Содержание к диссертации
Введение
Концепция роста и развития сосудистой сети 11
Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток 11
Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза 13
Ангиогенез. Стабилизация стенки сосуда 14
Артериогенез. Ремоделирование стенки сосуда 16
Лейкоциты и тромбоциты в ангиогенезе 17
Протеазы в ангиогенезе и артериогенезе 17
Генная терапия 18
Генетические векторы 19
Факторы, используемые для стимуляции ангиогенеза 21
Клетки организма как основа клеточной терапии 22
Представление о терапевтическом воздействии клеток 23
Эмбриональные стволовые клетки 24
Моноядерные клетки костного мозга 25
Мезенхимальные стволовые клетки , 26
Предшественнники эндотелиальных клеток 26
Миобласты 28
Зрелые дифференцированные клетки взрослого организма 28
Стромальные клетки жировой ткани 29
Нейрональная дифференциация 31
Дифференциация СКЖТ в клетки соединительной ткани 32
Дифференциация СКЖТ в жировую ткань 32
Дифференциация СКЖТ в костную ткань 33
Дифференциация СКЖТ в хрящевую ткань 33
Дифференциация СКЖТ в миогенную ткань 34
Дифференциация СКЖТ в кардиомиоциты 34
Клональный анализ клеток СКЖТ 35
СКЖТ и гематопоэз 36
CLASS Материал и методы исследовани CLASS я. 38
Эксперименты с культурами клеток. 38
Выделение стромальных клеток жировой ткани ,.38
Выделение клеток из жировой ткани человека .38
Выделение клеток из жирового отложения мыши 39
Культивирование СКЖТ 40
АЕіализ экспрессии антигенов на поверхности клеток 40
Культивирование СКЖТ человека в условиях гипоксии 42
Анализ способности СКЖТ человека к адипоцитарной дифференциации 43
Молекулярные и биохимические эксперименты 43
Анализ накопления факторов, секретируемых СКЖТ человека, в среде культивирования 43
Определение активности бета-галактозидазы 44
Анализ экспрессии мРНК СКЖТ человека 45
Выделение РНК 45
Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция
в реальном времени 45
Анализ влияния среды культивирования СКЖТ человека на рост ЭК .46
Трансфекция СКЖТ человека 47
Плазмидная трансфекция клеток 47
Трансфекция клеток аденовирусом 48
Трансфекция клеток ленти вирусом 48
Эксперименты на животных .. 48
Имплантация чСКЖТ в матригеле 48
Оценка выживаемости и миграции клеток 49
Модель ишемии нижней конечности мыши и трансплантация СКЖТ 50
Измерение кровотока 50
Иммуиогистохимический анализ 51
Подготовка тканей 51
Детектирование антигена мыши CD31 на срезах мышц и матригелей 51
Детектирование антигенов человека CD31 и CD34 на срезах жировой ткани
и щитовидной железы 52
Подсчет капилляров 53
Статистическая обработка данных 53
CLASS Результаты исследования CLASS .,,, 54
Выделение и культивирование СКЖТ человека 54
Выделение и культивирование СКЖТ мыши 55
Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ человека 58
Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ мыши 67
Влияние среды культивирования СКЖТ человека на способность клеток
к адипоцитарной дифференциации , 69
Экспрессия факторов роста СКЖТ человека 71
Влияние среды культивирования СКЖТ человека на пролиферацию эндотслиальных клеток , 75
Развитие сосудистой сети в клеточном имплантатс 76
Влияние системного введения СКЖТ человека на ангиогенез и восстановление
кровотока в конечности мыши 77
Анализ эффективности трансфекции СКЖТ человека 80
Оценка выживания и миграции в мышечной ткани локально введенных чСКЖТ.,83
Анализ влияния высокал ори иной диеты на аккумуляцию СКЖТ
в жировой ткани мыши 85
Обсуждение результатов. , 89
СКЖТ: анализ антигенов... 89
Влияние диеты на аккумуляцию СКЖТ 91
Терапевтический потенциал СКЖТ 93
Повышение терапевтического эффекта СКЖТ 95
Возможные побочные эффекты использования СКЖТ 96
Выводы 98
Список литературы... 99
- Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток
- Клетки организма как основа клеточной терапии
- Выделение стромальных клеток жировой ткани
- Анализ накопления факторов, секретируемых СКЖТ человека, в среде культивирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смертности во всем мире. Традиционные методы лечения данных заболеваний - медикаментозная терапия, эндоваскулярная и хирургическая реваскуляризация (ангиопластика и аортокоронарное шунтирование). Каждый из этих подходов не лишен недостатков: медикаментозное лечение характеризуется недостаточной эффективностью, ангиопластика - развитием рестенозов, необходимостью повторения процедуры через каждые три-пять лет, аортокоронарное шунтирование - проведением операции на открытом сердце.
Клеточная и тканевая трансплантология представляет собой одно из наиболее приоритетных направлений современной биомедицины и биотехнологии. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления повреждений тканей сердца и мозга, вызванных инфарктами, инсультами и дегенеративными заболеваниями, для лечения ишемических болезней сердца и нижних конечностей, для восстановления функций печени и стимуляции кроветворения.
По данным лабораторных и клинических исследований в области клеточной терапии наиболее изученными на данный момент являются эмбриональные стволовые клетки [Yamashita et al., 2000; Smith et al., 2001; Klug et al., 1996], скелетные миобласты [Menasche et al., 2003; Menasche et al., 2003; Pagani et al., 2003], мезенхимальные клетки костного мозга [Perm et al., 2003; Assmus et al., 2002] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [Assmus et al., 2002; Masuda et al., 2000; Kawamoto et al., 2001]. Хотя терапевтический эффект продемонстрирован для всех этих типов клеток, сложность их получения в достаточном количестве и невозможность рутинного использования по этическим причинам (для эмбриональных стволовых клеток), болезненность процедуры получения клеток у пациентов (в случае мезенхимальных клеток костного мозга и миобластов), развитие тяжелых побочных эффектов (аритмий)
«[^Петербург
при использовании скелетных миобластов приводит к необходимости поиска других источников мультипотентных/стволовых клеток.
