Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Система глутатиона как естественная цитопротекторная система 15
1.2. Вопросы частной токсикологии исследуемых ксенобиотиков 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 74
2.1. Выбор и содержание животных 75
2.2. Методика проведения и структура экспериментального токсикологического исследования 76
2.3. Методика проведения клинических исследований 80
2.4. Характеристика использованных фармакологических препаратов 82
2.5. Получение образцов тканей для исследований 86
2.6. Определение показателей системы глутатиона в тканях лабораторных животных и вэритроцитах человека 88
2.7. Лабораторные методы оценки функционального состояния внутренних органов и метаболической активности тканей лабораторных животных 98
2.8.Статистическая обработка результатов 99
Глава 3. Состояние системы глутатиона в тканях экспериментальных животных при острых интоксикациях ксенобиотиками с выраженными цитотоксическими свойствами 100
3.1. Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях циклофосфа-ном 101
3.2. Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях 1,2-дихлор-этаном 112
3.3. Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях р-хлорвинил-дихлорарсином 119
3.4. Состояние системы глутатиона в тканях лабораторных животных при острых и повторных интоксикациях доксорубицином 126
3.5. Система глутатиона в тканях животных при острых интоксикациях паракватом 140
3.6. Состояние системы глутатиона в тканях лабораторных животных при острых отравлениях фенилгидрачином 146
Глава 4. Состояние системы глутатиона в тканях экспериментальных животных при острых интоксикациях регуляторными ядами 153
4.1. Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях веществами седативно-гипнотического действия ! 54
4.2. Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях веществами с возбуждающим действием на ЦНС 168
Глава 5. Влияние фармакологических препаратов на состояние системы глутатиона в тканях отравленных животных 177
5.1. Влияние унитиола на состояние системы глутатиона в тканях животных при острых интоксикациях Р-хлорвиниддихлорарсином 178
5.2. Влияние фармакологических препаратов на состояние системы глутатиона втканях животных при острых интоксикациях 1.2-дихлорэтаном 182
5.3. Влияние средств фармакологической коррекции на состояние системы глутатиона при острых интоксикациях циклофосфаном 187
5.4. Влияние фармакологических препаратов на состояние системы глутатиона в тканях животных при острых и повторных интоксикациях доксорубицином 198
5.5. Влияние фармакологической коррекции на состояние системы глутатиона в тканях экспериментальных животных и выраженность клинических проявлений отравлений веществами седативно-гипнотического действия 209
Глава 6. Состояние системы глутатиона в эритроцитах пациентов в клинике острых тяжелых отравлений веществами седативно-гипнотического действия 224
6 1 Использование показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями веществами седативно-гипнотического действия с диагностическими целями 225
6.2. Показатели системы глутатиона в эритроцитах пациентов в клинике острых тяжелых отравлений веществами седативно-гипнотического действия при оценке эффективности новых фармакологических
препаратов 242
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 250
Заключение 279
Выводы 281
Практические рекомендации 283
Список литературы 287
Приложения 330
- Вопросы частной токсикологии исследуемых ксенобиотиков
- Методика проведения и структура экспериментального токсикологического исследования
- Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях 1,2-дихлор-этаном
- Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях веществами с возбуждающим действием на ЦНС
Введение к работе
Актуальность. Количество острых отравлений в развитых странах мира (например, в США около 600 000 случаев в год) и Российской Федерации ежегодно возрастает, не снижается существенно и число их летальных исходов (Литвинов Н.Н., 1997; Лужников Е.А., 1994), все это указывает на необходимость совершенствования мероприятий по оказанию помощи отравленным.
Действие многочисленных, химических веществ на организм человека сложно и многообразно. Существенно различаются механизмы токсического действия ксенобиотиков, патогеяез и проявления интоксикации. Поэтому решение задачи совершенствования оказания помощи отравленным сопряжено с необходимостью разработки новых многочисленных этиотропных препаратов (антидотов), а также средств патогенетической и симптоматической терапии острых интоксикаций. Организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антиради-калыюй защиты, репарации поврежденных биологических молекул и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсикантов разного строения. К их числу относится и система глутатиона. Она принимает участие в реализации целого ряда важнейших физиологических процессов: детоксика-ции и антиоксидантной защиты; в биохимических превращениях витаминов С, Б, липоевой кислоты и убихинона; в регуляции тиол-дисульфидного равновесия; в процессе транспорта аминокислот; в поддержании восстановленной среды клетки; в регуляции углеводного, липидного, белкового и нуклеинового обменов; в поддержании гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии; в поддержании оптимального состояния и функций биологических мембран; в регуляции клеточной пролиферации; в обмене ряда эйкозаноидов — простагландинов и лейкотриенов; глутатион выступает и в качестве резерва цистеина в клетке; участвует в регуляции функциональной активности лимфоцитов и обеспечении иммунного ответа организма; оказывает регулирующее влияние на синтез белков теплового щока; принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели (Кулинский В.И., 1990; Мап-nervik В., 1989; Meister А., 1983).
Все это позволяет, по мнению Л.А.Тиунова (1988, 1995), рассматривать обмен глутатиона в качестве механизма обеспечения неспецифической резистентности организма к действию широкого круга токсикантов. В настоящее время синтезированы новые фармакологические препараты на основе глутатиона, в том числе, для профилактики и лечения токсического повреждения тканей при действии ипритов, цитостатиков и других цитото'ксических агентов' (Саватеев Н.В., 1984; КуценкоС.А., 2004).
В системе диагностики риска развития поражений тканей внутренних органов при воздействии цитотоксических агентов прослеживаются существенные недостатки: выявляемые современными лабораторными и инструментальными методами изменения часто указывают на глубокий, мало обратимый характер повреждений тканей. В то же время имеются данные о перспективности определения содержания концентрации восстановленного глутатиона в клетках крови
при оценки тяжести отравлений различными токсикантами (Карпищенко А.И., 1997; Ливанов Г.А., 2001).
