Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор
1.1. Характеристика антиоксидантных свойств фенольных соединений
1.2. Сравнительная характеристика методов измерения антиоксидантной активности
1.3. Практическое использование методов измерения антиоксидантной активности в исследованиях напитков и пищевых продуктов
2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований
2.2. Методы исследований
3. Определение антиоксидантной активности алкогольных напитков
3.1. Сравнительное исследование антиоксидантной активности красных сухих, полусладких и белых сухих вин
3.2. Исследование антиоксидантной активности коньяков
4. Определение антиоксидантной активности чаев и растворимого кофе
4.1. Сравнительный анализ антиоксидантной активности листовых и пакетированных чаев
4.1.1. Сравнительный анализ антиоксидантной активности зеленых листовых и пакетированных чаев
4.1.2. Сравнительный анализ антиоксидантной активности черных листовых и пакетированных чаев
4.2. Определение антиоксидантной активности растворимого кофе
5. Исследование антиоксидантной активности безалкогольных напитков
5.1. Изучение антиоксидантной активности безалкогольных напитков на основе чая и кофе
5.2. Определение антиоксидантной активности безалкогольных энергетических напитков
Выводы и результаты исследований
Список литературы
Приложения
- Сравнительная характеристика методов измерения антиоксидантной активности
- Исследование антиоксидантной активности коньяков
- Определение антиоксидантной активности растворимого кофе
- Определение антиоксидантной активности безалкогольных энергетических напитков
Введение к работе
В настоящее время качество напитков на соответствие стандартам определяется на основе нескольких нормативных физико-химических показателей. Как показывает практика, этих показателей явно недостаточно, то есть перечень показателей, устанавливаемых ГОСТом, слишком узок, для получения объективного заключения о подлинности напитков, учитывая появление новых технологий производства и новых способов фальсификации продукции. [1-4]. Отмечено также, что безопасность и соответствие нормативным физико-химическим показателям, регламентируемым ГОСТами, не гарантирует потребителю желаемое качество напитков [1].
В этой связи, согласно позиции ведущих экспертов и специалистов в области производства и анализа качества алкогольных и безалкогольных напитков, на данный момент времени существует острая необходимость расширения перечня нормируемых физико-химических показателей технологического процесса и качества готовой продукции, введения дополнительных требований к качеству выпускаемой продукции, а также новых аналитических методов контроля ее качества с целью облегчения, в определенной степени, процесса идентификации алкогольной и безалкогольной продукции [1-11].
Следует отметить, что соответствующими отраслевыми институтами проводится работа по расширению перечня нормативных физико-химических показателей, в том числе и гармонизированных с требованиями ЕС. К примеру, в последние стандарты (ГОСТ Р 52523-2006 «Вина столовые и виноматериалы столовые. ОТУ», ГОСТ Р 52404-2005 «Вина специальные и виноматериалы специальные. ОТУ», ГОСТ Р 52195-2003 «Вина ароматизированные. ОТУ») включены новые нормы по массовой концентрации приведенного экстракта, а в два из них - по массовой концентрации лимонной кислоты. [8, 9]. Та кже разработаны и введены в действие стандарты ГОСТ Р 52391-2005 «Винодельческая продукция. Метод определения массовой концентрации лимонной кислоты», ГОСТ Р 52470-2005 «Продукты пищевые. Методы идентификации и определения массовой доли синтетических красителей в алкогольной продукции», ГОСТ Р 52841-2007 «Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза», ГОСТ Р 52828-2007 «Вина и виноматериалы. Определение содержания охратоксина А. Метод тонкослойной хроматографии».
В отношении показателей качества безалкогольных напитков наблюдается аналогичный вектор деятельности. Так, утверждены и введены в действие стандарты: ГОСТ Р 52844-2007 «Напитки тонизирующие безалкогольные. Общие технические условия», в котором нормируются содержание кофеина, таурина, L-карнитина, глюкуронолактона, витаминов (ВЗ, В5, В6, В12, инозит); ГОСТ Р 52689-2006 «Продукты пищевые. Инверсионно-вольтамперометрический метод определения массовой концентрации йода»; ГОСТ Р 52690-2006 «Продукты пищевые. Вольтамперометрический метод определения массовой концентрации витамина С»; гармонизирован с международным стандартом ISO 10095:1992 «Coffee - Determination of caffeine content - Method using high-performance liquid chromatography (MOD)» стандарт ГОСТ P 52613-2006 (ИСО 10095:1992) «Кофе. Определение массовой доли кофеина. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии».