Ранее при гистологическом исследовании жировой ткани человека было обнаружено, что в ней содержится популяция клеток, позитивных по антигену CD34 [Stashower et al., 1999]. Экспрессия антигена CD34 характерна для гематопоэтических клеток-предшественников [Civin et al., 1984; Katz et al., 1985; Andrews et al., 1986], субпопуляций эндотелиальных клеток [Fina et al., 1990; Baumheter et al., 1993; Delia et al., 1993], а также для субпопуляций стромальных клеток и их предшественников в костном мозге и ряде других органов [Simmons et al., 1991; Garcia-Pacheco et al., 2001; Kuroda et al., 2004]. Обнаружено, что CD34+ клетки костномозгового происхождения способны дифференцироваться в эндотелиальные [Wijelath et al., 2004; Yeh et al., 2003], гладкомышечные клетки [Yeh et al., 2003], а также в эпителиальные и нейрональные клетки [Zhao et al., 2003].
Популяцию клеток, обогащенную С034-позитивными клетками удается выделить из образцов жировой ткани, полученных при косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Ферментативная обработка образцов жировой ткани раствором коллагеназы, с последующим центрифугированием полученной суспензии клеток, приводит к формированию осадочной фракции клеток стромально-васкулярного фенотипа (с примесью клеток крови), содержащей высокий процент CD34+ клеток [Rehman et al., 2004; Planat-Benard et al., 2004].
Работы, проведенные группами исследователей в США, Германии, Франции и Японии, продемонстрировали, что часть выделенных таким способом клеток, относящихся к стромальной, а не к адипоцитарной фракции жировой ткани, при культивировании в специально подобранных условиях способна дифференцироваться в адипоциты, хондроциты, в клетки костной и нервной тканей, эндотелиальные клетки и ряд других типов клеток [Safford et al, 2002; Zuk et al, 2002; Gronthos et al, 2001; Wickham et al, 2003; Mizuno et al, 2002; Planat-Benard
et.al., 2004; Ogawa et.al., 2004]. Весьма вероятно, что фракция клеток, полученная в результате ферментативной обработки жировой ткани, содержит мульти-потентные клетки стромы, принимающие участие в формировании жирового отложения [Ailhaud et al., 1992]. На сегодняшний день не существует общепринятого названия этой фракции клеток. В разных работах ее называют по разному: стромальными клетками жировой ткани (СКЖТ) [Gronthos et al., 2001; Planat-Benard et al, 2004; Rehman et al., 2004], клетками процессированного липо-аспирата [De Ugarte et.al., 2003], стромально-васкулярной фракцией жировой ткани [MiranviUe et.al., 2004], мезенхимальными клетками жировой ткани [Lee etaL, 2004 ].
Важным преимуществом использования СКЖТ в терапевтических целях является то, что эти клетки относительно легко и в достаточно большом количестве могут быть получены из жировой ткани. К настоящему времени СКЖТ были выделены из жировой ткани человека [Gronthos et al., 2001], свиньи [Tchoukalova et al., 2001], крысы [Huang et al., 2002; Tholpady et al., 2003; Huang, 2002; Huang et al., 2002] и мыши [Cousin et al., 2003]. Все эти клетки, хотя и отличаются по набору основных антигенов, представленных на их мембранах, обладают схожей дифференцировочной способностью.
Цель данной работы заключалась в изучении проангиогенных свойств стромальных клеток жировой ткани и возможности их использования для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей в экспериментах на животных.
В рамках реализации этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:
Подобрать оптимальную методику выделения и культивирования СКЖТ* человека и мыши.
* Список используемых сокращений - см. на последней странице.
Проанализировать уровень экспрессии маркерных антигенов клеток-предшественников и эндотелиальных клеток на поверхности СКЖТ человека и мыши, а также динамику экспрессии этих антигенов в процессе культивирования с помощью метода иммунофлуоресценции.
Провести оценку экспрессии и секреции СКЖТ ряда ангиогенных факторов роста в условиях нормоксии и гипоксии с помощью ПЦР в реальном времени иИФА.
Исследовать влияние культуральной среды СКЖТ, культивировавшихся в условиях нормоксии и гипоксии, на жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток.
Подобрать оптимальный метод трансфекции СКЖТ генетическими векторами различных типов и определить динамику экспрессии трансгенов после различных методов трансфекции.
Изучить способность СКЖТ стимулировать ангиогенез на моделях подкожного имплантанта и ишемии задней конечности мыши.
Исследовать влияние высококалорийной диеты на аккумуляцию мульти-потентных клеток в жировой ткани мыши.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что гетерогенная популяция свежевыделенных СКЖТ содержит высокий процент клеток, экспрессирующих антигены клеток-предшественников (CD34 для человека и Sca-І для мыши); проведен анализ динамики экспрессии маркеров клеток-предшественников в процессе культивирования СКЖТ и показано обогащение популяции клетками, несущими маркеры мезенхимальных клеток костного мозга и уменьшение клеток, экспрессирующих антигены клеток-предшественников. Установлено, что СКЖТ человека секретируют в значительном количестве такие ангиогенные факторы, как VEGF, HGF, bFGF и др.; экспрессия и секреция этих факторов усиливается в 2-5 раз при культивировании клеток в условиях гипоксии. Показано, что продукты секреции СКЖТ человека
способствуют выживанию и пролиферации эндотелиальных клеток, а также стимулируют развитие сосудистой сети в подкожных имплантантах матригеля у мыши. Внутривенное введение иммунодефицитным мышам СКЖТ человека способствует восстановлению кровотока и предотвращению развития некроза стопы в ишемизированной конечности мыши. Установлено, что СКЖТ человека поддаются трансфекции с высокой эффективностью вне зависимости от используемого вектора (плазмида, адено- или лентивирус). Показано, что высококалорийная диета вызывает аккумуляцию СКЖТ мыши в жировом отложении.
Результаты данной работы могут служить основой для разработки новых технологий использования стромальных клеток жировой ткани для аутологичес-кой клеточной трансплантации с целью стимуляции ангиогенеза при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с нарушением кровоснабжения тканей, а также для использования их как переносчиков терапевтических генов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях Sixth Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy (Вашингтон, США, 2003), 53rd Annual Scientific Session of American College of Cardiology (Новый Орлеан, США, 2004), International Fat Applied Technology. (Питтсбург, США, 2004), 54rd Annual Scientific Session of American College of Cardiology (Орландо, США, 2005), на межлабораторном семинаре ИЭК РК НПК МЗСЗ РФ (Москва, сентябрь 2004).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано две статьи и тезисы 3 докладов, одна статья принята в печать.
Структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 280 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение стромальных клеток жировой ткани
Стромальные клетки жировой ткани были выделены из продуктов липосакции человека (чСКЖТ) и жировых отложений у мышей линий C57BL/6J и СЗНеВ/FeJ (мСКЖТ). Образцы «гомогенизированной» жировой ткани подвергали ферментативной обработке при 37 С в течение 45-90 мин в растворе коллагеназы I типа (200 ед/мл) в случае человека, или в растворе коллагеназы I типа и диспазы (25 ед/мл) в случае мыши. После серии последовательных процессов фильтрования и центрифугирования полученный осадок клеток, состоящий из отдельных нежировых клеток, дополнительно обрабатывали лизирующим буфером «красных клеток крови» (154 мМ NH4C1, 10 мМ КНС03, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 5 мин при 37 С с последующим центрифугированием. Полученную осадочную фракцию клеток ресуспендировали в ФСБ или в среде культивирования.
Культивирование СКЖТ
После выделения клетки культивировали в пластиковых флаконах в инкубаторе при 37 С и при 5%-ой концентрации С02. По достижении конфлюента монослой клеток обрабатывали раствором 0,25%трипсина/0,02% ЭДТА/ФСБ. СКЖТ человека культивировали в средах: 1) EGM-2mv (Cambrex) или 2) DMEM/10% ЭСБ/100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. СКЖТ мыши культивировали в средах: 1) MyeloCult (Stemcell) или 2) DMEM/10% ЭСБ/100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток проводили на
свежевыделенных, предкультивированных (в течение 24 часов) и конфлюентных клетках. Клетки открепляли от поверхности культурального пластика, обрабатывая их раствором 2 мМ ЭДТА/ФСБ (5 мин, 37 С).
100 мкл СКЖТ человека и мыши в ФСБ (1-10х106 клеток/мл) инкубировали с флуоресцентно мечеными моноклональными мышиными антителами против
человеческих антигенов (в случае человека) или с флуоресцентно мечеными моноклональными крысиными антителами против мышиных антигенов (в случае мыши) в концентрации 10 мкг/мл в течение 20-30 мин во льду. Клетки отмывали от антител добавлением в пробирки 2 мл ФСБ/1%ЭБС с последующим центрифугированием клеток в течение 5 мин при 300 g при 4 С. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и фиксировали в 200 мкл 2% формальдегида. Процент клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры, оценивали с помощью проточного флуориметра Calibur (Becton-Dickinson).
Культивирование клеток в условиях гипоксии
чСКЖТ второго пассажа за 15-18 часов до начала эксперимента сажали на
пластик с плотностью 5х104 клеток/см2 в среде ЕВМ-2/5%ЭСБ. Перед началом эксперимента среду культивирования повторно заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ и клетки культивировали 24-72 часа либо в стандартных условиях (21% 02), либо в условиях гипоксии (1% Ог).
Анализ содержания ангиогенных факторов в среде культивирования СКЖТ
Анализ накопления в среде культивирования СКЖТ факторов VEGF, HGF и
урокиназы проводили с помощью ИФА. Для оценки количества VEGF и HGF использовали наборы-реагенты компании R&D Systems, а для оценки концентрации урокиназы в образцах - набор реактивов IMUBIND uPA ELISA Kit (American Diagnostica Inc.).
Анализ экспрессии мРНК ангиогенных факторов в СКЖТ
Тотальная РНК была выделена из СКЖТ человека (пассаж 2),
культивированных в среде ЕВМ/5%ЭСБ в стандартных условиях и в условиях гипоксии в течение 24 часов. Для выделения РНК был использован набор реактивов RNase Miniprep Kit (Qiagen). Концентрацию РНК в полученных образцах определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм. После выделения/очистки РНК 2 мкг полученный материал (2 мкг) подвергали
реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов «Omniscript RT Kit» (Qiagen).
Экспрессию мРНК ряда ростовых факторов оценивали методом ПЦР в реальном времени, измеряя накопление продукта ПЦР после каждого цикла с помощью прибора ABI 7700 Sequence Detection System (Apply Bioscience Inc.). Используемая методика основана на способности реагента SYBR Green при связывании с двухцепочечными молекулами ДНК испускать флуоресцентный сигнал, интенсивность которого измеряется детекторами прибора.
Анализ влияния среды культивирования чСКЖТ на рост эндотелиальных клеток
За 24 часа до начала эксперимента микрососудистые эндотелиальные клетки человека (5-7 пассажей) сажали на пластик с плотностью 5000 клеток/см2 в EGM-2mv среде. За 15-18 часов до начала эксперимента среду заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ. Перед началом эксперимента среда в лунках заменялась на одну из следующих: 1) ЕВМ-2/5%ЭСБ; 2) 50%(ЕВМ-2/5% ЭСБ) + 50% среды, собранной с чСКЖТ, культивированных 72 часа в стандартных условиях (21% 02); 3) 50%(ЕВМ-2/5%ЭСБ) + 50% среды собранной с чСКЖТ, культивированных в течение 72 часов в условиях гипоксии (1% 02). Клетки культивировали в стандартных условиях. Через четыре дня клетки снимали с пластика и подсчитывали с помощью гемоцитометра.
Трансфекция чСКЖТ
Эффективность трансфекции чСКЖТ оценивали с испольюванием
плазмидных и вирусных генетических консгрукюв, кодирующих ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). В эксперименте использовали чСКЖТ пассажа 2. Эффективность трансфекции определяли по процентному содержанию GFP-позитивных клеток в культуре, оцененному на проточном флуориметре Calibur (Becton-Dickinson).
Плазмидная трансфекция клеток. Клетки сажали в лунки с плотностью 5x104 клеток/см2 за 4 часа до трансфекции в среде EGM-2mv. Трансфекцию
проводили плазмидой pGF-1032 с использованием реагента LipofectAmine 2000 (Invitrogen). Для определения оптимальной среды трансфекции клетки помещались в следующие типы сред: 1) DMEM с содержанием ЭСБ в пределах 0-10%; 2) ЕВМ с содержанием ЭСБ в диапазоне 5-10%.
