Введение к работе
Хроническая сердечная недостаточность - заболевание многофакторное. Применяемые на сегодня методы лечения способны замедлить развитие болезни, но постепенно заболевание прогрессирует и становится рефрактерным в отношении «традиционной» терапии. На поздних стадиях единственно эффективным методом лечения остается пересадка сердца. Однако возможности применения трансплантации сердца жестко ограничены дефицитом донорских органов. Поэтому в настоящее время сложилась настоятельная потребность в разработке и внедрении альтернативных методов лечения.
Стимуляция регенерации поврежденного органа - следующий после замещения способ лечения. Успех такого лечения существенным образом зависит от понимания молекулярных и клеточных механизмов развития сердечной недостаточности, ее прогрессирования и регрессии в результате регенерации миокарда. В связи с этим представляется важным изучение факторов детерминирующих, а также ограничивающих регенеративные возможности организма взрослого. Открытым остается также вопрос о сохранении способности к регенерации в конечно-дифференцированных тканях человека.
В колоссальном потоке современных исследований на данную тему отчетливо прослеживаются три основных направления. Во-первых, это создание имплантируемых протезов левого желудочка . Конкретные механизмы восстановления сердечной функции у больных при данном методе лечения остаются неясными, однако, предполагается активация регенерации зрелых клеток, либо стимуляция миграции стволовых клеток сердца или костного мозга в пораженный участок миокарда. Эта последняя возможность подкрепляется фактом обнаружения повышенного содержания факторов привлечения стволовых клеток (инсулин-подобного фактора роста 1 и фактора 1 стромы) в миокарде пациентов после операции (AssmusB., et al., 2002; Adams G. et al., 2007).
Вторым активно развивающимся в последние 20 лет направлением является применение генной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и сердечной недостаточности, в частности ( Isner J., 2002; Henry Т. et al., 2003 ). Несмотря на связанные с этим направлением большие ожидания и огромный энтузиазм исследователей, реальный прогресс весьма ограничен, что объясняется как трудностью разработки эффективного метода доставки соответствующего гена в пораженный участок, так и сложностью выбора подходящего гена. Дополнительной возможностью служит применение клеточной терапии в качестве средства доставки терапевтического» гена. В целом генная терапия остается перспективной возможностью стимуляции регенерации миокарда, как сама по себе, так и в сочетании с другими способами регенеративной
терапии. Однако успех этого направления полностью зависит от интенсивности исследовательской работы.
Третьей по порядку изложения, но не по важности, возможностью регенеративной терапии сердечной недостаточности является клеточная терапия. На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что кардиомиоциты плода могут формировать межклеточные контакты с клетками миокарда, однако практической перспективы применения данный источник стволовых клеток не имеет ( Strauer В., 2003). Наиболее практичной в настоящее время возможностью представляется использование аутологичных либо гомолопгчных стволовых клеток взрослого, выделяемых щ костного мозга, крови, жировой ткани, скелетных мышц, или непосредственно из сердца. На экспериментальных моделях сердечной недостаточности была продемонстрирована потенциальная способность клеток из вышеперечисленных источников улучшать функцию миокарда (Szmitko P., et al. 2003). Нуждается в дальнейшей отработке еще целый ряд вопросов, таких как оптимизация выбора клеток для введения и способа введения, недостаточное выживание введенных клеток и низкая скорость их пролиферации после инъекции, а также изучение способности введенных клеток к трансдифференцировке и интеграции, либо к воздействию на оставшийся жизнеспособным миокард через паракриновый эффект. Прояснение этих основных моментов необходимо для оптимизации условий клеточной терапии, сочетающей максимальный клинический эффект с минимумом осложнений.
Целью настоящей работы стала разработка безопасных и эффективных методов генной и клеточной терапии, которые могли бы использоваться изолированно или в дополнение к существующим традиционным хирургическим методам для лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Задачи исследования
-
Проанализировать и охарактеризовать состояние миокарда в предполагаемой зоне введения терапевтических агентов для стимуляции ангио/миогенеза.
-
На модели ишемии задней конечности крысы исследовать эффективность полученных нами генетических препаратов VEGFics и bFGF.
-
В культуре in vitro, а также путем непосредственного анализа выделяемых ех-vivo стволовых клеток-предшественников охарактеризовать их фенотип, а также пролиферативный и дифференцировочный потенциал.
-
На ограниченном контингенте больных с ИБС и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения генетических препаратов -стимуляторов ангаогенеза.
-
На ограниченном контингенте больных с сердечной недостаточностью и ХИНК провести оценку эффективности клинического применения стволовых клеток-предшественников для стимуляции ангио- и миогенеза.
-
Выработать и обосновать критерии отбора, а также рациональные и безопасные методы доставки и тактику применения генетических и клеточных препаратов для лечения больных с сердечно-сосудистой патологией.
Научная новизна работы. Создана уникальная плазмидная конструкция, позволяющая эффективно экспрессировать ген VEGFi65 в тканях и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей.
Впервые продемонстрирована большая по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2* клетками способность клеток CD133+/CD34-/VEGFR-2+ к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка, и тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.
Впервые показано, что в зависимости от локализации ишемии, внутримышечное и/или интраартериалыюе введение CD133+ аутологичных костномозговых клеток-предшественников ведет к достоверному улучшению перфузии вследствие формирования новой сосудистой сети.
Практическая значимость работы. Разработанная на основе гена VEGF^s генетическая конструкция внедрена в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева и успешно применяется для лечения больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей с целью реваскуляризации пораженных тканей. В результате изучения потенциала к пролиферации, дифференциации и регенерации стволовых клеток костного мозга разработаны и внедрены в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева методы клеточной терапии ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.
Материалы работы могут рекомендованы к применению в научно-педагогической деятельности кардиохирургичееких центров нашей страны, в которых осуществляется квалификационная подготовка специалистов, работающих в кардиологии и кардиохирургии.
Результаты данной работы внедрены в клиническую практику Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, а также материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов, в
сертификационном курсе для сердечно-сосудистых хирургов, проходящих обучение на базе НЦССХ им. А.Н.БакулеваРАМН.
Положения, выносимые на зашиту:
-
Дополнительная стимуляция процессов ангио/миогенеза в ишемизированиых тканях ведет к улучшению прогноза течения заболевания и улучшению качества жизни больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей.
-
Применение плазмидной генетической конструкции (ангиостимулин) безопасно для больного, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGFi65, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированиых тканях.
-
Популяция стволовых CD 133+/CD347VEGFR-2+ клеток-предшественников обладает большим дифференцировочным потенциалом в направлении неоангиогенеза по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками, что обусловливает их большую терапевтическую эффективность.
-
Терапевтическая эффективность аутотрансплантации стволовых CD133* клеток определяется в том числе способом введения. В то время как интра-миокардиальный способ достоверно улучшает перфузию ишемизированного миокарда, шпракоронарное введение не оказывает влияния на данный параметр.
Апробация диссертации состоялась 8 мая 2009 года на заседании апробационного совета НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН.
Публикации. По теме работы опубликовано 43 научные работы, из них 16 - в центральной (в том числе зарубежной) печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 186 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы из 10 отечественных и 323 зарубежных источников. Диссертация содержит 40 таблиц и 70 рисунков.