Одним из дополнительных критериев качества алкогольных и безалкогольных напитков, расширяющих компактную группу установленных ГОСТами нормированных показателей, является антиоксидантная активность. Важно отметить, что помимо информации о качестве продукции, показатель антиоксидантной активности отражает и физиологическую ценность продукта для организма человека. В последние годы с точки зрения потребительских свойств различные группы напитков рассматриваются все в большей степени как продукты, обладающие определенной физиологической ценностью и используемые для обогащения организма широким спектром биологически активных веществ. При этом особый интерес вызывают соединения фенольного комплекса (катехины, танины, аитоцианы, флавоны, флавонолы и др.), так как они, с одной стороны, являются факторами, снижающими риск развития хронических неинфекционных заболеваний, а с другой - связывают свободные радикалы, то есть проявляют ярко выраженные антиоксидантные свойства [12]. В настоящее время для различных групп фенольных соединений доказана необходимость их присутствия в рационе питания в связи с участием в целом ряде метаболических процессов, а также установлены адекватные и верхние допустимые уровни их суточного поступления [13].
Отмечено, что в странах ведущих производителей вина широко дискутируется вопрос о нормировании показателя антиоксидантной активности с целью его использования как показателя качества винодельческой продукции [14].
Действующая в настоящее время нормативная документация не предусматривает оценку показателя антиоксидантной активности алкогольных и безалкогольных напитков, чаев, кофе как одну из характеристик их физиологической ценности, а также как показателя качества данных видов продукции. Однако терминология так или иначе связанная с «антиоксидантной активностью», «природными антиоксидантами» достаточно широко и интенсивно используется в рекламных целях, а также в оформлении упаковки некоторых видов пищевой продукции (чай, кофе, безалкогольные напитки), при этом ничем не подкрепляемая. Очевидно, что данный аспект может являться почвой для введения покупателя в заблуждение недобросовестными производителями напитков.
В литературе достаточно широко представлены результаты исследований антиоксидантной активности различных групп пищевых продуктов, в том числе и напитков, однако имеющиеся данные трудно сопоставимы, так как измерения осуществлялись при помощи различных методик, являющихся достаточно трудоемкими, длительными, требующими применения специальных реактивов и не лишенные некоторых недостатков.
В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на определение антиоксидантной активности различных групп напитков при помощи новых, экспрессных, чувствительных и в то же время простых методов измерения данного показателя. Одним из таких перспективных методов является амперометрический способ измерения антиоксидантной активности.
Сравнительная характеристика методов измерения антиоксидантной активности
К настоящему времени в мировой аналитической практике разработано значительное количество различных методов определения антиоксидантной способности/активности/эффективности/емкости разных объектов, созданы модельные системы, предложены новые реагенты [42-45,54,56-110].
Среди наиболее известных и широко используемых выделяются следующие методы:
Помимо указанных, также существует ряд менее распространенных и более специфичных методов измерения антиоксидантной активности. Следует отметить, что в исследованиях антиоксидантной активности различными авторами используются как готовые методы, так разрабатываются новые и модифицируются уже существующие.
Следует отметить, что методы определения антиоксидантной активности различаются между собой по типу источника окисления, окисляемого соединения и способа измерения окисленного соединения [54,55]. При этом выделяются три типа методов, в зависимости от типа регистрируемого процесса: основанные на потреблении кислорода, образовании продуктов окисления, поглощении (связывании) свободных радикалов [55]. Большая часть методов основана на принципах прямого или косвенного измерения скорости или полноты реакции взаимодействия антиоксидантов с соответствующими реагентами в модельных средах [54].
Однако наиболее удобной является их классификация по способу измерения проявляемой исследуемыми объектами антиоксидантной активности (рисунок 2), причем внутри каждой из групп между методами существуют значительные различия в составе используемых модельных систем, инициаторов окисления и др.