Трансфекция клеток аденовирусом. Клетки наращивали до достижения 60% конфлюента в среде EGM-2mv, после чего среду заменяли на ЕВМ-2 и в нее добавляли концентрированный раствор аденовируса RAd CMV ТК IRES hrGFP из расчета 100 вирусных частиц на клетку. Клетки культивировали с вирусом в течение 2 часов, после чего среду заменяли на ЕВМ-2/5%ЭСБ.
Трансфекция клеток лентивирусом. Клетки наращивали до достижения 40% конфлюента, после чего среду замещали на 100% среду, собранную с клеток «293», трансфецированных лентивирусными плазмидами. Конечный титр вируса (pcDNA HIV CS-CGW) в наносимой среде - 106 вирусных частиц/мл, а наносимый объем рассчитывался из принципа, что на каждую трансфецируемую клетку приходилось по 10 вирусных частиц. Для повышения эффективности связывания вирусных частиц с поверхностью клеток в среду добавляли полубрин в концентрации 8 мкг/мл. Клетки инкубировали в присутствии вируса 15 часов, после чего среду заменяли на EGM-2mV.
Имплантация человеческих СКЖТ в матригеле под кожу мыши
Для данного эксперимента были использованы СКЖТ человека пассажа 1.
Мыши линии Nude получали инъекцию раствора матригеля подкожно в области паха. Мыши были разделены на три группы, каждая из которых получила инъекцию 400 мкл матригеля (Growth Factor Reduced Matrigel, BD Biosciences), смешанного со 100 мкл одного из следующих растворов: 1) ФСБ; 2) 250 мкг/мл bFGF/60 Ед гепарина; 3) чСКЖТ, пасс. 1 (2x106 клеток/мл) в ФСБ. Через 14 дней после начала эксперимента имплантанты матригелей были выделены, заморожены и проанализированы иммуногистохимическим методом на развитие капиллярной сети.
Оценка выживаемости и миграции клеток
Оценка выживаемости СКЖТ и способности их мигрировать внутри ткани после локального введения в мышцу проводили на мышах линии NOD/SCID. 105 DAPI-меченых клеток в 20 мкл ФСБ были локально введены в т. tibialis anterior. На седьмой день после введения из мышц были приготовлены серии замороженных срезов (10 мкм) через каждые 500 мкм. Выживаемость клеток в ткани оценивалась путем подсчета количества DAPI-позитивных клеток.
105 GFP-позитивных СКЖТ (пассаж 1) в 20 мкл ФСБ были локально введены в т. tibialis anterior. Для оценки миграции клеток внутри мышечной ткани проводили взятие материала для гистологического анализа через три часа, а затем через трое и семь суток после введения.
Модель ишемии задней конечности мыши и трансплантация СКЖТ человека
Ишемию нижней конечности создавали у мышей самцов 8-12 недельного возраста линии Nude. Операции проводили под общей анестезией. На коже средней части левого бедра делали продольный разрез длиной 8 мм, соединительную и жировую ткань расчищали в стороны от пучка бедренной артерии, вены и нерва, выделяли бедренную артерию (а также все ее веточки), а затем артерию перевязывали в области паховой связки сверху и снизу после бифуркации ее на подкожную и подколенную артерии. Все веточки артерии, находящиеся между основными лигатурами, также перевязывали, после чего сосуд вырезали. По окончании операции кожу на бедре зашивали.
На следующий день после проведения операции непосредственно после проведения первого измерения кровотока (базальный кровоток) мышам через хвостовую вену вводили в 200 мкл среды ЕВМ/5%ЭСБ 5x105 СКЖТ двух типов: 1) свежевыделенные, предкультивированные на пластике в течение 12-18 часов в среде EGM-2mv; 2) клетки пассажа 2, культивированные в среде EGM-2mv.
Измерение кровотока
Влияние введенных клеток на стимуляцию ангиогенеза оценивали по
восстановлению кровотока в подошвенной области лапы мышей. Оценку кровотока проводили с использованием лазер-допплеровского имиджера (Laser Doppler Imaging System, Moor) по методике Т. Couffinhal et al., 1998. Измерения кровотока проводили на 1-ый, 5-ый и 10-ый день после проведения операции. Животное анестезировали газовой смесью 1,5% изофлорана/02 и поддерживали на этой анестезии в течение всего измерения.
Иммуногистохимический анализ
Образцы мышц и матригеля замораживали в жидком азоте в среде О.С.Т. Tissue-Tek. Стекла со срезами тканей (толщиной 10 мкм) фиксировали в течение двух минут в ацетоне, охлажденном до -20 С. Активность эндогенной пероксидазы блокировали инкубацией срезов в растворе 0,3% Н2О2/ФСБ (10 мин), а неспецифическое связывание антител с образцами на стеклах блокировали инкубацией срезов в растворе БР: 2%БСА/5% кроличьей сыворотки/ФСБ (30 мин). После удаления излишка БР срезы инкубировали с крысиными моноклональными антителами против мышиного CD31 антигена (BD Pharmingen) в соотношении 1:50 в БР (60 мин). Для контроля на специфическое связывание антител с CD31 использовали неиммунные антитела крысы - IgG2a,k R35-95 (BD Pharmingen). В дальнейшем для детектирования антител, связавшихся с антигеном CD31, срезы последовательно инкубировали (30 мин) с конъюгированными с биотином кроличьими антителами против крысиных IgG и 30 мин с комплексом авидин/биотин-пероксидаза хрена (набор реактивов компании Vector Lab, РК-6104). Локализацию комплексов антител (ферментативную активность) выявляли с помощью субстрата 3,3-диаминобензидин (Sigma).
Подсчет капилляров
Для каждого среза т. tibialis anterior с окрашенными CD31+ клетками с
помощью цифровой фотокамеры получали серию снимков, охватывающих более 80% поверхности среза. Подсчет количества CD31+ клеток и миофибрилл
проводили с использованием компьютерной программы, любезно предоставленной М. Крымским (РКНПК МЗ РФ, Москва).
Статистическая обработка данных
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента и теста для межгрупповых сравнений при многократных измерениях - one way ANOVA с использованием программ Prism 4 и Instat Software.
Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток
СКЖТ человека, в среде культивирования Микроскопические сосуды представляют собой трубчатые структуры, стенки которых сформированы исключительно из эндотелиальных клеток. С увеличением диаметра сосудов в формирование их стенки вовлекаются другие типы клеток - перициты и гладкомышечные клетки, которые придают сосуду жесткость и упругость.
Рост и рсмоделирование (перестройка) сосудистой системы осуществляются за счет трех процессов : васкулогснеза, ангиогенеза и артериогенеза - в зависимости от типов клеток и тех процессов, в которые они вовлечены. Васкулогенезом принято называть процесс дифференциации эндотелиальной клетки из своего предшественника -ангиобласта, с последующим ее вовлечением в формирующуюся структуру сосудистой сети. Ангиогенез - это процесс отрастания нового сосуда от уже существующего, протекающий за счет деления зрелых эндотелиальных и гладкомышечных клеток с последующим их внедрением (миграцией) в области ишемии, воспаления и в очаги злокачественных новообразований. Наиболее сложным является процесс артериогенеза, представляющий собой структурную перестройку уже существующего сосуда, направленную, в основном, на изменение его массы и просвета. Этот процесс связан с изменением числа клеток и их пространственной организации в формирующейся сосудистой стенке.
И капиллярный кровоток, распределяющий кровь на самом низком уровне внутри ткани, и артериальный кровоток, осуществляющий основную поставку крови и ее распределение по органам и тканям в соответствии с физиологическими потребностями, необходимы для эффективного обеспечения тканей кровью, Нарушение баланса развития сосудистой сети способствует развитию многих патологических состояний. Чрезмерный ангиогенез характеризует такие заболевания, как злокачественные новообразования, псориаз, артрит, ретинопатия. Подавление ангиогенеза или невозможность нормального восстановления сосудистой системы после серьезных нарушений магистрального кровотока приводит к развитию тяжелых ишемических повреждений сердца (инфаркту) и головного мозга (инсульту), критической ишемии нижних конечностей, нейродегенеративным заболеваниям, остеопорозу.
Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток
На ранних стадиях развития эмбрион получает все необходимые компоненты для своего развития за счет процессов диффузии [33]. С ростом организма процесса диффузии становится уже недостаточно для нормального его развития, и адекватное обеспечение
тканей всем необходимым происходит через кровь, протекающую по развивающейся разветвленной сети сосудов. Термин «васкулогенез» принято относить к начальным этапам развития сосудов, в которых ангиобласты — предшественники эндотелиальных клеток - мигрируют в область развития сосудистой сети, дифференцируются во взрослые эндотелиальные клетки и вовлекаются в формирование растущего сосуда.
Многие годы считалось, что сосуды развиваются из предшественников эндотелиальных клеток (ПЭК) только в период эмбриогенеза, а во взрослом организме их формировании идет через процесс ангиогепеза исключительно за счет деления полностью дифференцированных эндотелиальных клеток. Исследования последних лет продемонстрировали ошибочность данного представления. Образование и рост сосудов -как в эмбриогенезе, так и в областях ишемии, злокачественных новообразований и зонах воспаления взрослого организма — происходит при участии недифференцированных предшественников эндотелиальных клеток, называемых некоторыми авторами также ангиобластами [34-36]. Данные типы клеток, циркулирующие в кровотоке и экспрессирующие антигены CD34/VEGFR-2/ACI33 на клеточной мембране, обладают высоким пролиферативным потенциалом [37]. Сигналы, ответственные за процесс привлечения ангиобластов в область развития сосудистой сети, остаются пока малоизученными; тем не менее, есть указания на то, что ряд ростовых факторов и их рецепторов, таких как VEGF, GM-SCF, вовлечены в этот процесс. Так, способность VEGF, GM-SCF рекрутировать клетки костного мозга в районы постнатальной реваскуляризации была продемонстрирована в нескольких работах [34,38, 39].
ПЭК были успешно выделены из крови и костного мозга и в экспериментах на животных было показано их стимулирующее влияние на развитие сосудов в ишемизиро ванных тканях [40-42]. Есть данные, свидетельствующие о том, что эндотелиальные клетки дифференцируются как из ангиобластов во время эмбриогенеза, так и из ПЭК, мультипотентных клеток-предшественников и «сайт-популяции» клеток костного мозга взрослого организма [41, 43]. VEGF, VEGFR-2 и bFGF участвуют в процессе дифференциации ангиобластов [44-47], в то время как VEGFR-1 (Flt-1) тормозит развитие гемангиобластов [48],
ПЭК и мультипотентпые клетки других типов принимают участие в процессе роста сосудов не только путем непосредственного формирования стенки сосуда, но также за счет экспрессии различных ангиогеиных и аптиапоптотических факторов [49]. Считается, что эндотелиальная и гематогюэтическая клетки происходят от одного предшественника -гемангиобласта [50]. Такое предположение сделано на основании того, что оба типа клеток имеют схожие антигены на своей клеточной поверхности и схожие физиологические ответы на различные воздействия. Гематопоэтические клетки и лейкоциты обладают способностью стимулировать ангиогенез за счет выделения цитокинов, а также, возможно, и за счет трансдифференциации в ЭК [51, 52], Раскрытие механизмов «привлечения» мультипотентных предшественников в область ишемии, а также механизмов их возможной дифференциации может способствовать совершенствованию стратегии нехирургической реваскуляризации - терапевтического ангиогенеза. На данный момент известно, что в эти процессы вовлечены такие факторы, как VEGF, PIGF, HGF, SDF-1 ангиопоэтин и ряд других [53-57].
Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза
Экспрессия VEGF, считающегося ключевым фактором в васкуло- и ангиогенезе, существенно зависит от кислородного напряжения. Как было показано в ряде экспериментов, кислород может свободно диффундировать в ткани не более чем на 100 мкм. При снижении процентного содержания кислорода в окружающей среде наблюдается значительное увеличение экспрессии мРНК VEGF как in vitro, так in vivo [58], но помимо этого усиливается экспрессия и ряда других факторов, участвующих в ангиогенезе. К ним относятся рецепторы VEGF-VEGFR-1 и VEGFR-2, нейропилин-1 и 2, ангиопоэтин-2, NO-сиитаза, TGFpl, PDGF-BB, эндотелин-1 and IL-8, эритропоэтин [59, 60], адреномедулин [61], инсулино-подобный ростовой фактор 2 [62], связывающие белки 1,2,3 инсулино-подобного фактора роста и ряда других [62, 63].
