, смесь после каждого внесения перемешивали на водяной бане при 70С до приобретения ею темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывали фосфатно-буферным раствором рН -7,2, путем центрифугирования при 3000 g 2-5 мин и ресуспендировали в 400 мл того же буфера. Из осадка готовили 10% рабочую взвесь на буферном физ. растворе, содержащем 0,3% двадцати процентного формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течении 5-ти лет.
Антиген готовили из трехсуточных убитых культур М. bovoculi, М. argenini и Ureaplasma sp., которые отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 6000 g 30 мин, осадки трех культур после трехкратного ресуспензирования и последующего центрифугирования смешивали в равных количествах и разводили 1:10 физиологическим раствором. Для нагрузки формалинизированных 3% эритроцитов их сенсибилизировали в соотношении 2:1 (2V антигена : IV эритроцитов). Сенсибилизацию проводили на водяной бане при температуре +70С в течение 30 мин., при перемешивании взвеси через каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситинов на эритроцитах добавляли 1% нейтрального формалина.
Для контроля пригодности полученного эитроцитарного диагно-стикума проводили постановку РНГА. Реакцию ставили макрометодом в обьеме 0,5 мл в полистироловых пластинках, с микоплазмозными (Г, А, У - сыворотками) и смешанной (Г +А + У) микоплазмозными сыворотками в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. В качестве разбавителя применяли фосфатный буфер рН- 6,4., так как, по данным А.П. Красикова (1995), при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля использовали фосфатный буферный раствор и отрицательную сыворотку.
С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешенной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагировал на три креста до разведения 1:80, на два креста 1:160. С отрицательной сывороткой сомнительная реакция на два креста отмечалась в первом разведении. В контроле с буферным раствором отрицательная реакция наблюдалась во всех разведениях (табл. 2.4.4.1)
При изучении специфичности трех серий полученных микоплаз-мозных эритроцитарных диагностикумов (МЭД) установлено, что только в титре 1:10 МЭД в РНГА вызывал перекрестные реакции с бруцеллезной, лептоспирозной, сальмонеллезной, и хламидиозной сыворотками, тогда как в последующих разведениях РНГА была отрицательной при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками (табл. 2.4.4.2.). Таким образом, полученный нами эритроцитарный диагностикум можно использовать для диагностики урогенитального микоплазмоза крупного рогатого скота. При этом за диагностический титр в РИГА необходимо принимать разведение испытуемой сыворотки 1:20 .
Для подбора наиболее эффективных препаратов для лечения животных при урогенитальном микоплазмозе определяли чувствительность полевых культур микоплазм к антибактериальным препаратам методом серийных разведений.
Для определения чувствительности к препаратам использовали культуры микоплазм выделенные в хозяйствах Омской области. Перед определением чувствительности устанавливали титр культур в цветооб-разующих единицах (ЦОЕ). Для постановки реакции использовали культуры микоплазм с титром, равным 10 тыс. ЦОЕ/мл. Чувствительность определяли по отсутствию роста на жидких питательных средах с добавлением антибиотиков, в контрольные среды антибиотик не добавляли (табл. 2.5.1.).
Наиболее высокая чувствительность культур микоплазм к тетрациклину - 83-97%, ципрофлоксацину - 63-90% и норфлоксацину от 40 до 90%. Около половины исследуемых культур не выросло на средах с левомицетином. Менее чувствительны данные культуры микоплазм к эритромицину, сульфадимезину, тиланику, тилозину, триметаприму и тетра-триметосулу. Совсем не чувствительны - к бензилпенициллину.
Чувствительность разных культур микоплазм к тем или иным препаратам была не одинакова: к тилозину тартрату чувствительны 63% культур уреаплазм, 20% - М. arginini и не чувствительны М. bovoculi; к триметаприму чувствительны 40% культур М. bovoculi, 16% - М. arginini и нечувствительны уреаплазмы; тиланик действовал только на М. аг 76
ginini. Культуры микоплазм более чувствительны к антибактериальным препаратам, чем уреаплазмы.