В качестве субстратов окисления в модельных системах используются люминол, 2,2-азинобис-З-этилбензотиазолин-б-сульфоновая кислота (ABTS), а-кето-у-метиолбутировая кислота (КМВА), флуоресцеин, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) и др.; инициаторами окисления, как правило, выступают пероксидазные реагенты (смесь Н202 с пероксидазой хрена, метмиоглобин), 2,2 -азобис-2-амидопропан (АВАР) и 2,2 -азобис-2-амидин-пропангидрохлорид (ААРН), ионы металлов переменной валентности и др.
[42-45,54,56-110]. Характеристика особенностей методов измерения антиоксидантнои активности представлена в таблице 3.
Одним из наиболее используемых в настоящее время методов определения антиоксидантнои активности является метод определения адсорбционной емкости по отношению к кислородным радикалам - ORAC [56-64].
Суть метода заключается в измерении интенсивности флуоресценции (длина волны возбуждения 493 нм, испускания - 515 нм) реакционной смеси (включающей исследуемый образец, источник радикалов, фосфатный буфер, флуоресцирующее вещество) и ее изменении в зависимости от времени протекания реакции. Соединения, обладающие антиоксидантнои активностью, связывают свободные радикалы, в результате чего увеличивается время флуоресценции. В качестве мишени, повреждаемой свободными радикалами, используется интенсивно флуоресцирующий белок {3-фикоэритрин, источника пероксильных радикалов - ААРН (2,2 -азобис-2-амидин-пропангидрохлорид), стандарта - тролокс [56-64]. Количественное определение антиоксидантной активности осуществляется по площади, ограниченной двумя кривыми, полученными при протекании свободной реакции (контроль) и реакции с добавлением антиоксидантов) и выражается в дмоль стандарта тролокса на мл (л) или мг (г), при этом величина площади пропорционально возрастает у ростом концентрации антиоксиданта в смеси. Длительность регистрации кинетики реакции составляет, как правило 30 мин, перед проведением измерений необходимо проводить инкубацию фотосенсибилизатиора при температуре 35С в течение 15 мин.
Однако фикоэритрин может обесцвечиваться под действием света, а также взаимодействует с фенольными соединениями, . обширно представленными в продуктах растительного происхождения, поэтому результаты определения антиоксидантной активности являются заниженными [59].
С учетом данных недостатков было использовано новое, более стабильное флуоресцирующее соединение - флуоресцеин (ORAC-FL) [59]. Несмотря на то, что метод является простым, чувствительным и автоматизированным, практически не требующим пробоподготовки, анализ образца занимает длительное время (время анализа 95 мин), требуется наличие флуоресцентного детектора, используется реакционная смесь, при подготовке которой необходимо соблюдать рН и температурные условия инкубации отдельных компонентов смеси.
Исследование антиоксидантной активности коньяков
Анализ литературных источников показал, что исследованию антиоксидантной активности коньяков посвящено незначительное количество работ [45,71,73,150]. В указанных работах использованы различные методы определения антиоксидантной активности коньяков - DPPH [73], TAS [71], FRAP, TRAP и ТЕАС [45,150], в связи с чем сравнительный анализ полученных результатов является достаточно затруднительным. Следует отметить, что в нашей стране анализу антиоксидантной активности российских коньяков не было уделено достаточного внимания, в связи с чем оценка данного показателя в коньяках является актуальной. Результаты исследований антиоксидантной активности образцов коньяков представлены в таблице 18 и на рисунке 16. Согласно полученным данным, наибольшее значение антиоксидантной активности по используемым стандартам наблюдалось у образца коньяка «Москва» (ОС) возрастом 20 лет (0,374 мг/см3 по стандарту кверцетина и 0,129 мг/см3 по стандарту галловой кислоты), наименьшая - у образца «Старый Кенигсберг» (4 звездочки) возрастом 4 года (0,0162 мг/см по стандарту кверцетина и 0,0056 мг/см3 по стандарту галловой кислоты). Необходимо подчеркнуть, что исследуемые образцы коньяков по величине антиоксидантной активности существенно уступали красным сухим, полусладким и белым сухим винам, соответственно физиологическая ценность исследованных коньяков существенно ниже по сравнению с винами.