Молекулярный комплекс, управляющий этим процессом, состоит из транскрипционного комплекса индуцируемых гипоксией факторов (hypoxia inducible factors, HIF) — HIF-la, HIF-1 Ji (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator; ARNT) и HIF-2a. Такие факторы, как VEGF, эритропоэтин и VEGFR-1 содержат последовательность HRE (hypoxia responsive element) в 5 -области промотера гена - последовательность, ответственную за связывание с HIF комплексом [64]. Концентрация HIF-la субъединицы увеличивается при возникновении гипоксии, в то время, как уровень экспрессии HIF-lp постоянен. В нормальных условиях продукт гена VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor gene) связывается с HIF-la, что приводит к быстой деградации комплекса [65]. Гипоксия ведет к стабилизации HIF-la субъедипицы, что приводит к взаимодействию комплекса HIF-1/HIF-2 с HRE промотера регулируемого гена с последующей стимуляцией транскрипции мРНК [65],
Клетки организма как основа клеточной терапии
Стволовые клетки характеризуются способностью пролиферировать неограниченное количество раз без видимых признаков дифференциации, а при определенных физиологических воздействиях - дифференцироваться в широкий круг клеточных типов [2]. Такие клетки, в основном, представлены в тканях эмбриона, хотя клетки, подпадающие под эти критерии, встречаются и во взрослом организме. В то время, как стволовые клетки эмбрионального происхождения обладают способностью к делению неограниченное число раз, «стволовые» клетки взрослого организма способны к большому, но все же ограниченному количеству делений. Термин «предшественник» имеет несколько расплывчатое определение, и, в основном, характеризует способность клетки дифференцироваться в один определенный тип зрелых клеток, но находящейся на ранней стадии развития и не имеющей явных признаков/маркеров зрелой клетки.
Клеточная терапия проводится с использованием как аутологических (собственных), так аллогепиых (полученных от другого донора) клеток. Преимущества использования аутологических клеток - в отсутствии иммунного ответа, приводящего к отторжению клеток донора. Однако надо иметь в виду, что для получения адекватного количества клеток, необходимого для клинического использования, может возникнуть необходимость дополнительного наращивания их в культуре {ex vivo).
Представление о терапевтическом воздействии клеток
Конечной целью клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний является восстановление функциональной активности поврежденной ткани. Это может достигаться за счет нескольких пока отчасти гипотетических механизмов, лежащих в основе терапевтического воздействия клеток.
Локальное (в поврежденную ткань) или системное (в кровоток) введение стволовых клеток или клеток-предшественников приводит к их аккумуляции в зоне повреждения. В случае системного введения это может происходить за счет хемотаксиса в ответ на факторы, высвобождаемые поврежденной тканью. Далее за счет биохимических и механических воздействий окружающей ткани полипотентные клетки могут дифференцироваться в кардиомиоциты (окончательно не доказано), эндотелиальные и гладкомышечные клетки с последующей функциональной интеграцией в структуры ткани реципиента (включение в миокардиальныЙ синцитий, участие в формировании капилляров и стенок крупных сосудов). Как было показано в ряде экспериментов in vitro, стволовые клетки и клетки-предшественники способны к «слиянию» с кардиомиоцитами, что может приводить не только к восстановлению функциональной активности последних, но, возможно, и к ограниченной активации их деления. Исследуется также возможность предварительной дифференциации СК и КП in vitro в соответствующие типы клеток под воздействием специфических культуральных сред и механических воздействий с последующей их трансплантацией в орган-мишень.
Другой механизм воздействия СК и КП связан с их способностью секретировать широкий набор различных цитокинов и ростовых факторов [181]. Секретируемые факторы могут стимулировать врастание сосудов из неповрежденных областей в ишемизированную ткань и улучшать ее кровоснабжение. Помимо этого локальное накопление таких факторов способно уменьшить апоптоз зрелых дифференцированных клеток и стимулировать их деление.
Все чаще рассматривается возможность использования клеток как переносчиков терапевтических генов [181]. Введение аутологичных клеток, гиперэкспрессирующих терапевтические гены за счет предварительной траксфекции in vitro, может иметь ряд преимуществ по сравнению с непосредственным введением генетического материала в ткани-мишени: (1) трансфекция клеток in vitro дает возможность оценить уровень пиковой экспрессии терапевтических белков in vitro и позволяет регулировать «объем» вводимых клеток в зависимости от эффективности трансфекции; (2) при введении аутологичных клеток отсутствует иммунного ответа, наблюдаемый при введение вирусных частиц; (3) существуют предварительные данные, свидетельствующие о том, что клетки-предшественники способны аккумулироваться в областях ишемии или повреждения, локализуя таким образом свою секреторную активность [39, 182].
К настоящему моменту накопилось достаточно большое количество данных, свидетельствующих о наличии клеток-предшественников и мультипотентных клеток различных типов в тканях организма. Однако на сегодня нет четкой классификации для многих типов таких клеток, и, в основном, им присваивают названия, исходя из методов их выделения, очистки/обогащения, а также по наличию ограниченного числа маркеров, представленных на их поверхности, или же по типу культивирования.
Эмбриональные стволовые клетки
Ключевое преимущество использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) состоит в том, что в соответствии с полученными к настоящему времени данными, этот тип клеток способен к неограниченному числу делений в недифференцированном состоянии без потери потенциала дифференцироваться в широкий спектр клеточных типов [2]. Возможность использования ЭСК человека и животных для терапии сердечнососудистых заболеваний была оценена на различных экспериментальных моделях. ЭСК мыши продемонстрировали способность к дифференциации в ПЭК [3] и кардиомиоциты [1], и выживанию в сердце реципиента, длительное время сохраняя фенотип кардиомиоцитов [1]. Показана способность ЭСК человека in vitro дифференцироваться в кардиомиоциты (основываясь на экспрессии кардио-специфических генов и способности к спонтанной сократимости) [183].