Изучение различных схем лечения и лабораторных методов контроля их эффективности
Для выявления микоплазмозных антител в сыворотке крови некоторые исследователи применяли реакцию непрямой гемагглютинации так как она чувствительна, специфична и может служить простым и быстрым методом (Ю. В. Вульфович с соавт.,1995; П. М. Митрофанов, 1982; Н. Н. Шкиль, 2000). Для постановки реакции нужен эритроцитар-ный диагностикум. В связи с этим эритроциты готовили по методу Фили в модификации А.П. Красикова (1996), которая заключалась в более щадящем способе воздействия формалина на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для нагрузки эритроцитов смешивали антигены трех штаммов микоплазм - М. bovoculi, М. argenini и Ureaplasma sp., делали разведение 1:10 на 0,9% физ. расстворе. РИГА ставили макрометодом с микоплазмозными сыворотками в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешенной против трех видов микоплазм сывороткой полученный диагностикум реагировал на три креста до разведения 1:80, на два креста 1:160.
При сравнении бактериологического и серологического методов установленно, что результаты данных исследований, как правило, совпадают. Анализ данных отечественной и зарубежной литературы, в отношении различных методик индикации и идентификации возбудителя из первичного материала, показывает, что в основном современная диагностика микоплазмоза основывается на иммунологических и бактериологических подходах. Полученные первичные изоляты на специальных питательных средах для роста микоплазм, подвергают дальнейшим исследованиям с помощью экспресс-методов: реакций иммунофлюорес-ценции (РНИФ, РПИФ, РТИФ), иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием моноклональных антител МАТ или поликлональных антител ПАТ; радиоиммунологического анализа (РИА), хемиолюминес-центного анализа (ХЛИА); ДНК - диагностики: ДНК-гибридизации; по-лимеразная цепная реакция (ПНР). Последний является не только более быстрым, но и наиболее точным, выявляя минимальное количество ми-коплазмозной ДНК. Эти методы нашли свое широкое применение в работах зарубежных авторов для видовой типизации возбудителей различных родов инфекционных болезней. Вместе с тем, данные методы диагностики не вышли за рамки научных исследований в медицине и ветеринарии и не нашли широкого применения в практике для проведения массовых диагностических исследований.
Предложенная нами схема индикации и идентификации микоплазм из первичного (нативного) биоматериала основана на комплексном подходе изучения ассоциативной формы микоплазмозной инфекции, легко выполнима в производственных и лабораторных условиях. С помощью серологического экспресс-метода (РНИФ) время диагностики сокращается до 60 мин, при выявлении микоплазмозного антигена. Наличие синтезируемых в организме антимикоплазмозных антител в сыворотки крови, методом РИГА также можно обнаружить через 60 мин. после постановки реакции. Бактериологический анализ, осуществим в течение одних - трех суток, который включает в себя не только культивирование микоплазм на специальных питательных средах, а также сопутствующей микрофлоры для изучения микст-форм течения инфекционного процесса. Данная методика поможет правильно и своевременно диагностировать ассоциативный микоплазмоз, что необходимо практикующим ветеринарным специалистам для разработки эффективных методов борьбы и профилактики с данной инфекцией. Предложенная схема идентификации может использоваться для определения видовой характеристики выделенных культур с дальнейшим их применением в качестве антигенов серологических реакций, изготовлении вакцинных препаратов или для иммунизации лабораторных животных с целью получения лечебных или диагностических гипериммунных сывороток.
Производственное испытание предложенной схемы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза подтверждает, что предложенные методы эффективны и информативны в отношении мико-плазмозной инфекции. На основании полученных результатов комплексных исследований цервико-вагинальной слизи, молока и сыворотки крови коров родильно-профилакторного периода, препуциальных смывов, спермы и сыворотки крови быков-производителей, патологического материала от абортированных плодов было установлено, что урогенитальный микоплазмоз крупного рогатого скота широко распространен в Омской области. Из 34 обследованых хозяйств микоплазмоз отсутствовал только в трех, при этом в виде моноинфекции данная болезнь проявлялась лишь в 16% хозяйств, а остальных инфекционный процесс носил ассоциативный характер.
Комплексное применение бактериологических и серологических исследований позволит своевременно выявлять как больных, так и ми-коплазмоносителей и проводить лечебно-профилактические мероприятия при данной инфекционной болезни.