Однако результаты зарубежных исследований несколько противоречивы - антиоксидантная активность коньяков была существенно выше показателя белых сухих вин (в среднем в 2,5 раза), но ниже, чем в красных винах (в среднем в 4 раза) [71]; антиоксидантная активность коньяков превышала показатель красных сухих вин [73]. Статистическая обработка результатов измерений антиоксидантной активности образцов коньяков показала что различие между максимальным и минимальным, значением антиоксидантной- активности исследованных образцов составило423,1 раза (по стандарту кверцетина), при существенном рассеянии значений антиоксидантной активности относительно среднего значения - 86,00% (таблица 19).
По сравнению с винами, антиоксидантная» активность коньяков составила 6 7% от уровня показателя красных сухих вин, 16,7% - от уровня показателя красных полусладких вин и 43,3% - от уровня белых сухих вин. Несомненный интерес представляет выявление зависимости между антиоксидантной активностью коньяков и их возрастом. С этой целью данные измерений антиоксидантной активности по различным стандартам были подвергнуты регрессионному анализу, в результате чего получены зависимости между указанными показателями в линейной форме У = а х + Ь (рисунок 17), которые представлены в приложении 2 (п.4). Несмотря на то, что в один вариационный ряд объединены коньяки разных производителей, результаты расчетов показали, что с увеличением возраста коньяка наблюдался рост показателя антиоксидантной активности, причем данные показатели достаточно тесно взаимосвязаны (коэффициенты корреляции составляют в зависимости от стандарта R=0,83-0,85, коэффициенты детерминации R =0,71-0,72). Следует отметить, что при исследовании зарубежных образцов коньяков различного производства с высоким значением коэффициента корреляции также был выявлен рост показателя TAS коньяков с увеличением их возраста в последовательности VS, VSOP, ХО, однако количество исследованных образцов было гораздо меньшим [71].
Исследованиями различных авторов было установлено, что качество коньяка улучшается с увеличением его срока выдержки в контакте с древесиной дуба [151-154]. С целью выявления антиоксидантной активности компонентов, экстрагируемых из древесины дуба, был проведен анализ модельных растворов, выдержанных в контакте термообработанной древесиной, превращенной в опилки. При этом в опыте была использована дубовая щепа, прошедшая термическую обработку по 2 вариантам: вариант 1 - средний обжиг (220С, т=20 мин), вариант 2 - сильный обжиг (230С, т=40 мин). Экстракцию осуществляли настоем опилок из расчета 10 г/дм , модельным раствором этанола с объемной концентрацией 55%. Модельные растворы выдерживали в статических условиях при температуре 25С в течение 6 месяцев, полученные значения антиоксидантной активности пересчитывали на 1 г древесины.
Определение антиоксидантной активности растворимого кофе
Работы, посвященные исследованию антиоксидантной активности кофе, проведены в основном за рубежом, однако их число не так велико. Кроме того, в качестве объектов исследований в работах выступали как правило сырье (зеленый, обжаренный кофе) или местные торговые марки. Следует отметить, что кофе, как и чай, обладает антибактериальной активностью, которая варьируется в зависимости от степени обжарки зерен [167,168].
В ряде работ проводили изучение антиоксидантной активности кофе в зависимости от степени обжига зерен (слабой, средней, сильной) [70,79,169], видовой принадлежности (C.Arabica, C.Robusta), места произрастания (Бразилия, Колумбия, Эквадор, Коста-Рика, Кот-д Ивуар) [79, 169].
В отличие от значительного числа работ, посвященных исследованию антиоксидантной активности чаев (как зеленых, так и черных), данное направление в отношении кофе в России остается малоизученным, учитывая, что кофе представляет собой полностью импортный продукт (основные страны-импортеры - Вьетнам и Бразилия).