Выделение стромальных клеток жировой ткани
Образцы «гомогенизированной» жировой ткани подвергали ферментативной обработке. Суспензию ткани смешивали с коллагсназоЙ I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) в растворе 50% DMEM (Sigma, D-5523)/50%F12 (Sigma, N-6760)/l% BSA (Sigma, A-8806)/100 ед/мл пеницилина и 100 ед/мл ампицилина в соотношении объем ткани к объему коллагеназы равному 1:1 и инкубировали при 37 С в течение одного часа с постоянным покачиванием/перемешиванием. По окончании инкубации образец последовательно фильтровали через Nitex мембраны с размером пор 500 мкм и 250 мкм. Профильтрованную суспензию центрифугировали 5 мин при 200g, после чего белесый поверхностный слой, состоящий из жировых клеток и кусочков «нераспавшейся» ткани, удаляли. Осадок, состоящий из отдельных нежировых клеток, дополнительно обрабатывали лизирующим буфером «красных клеток крови» (154 мМ NH4C1, 10 мМ КНСОз, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 5 мин при 37 С, после чего материал центрифугировали 5 мин при 300 g. Осадочную фракцию клеток ресуспендировали в ФСБ или в среде культивирования.
Выделение клеток из жирового отложения мыши Для выделения клеток были использованы мыши линий C57BL/6J (The Jackson lab, США, кат№ 000664) и СЗНеВ/FeJ (The Jackson lab, США, кат№ 000658) обоих полов и разного возраста. Выделение ткани проводилось в асептических условиях. Для выделения клеток у мыши забирали подкожное жировое отложение (ПЖО), располагающееся по бокам в нижней части туловища, а также висцеральное жировое отложение (ВЖО), расположенное непосредственно под широкой мышцей живота.
Полученный материал подвергали измельчению до консистенции суспензии кусочков жировой ткани объемом несколько кубических миллиметров. Суспензию ткани смешивали с раствором ферментов: коллагеназы I типа (100 ед/мл Worthington Biochemical, США) в 50% DMEM (Sigma, D-5523)/50%F12 (Sigma, N-6760)/!% BSA (Sigma, A-8806)/100 ед/мл пеницилина и 100 ед/мл ампицилина и диспазы (25 ед/мл, Becton Dickinson, США; кат№ 354235). Соотношение веса ткани (в граммах) к объему ферментативного раствора (в мл) равнялось 1:2. Образец инкубировали при 37 С в течение 45-90 мин (в зависимости от типа ЖО) с постоянным покачиванием/перемешиванием. По окончании инкубации образец центрифугировали 5 мин при 400 g. Белесый поверхностный слой, представленный жировыми клетками и кусочками нераспавшейся ткани, удаляли. Осадок, состоящий из отдельных нежировых клеток, обрабатывали лизирующим буфером «красных клеток крови» (см. выше) 5 мин при 37 С, после чего образец центрифугировали 5 мин при 300 g. Осадок растворяли в ФСБ и фильтровали через мембрану с размером пор 40 мкм (BD Falcon, Cell Strainer, #352340). Профильтрованную суспензию центрифугировали 5 мин. при 300 g. После удаления супернатанта, клетки ресуспендировали в ФСБ или в среде культивирования.
Культивирование СКЖТ
Выделенные клетки культивировали в соответствующих средах в пластиковых флаконах в инкубаторе при 37 С и при 5%-ой концентрации СОг- При достижении конфлюента клетки пассировали. Монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02%ЭДТА/ФСБ. Для длительного хранения клетки замораживали в среде культивирования с добавлением 15-20% ЭСБ и 10% ДМСО. Для культивирования СКЖТ человека использовали следующие среды:
1. Endothelial Growth Medium-2mv (EGM-2mv, Cambrex, США; кат№ CC-4147). В состав среды входит: эндотслиальная базальная среда (ЕВМ-2, Cambrex, США; кат№ СС-3156); 5% ЭСБ, антибиотик GA-1000 (гентамицин сульфат амфотерицин-В); ростовые факторы - VEGF, bFGF, EGF, IGF-1, гидрокортизон, аскорбиновая кислота.
2. DMEM/10%3CB /100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. Для культивирования СКЖТ мыши использовались следующие среды: 1. MyeloCult (Stemcell, #М5300).
В состав среды входит: MEM, 12,5% лошадиной сыворотки, 12,5% ЭСБ, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 0,16 мМ инозитола, 0,16 мкМ фолиевой кислоты. 2. DMEM/10% ЭСБ/100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина.
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток проводили на свежевыделенпьгх, предкультивированных в течение 24 часов и конфлюентных /пассированных клетках. Для открепления клеток от поверхности культурального пластика клетки обрабатывали раствором 2 мМ ЭДТА/ФСБ в течение 5 мин при 37 С. Концентрацию/количество клеток в образцах определяли под микроскопом в гемоцитометрической камере. Клетки, окрашивающиеся красителем «Трипан голубой» (мертвые клетки), добавленным в образец перед подсчетом клеток, исключали из расчета концентрации клеток.
Связывание антител с поверхностными антигенами СКЖТ человека 100 мкл суспензии СКЖТ в концентрации 1-10x106 клеток/мл ФСБ/1 %ЭСБ были внесены в пробирки. Предварительно в каждую из пробирок вносили соответствующие флуоресцентно меченые моноклональные мышиные антитела против человеческих антигенов в конечной концентрации 10 мкг/мл. Образцы инкубировали 20-30 мин во льду. Клетки отмывали от излишка антител добавлением в пробирки 2 мл ФСБ/1 %ЭСБ и центрифугированием 5 мин при 300 g при 4С. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и фиксировали добавлением в пробирки 200 мкл 2% формальдегида (Tousimis).
Связывание антител с поверхностными антигенами СКЖТ мыши
Суспензия СКЖТ в концентрации 1-10x106 клеток/мл ФСБ/1%ЭСБ была прединкубирована с CD16/32 (Fcylll/II рецептор) в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 20 мин во льду. Данная процедура снижала уровень неспецифического связывания флуоресцентно меченых антител с клетками, В дальнейшем клетки были разнесены по 100 мкл в пробирки. В каждую из пробирок были внесены соответствующие флуоресцентно меченые моноклональные крысиные антитела против мышиных антигенов в конечной концентрации 10 мкг/мл. Образцы инкубировали 20-30 мин во льду. Клетки отмывали от излишка антител добавлением в пробирки 2 мл ФСБ/1%ЭСБ и центрифугированием 5 мин при 300 g при 4С. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и фиксировали добавлением в пробирки 200 мкл 2% формальдегида (Tousimis).
Анализ
Процент клеток, экспрессирующих соответствующие антигены на клеточных мембранах, оценивали на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton-Dickinson).
Культивирование СКЖТ человека в условиях гипоксии
В данном исследовании использовали чСКЖТ второго пассажа, предварительно культивированные в среде EGM-2mv. За 15-18 часов до начала эксперимента клетки сажали в ЕВМ-2/5%ЭСБ среду с плотностью 5x10 /см , Перед началом эксперимента среду культивирования заменяли на свежую ЕВМ-2/5%ФСБ, и клетки помещали либо в стандартные условия культивирования (21% Оз), либо в условия гипоксии (1% Ог).
Анализ накопления факторов, секретируемых
СКЖТ человека культивировали в одной из трех сред: DMEM/10%3CB, ЕВМ/5% ЭСБ или EGM-2mv. Для индукции адипоцнтарной дифференциации чСКЖТ, достигшие 100% конфлюента, инкубировали в среде «адипоцитарной дифференциации» (Cambrex, США, кат. № РТ-3102В), содержащей инсулин, L-глутамин, MCGS, дсксаметазон, эндометоцин, З-изобутил-1-метил-ксантин, пенициллин, стрептомицин. Клетки культивировали три дня, после чего среда заменялась на «адипоцитарную поддерживающую» среду (Cambrex, США, кат. № РТ-3102А), содержащую инсулин, L-глутамин, MCGS, пенициллин, стрептомицин. Клетки культивировали в новой среде в течение трех дней, после чего эксперимент останавливали.
Появление в культуре СКЖТ адипоцитов оценивали с помощью визуального анализа морфологии клеток под микроскопом, так и с помощью окрашивания монослоя клеток «маслено-красный О». Для этого клетки отмывали от среды культивирования ФСБ и фиксировали в 10% растворе формалина/ФСБ в течение 30 мин. Промыв клетки в dFkO, монослой инкубировали 5 мин с 60% раствором изопропанола. После удаления изопропанола клетки окрашивали 5 мин в рабочем растворе «маслено-красного О» (для окрашивания липидных капель в вакуолях). Излишки реагента отмывали в 60% изопропаноле, после чего ядра клеток докрашивали гематоксилином в течение 1 мин, а затем лунки с клетками промывали в проточной воде.
Молекулярные и биохимические эксперименты Анализ накопления факторов, секретируемых СКЖТ человека, в среде культивирования
Анализ продукции/накопления в среде культивирования СКЖТ таких факторов как VEGF, HGF, урокиназа проводили с помощью ИФА. В частности, для оценки количества VEGF и HGF посредством ИФА в модификации «сэндвич» были использованы следующие наборы реагентов компании R&D Systems (США):
VEGF: 1) Рекомбинантный VEGF человека (кат. № 293-VE); 2) антитела козы против VEGF человека (кат. № AF-293-NA); 3) биотинилированные антитела козы против VEGF человека (кат. № BAF293).
HGF: 1) рекомбинантный HGF человека (кат. № 294-HG); 2) моноклональные антитела мыши против HGF человека (кат. № МАВ694); 3) биотинилированные антитела козы против HGF человека (кат. № BAF294);
Для проведения ИФА содержания этих факторов в образцах использовались также следующие реактивы: стрсптовидин-пероксидаза хрена (кат. № DY998) и набор субстратов (кат. № DY999). ИФА в модификации «сэндвич» проводили следующим образом: 96-луночные иммуноферментные планшеты инкубировали 100 мкл раствора первых антител в течение ночи при комнатной температуре (0,4 мкг/мл для VEGF и 0,2 мкг/мл для HGF). Неспецифическое связывание белков с антителами и пластиком планшет блокировали раствором ]%БСА/5%сахароза/ФСБ в течение одного часа, после чего следовала инкубация с образцами сред культивирования СКЖТ, собранными через 72 часа от начала культивирования, или со стандартами белков исследуемых факторов (2 часа). В качестве вторых антител использовали биотинилированные поликлональные антитела козы в концентрации 0,2 мкг/мл, наносимые на два часа. В качестве фермента, связывающегося с биотинилированными антителами, использовали стрептовидин-пероксидазу хрена в разведении 1:200, наносимую на 20 минут. После каждого из вышеописанных этапов лунки четырехкратно промывали раствором 0,05% Tween-20/ФСБ. Для развития ферментативной реакции в лунки вносили субстрат на 20 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 1 N раствора серной кислоты. Уровень поглощения раствора в лунках определяли при длине волны 450 нм.
Концентрацию урокиназы в образцах оценивали с помощью набора реактивов IMUBIND uPA ELISA Kit производства компании American Diagnostica Inc. (кат. № 894), в полном соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору.
Определение активности бета-галактозидазы Количество бета-галактозидазы в клетках определяли по уровню ее активности в клеточных лизатах. Анализ активности фермента определяли с использованием набора реактивов «Galacto-Star Systems» компании Apply Biosysterns (кат. № BM100S). Чашки Петри с клетками отмывали ФСБ от среды культивирования, после чего клетки обрабатывали лизирующим буфером: 100 мМ К3РО4 (рН 7.8), 0.2% Triton Х-100. Клеточные лизаты переносили в пробирки и центрифугировали 2 мин при 15000g, после чего из образцов отбирали супернатанты. Измерение активности бета-галактозидазы проводили в 96-луночных планшетах. В каждую из лунок вносили 100 мкл готовой реакционной смеси, состояшей из Galacton-Star субстрата и буфера в соотношении 1:50; после чего в лунки добавляли по 2 мкл клеточных образцов (супернатантов). По окончании 90 мин инкубации при комнатной температуре уровень активности фермента определяли по уровню люминесценции лунок, измеренному на приборе Fusion (Perkin Elmer). Измерение люминесценции лунок, содержащих стандартный препарат бета галактозидазы (Sigma, кат№ G-5635), паралелльно с лунками, содержащими экспериментальные образцы, позволяло определить абсолютные значения накопления белка бета-галактозидазы в экспериментальных образцах. Уровень экспрессии бета-галактозидазы (количество белка) стандартизовали относительно общего количества белка в образцах.