Маркетинговый анализ российского рынка кофе, проведенный компанией Euromonitor International, показал, что в 2007 г. доминирующая доля рынка (69% в натуральном выражении) приходилась на растворимый кофе [170,171]. При этом более половины продаж на российском рынке кофе приходились на торговые марки компаний «Nestle S.A.» (Швейцария) и «Kraft Foods Inc.» (США) - «Nescafe», «Jacobs», «Carte Noire» и «Maxwell House». В этой связи представляло интерес провести оценку потребительских свойств наиболее популярных торговых марок растворимого кофе, потребляемых в нашей стране, исследовав их антиоксидантную активность.
Результаты определения антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений в.растворимом кофе представлены в таблице 34 и на рисунке 37.
Проведенные исследования показали, что максимальное значение антиоксидантной активности было выявлено у образца кофе «Tchibo Gold» — соответственно 50,47 мг/г (по стандарту галловой кислоты) и 127,45 мг/г (по стандарту кверцетина). При этом концентрация фенольных соединений в данном образце составила 97,84 мг/г (рисунок 39). Однако, максимальное содержание фенольных соединений, равное 101,72 мг/г, было у образца кофе «Cafe» при значениях антиоксидантной активности 47,89 мг/г (по галловой кислоте) и 121,14 мг/г (по кверцетину). Минимальным значением антиоксидантной активности - 24,28 мг/г (по галловой кислоте) и 61,34 мг/г (по кверцетину), равно как и минимальной концентрацией фенольных соединений, составляющей 89,12 мг/г, обладал образец кофе «Жокей Фаворит».
Проведенная обработка результатов исследований антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений в растворимом кофе, представленных в таблице 34, позволила получить следующие статистические характеристики (таблица 35).
Из представленных данных следует, что максимальный показатель антиоксидантной активности превосходил минимальный в 2,08 раза (по стандарту кверцетина), по концентрации фенольных соединений - в 1,14 раза. Для растворимого кофе вариация концентрации фенольных соединений незначительна и составила 3,83% (при среднем значении 95,708±3,663 мг/г, медиане - 95,99 мг/г), в отличие по более значительного разброса значений показателя антиоксидантной активности - 22,95% (при среднем значении 99,01±22,722 мг/г, медиане- 103,29 мг/г).
По сравнению с зелеными листовыми (вариант 2) и черными листовыми (вариант 1) чаями концентрация фенольных соединений в кофе выше соответственно на 37,89% и 59,30%. При этом антиоксидантная активность кофе составляет 82,40% от уровня показателя зеленых листовых чаев, и на 84,38% превосходит уровень черных листовых чаев.
Однако следует принять во внимание важный фактор - конечная антиоксидантная активность горячего напитка (кофе, чая} будет существенно зависеть от соотношения чай/кофе : вода.
Отмечено, что структура фенольных соединений, содержащихся в кофе и чае различна - в кофе превалируют мономерные фенольные соединения (производные кофейной кислоты, хлорогеновая кислота), в то время как в чае содержится значительное количество катехинов [135]. При этом кофе является богатым источником фенолокислот - сравнительное исследование показало, что в кофе их суммарная концентрация достигает 97 мг/100 г, в то время как в зеленом чае всего 36 мг/100 г, а в черном - 30 мг/100 г. Причем в кофе превалирует кофейная кислота (87 мг/100 г), в то время как в чае -галловая (в зеленом - 34 мг/100 г, в черном - 26 мг/100 г) [172].
Рядом исследований также установлено, что в процессе термической обработки концентрация фенольных соединений в кофе снижается. Однако, значительный вклад в величину антиоксидантной активности могут вносить гетероциклические соединения (меланоидины), интенсивно образующиеся при термической обработке (обжарке) зеленых кофейных зерен в результате протекания карбонил-аминных реакций [168,173,174].
Для растворимого кофе были получены математические модели, отражающие зависимости между показателями антиоксидантной активности и концентрацией фенольных соединений (рисунок 38), которые представлены в приложении 3 (п.4).
Определение антиоксидантной активности безалкогольных энергетических напитков
Энергетические напитки (т.н. «energy drinks», энергетики) относятся к группе тонизирующих, но, в отличие от напитков на основе экстрактов чая, оказывают на человеческий организм поддерживающее действие (повышают тонус, оказывают бодрящее действие, снимают усталость) за счет присутствия в их составе различных компонентов (в основном витаминов и кофеина в количестве 15-20% от суточной нормы).
В последнее время на российском потребительском рынке появилось значительное количество торговых марок энергетических напитков. Однако направление исследований, посвященных анализу их антиоксидантной активности, в нашей стране остается неизученным.
Несмотря на то, что между энергетическими напитками есть различия по цвету и вкусу, все они, в отличие от весьма сложных по химическому составу вин, коньяков, чаев и кофе, содержат сходный ограниченный набор компонентов, главными из которых являются тонизирующие ингредиенты — кофеин синтетического происхождения, а также таурин, глюкуронолактон, мелатонин, L-карнитин.
Было проведено исследование антиоксидантной активности наиболее популярных торговых марок безалкогольных энергетических напитков, производимых на территории России. Согласно данным маркетинговых исследований, лидерами среди энергетических напитков являются торговые марки «Adrenaline Rush», «Red Bull», «Burn» [183].
В результате исследований установлено, что энергетические напитки проявляли очень низкие значения антиоксидантной активности, в отличие от вин, коньяков, чаев (таблица 45).
Максимальное значение антиоксидантной активности среди исследованных образцов было выявлено у напитка торговой марки «Red Bull» (Red Bull GmbH, Австрия) - 0,0182 мг/см3 (по стандарту галловой кислоты) и 0,064 мг/см (по стандарту кверцетина), минимальным показателем обладал образец «Adrenaline Rush body power» (OOO «МЕГАПАК», Россия) - соответственно 0,0091 мг/см3 и 0,029 мг/см3.
Важно отметить, что по уровню антиоксидантной активности энергетические напитки соответствовали и даже превосходили некоторые образцы безалкогольных напитков на основе черного чая - составляющие вторую условную группу «Nestea» со вкусом лимона, со вкусом персика и со вкусом лесных ягод, «Hoop» лимон, персик, «О!» лимон, персик и лесные ягоды (рисунок 47). Значения антиоксидантной активности данной условной группы варьируются в пределах 9,9-10" -0,069 мг/см (по стандарту галловой кислоты) и 0,00216-0,0382 мг/см (по стандарту кверцетина). То есть наблюдается достаточно интересная картина - напитки, созданные на основе экстрактов чая, главным компонентом которых является фенольный комплекс сложного состава, по уровню антиоксидантной активности уступали напиткам, в рецептуре которых натуральные экстракты и концентраты практически отсутствуют и используются лишь ограниченный набор компонентов и пищевых добавок, в том числе искусственного происхождения.
В отсутствии фенольных соединений проявление антиоксидантной активности, хотя и очень низкой, у энергетических напитков обусловлено входящими в их состав в незначительных количествах кофеином, таурином, L-карнитином, мелатонином и аскорбиновой кислотой.
Аскорбиновая кислота является широко известным антиоксидантом. В отношении других компонентов, присутствующих в энергетических напитках, исследования различных авторов показали, что кофеин [184,185], таурин [186,187], мелатонин [188] и L-карнитин [189] также обладают антиоксидантной активностью.
Следует отметить, что требования к маркировке энергетических напитков, по сравнению с безалкогольными на основе чая, являются более жесткими: согласно ГОСТ Р 52844-2007 «в маркировке не допускается использование ссылок на любые действия, оказываемые напитком на организм человека, или свойственные отдельным компонентам напитка, при отсутствии соответствующих заключений, выданных уполномоченными органами в соответствующем порядке» [190].
Учитывая, что Роспотребнадзором в 2009 г. будут предложены соответствующие дополнения к законодательству Российской Федерации с целью ограничения оборота слабоалкогольных, энергетических напитков, а также поставлена ключевая задача — стимулировать здоровое поведение населения и создать условия для здорового образа жизни,[191], полученные сравнительные данные об антиоксидантной активности ассортиментных групп напитков на основе чая и- энергетических напитков могут быть активно использованы при разработке нормативных актов, расширяющих доступность для населения форм и условий ведения здорового образа жизни, а также будут способствовать повышению информированности потребителей о потребительских свойствах данных напитков.
Результаты статистического анализа данных по антиоксидантной активности группы энергетических напитков представлены в таблице 46.