По мере накопления фактического материала становится очевидным, что роль нарушений системы глутатиона в патогенезе интоксикаций веществами с различными механизмами действия далеко не одинакова. Подтверждением этого может служить и низкая эффективность цитопротекторных препаратов, которые назначаются порой без должных на то показаний.
Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия является важной проблемой современной токсикологии, решение которой может способствовать существенному росту эффективности оказания помощи отравленным, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.
В связи с этим целью нашего исследования явилось выявление основных закономерностей реакций системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия и на их основе разработка путей оптимизации диагностики и тактики оказания помощи отравленным при острых интоксикациях.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи исследования:
изучить в динамике изменения системы глутатиона при однократном и повторном воздействии в разных дозах веществ с различными механизмами токсического действия (циклофосфан, 1,2-дихлорэтан, р-хлорвинил-дихлорарсин, доксорубицин, паракват, фенилгидразин, тиопентал натрия, этанол, азалептин, 1,1-диметилгидразин, диалкилпроизводное фосфорил-тиохолина) в ряде органов (печень, почки, сердце, головной мозг, эритроциты) экспериментальных животных;
исследовать влияние на состояние системы глутатиона и сопряженных биохимических систем в тканях отравленных лабораторных животных принятых на снабжение и перспективных лекарственных средств различных фармакологических групп (антиоксидант, антигипоксанты, ноотропные препараты, производные глутатиона и предшественники его синтеза, индукторы белкового синтеза, хелаторные агенты), предназначенных для защиты клеток от повреждающего действия ядов;
определить возможность использования показателей состояния системы глутатиона в клетках периферической крови с целью диагностики степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Острые отравления ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия вызывают существенные изменения состояния системы глутатиона в тканях отравленных животных. Их направленность, вы-
!
раженность и длительность определяются величиной введенной дозы токсиканта, его токсико-кинегическими и токсяко-динамическими параметрами (распределением в организме и преимущественным накоплением в тканях, особенностями метаболических превращений, наличием специфических механизмов токсического действия и т.д.), тканевыми особенностями обмена глутатиона.
В основе нарушений обмена глутатиона в органах и тканях отравленных животных лежит реализация цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков. Возможно существование ряда независимых самостоятельны): пусковых механизмов повреждения системы глутатиона и связанных с этим путей реализации цитотоксического действия токсикантов.
При разработке новых препаратов цитопротекции и изучении их эффективности в экспериментальных условиях и в клинике может использоваться оценка динамики изменений системы глутатиона в тканях различных органов отравленных животных и в эритроцитах пациентов.
Динамическое исследование показателей системы глутатиона в эритроцитах отравленных лиц может быть включено в систему лабораторной диагностики тяжести цитотоксического поражения тканей, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка изменений состояния системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, сердце, легкие, головной мозг, эритроциты) при острых отравлениях токсикантами с различными механизмами токсического действия. Показана взаимосвязь между направленностью и глубиной изменений состояния естественной системы цитопротекции и выраженностью цитотоксических свойств ксенобиотиков — активация ферментов обмена глутатиола (ГП, ГР, Г-6-Ф-ДГ) на фоне обратимого снижения содержания ВГ на 20-40 % при острых интоксикациях регулятор-нымй ядами; уменьшение уровня ВГ в 2—10 раз ниже контроля, угнетение активности ферментов обмена глутатиона, срыва гомеостатических функций этой биохимической системы в тканях животных с острыми отравлениями веществами с выраженными цитотоксическими свойствами. Проведен анализ причин, вызывающих нарушения состояния системы глутатиона при острых отравлениях, выявлены механизмы развития данных изменений (истощение запасов ВГ при осуществлении глутатионовой конъюгации; повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионпероксидазы и ферментов восстановления глутатиона^ образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и критическое снижение уровня восстановленного глутатиона; развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей; прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биосинтеза; критическое расходование ВГ на поддержание нативной структуры биологически значимых макромолекул) и их роль в формировании
цитотоксических эффектов действия широкого круга ксенобиотиков. Показана возможность использования показателей системы глутатиона в тканях отравленных животных при разработке новых направлений поиска средств фармакологической коррекции цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков и оценке их эффективности. Обоснованы некоторые патогенетические направления цитопротекции (синтез антиоксидантов., антигипоксантов, комплексооб-разующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона и предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза), связанные с восстановлением состояния обмена глутатиона. Показана принципиальная возможность использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов для установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации. Разработаны диагностические схемы использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами, включающие в себя динамическое определение (в течение 1-3 суток) содержания восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, глутатионпероксидазы и каталазы.
Практическая значимость работы заключается в том, что полученные в ходе диссертационного исследования данные о динамике изменений состояния системы глутатиона в тканях человека и лабораторных животных в условиях острых отравлений ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия позволяют сформулировать представление об общих механизмах цитотоксического действия ксенобиотиков, связанных с повреждениями указанной биохимической системы. Представления о механизмах нарушений состояния естественной системы цитопротекции могут быть положены в основу поиска новых лекарственных препаратов (антиоксидантов, антигипоксантов, комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона, индукторов белкового синтеза), обладающих цитопротекторными свойствами. Оценка состояния системы глутатиона в биосредах пациентов может использоваться в качестве метода установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза течения интоксикации седативно-гипнотическими препаратами, цитостатиками (циклофосфан, доксоруби-цин). Определение параметров системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида, диеновых конъюгат, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионре.ггуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы, каталазы) может использоваться при проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов для скриниговой оценки их цитопротекторкых свойств.
Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токси-
кологии и медицинской защиты и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, в лечебно-диагностическом процессе в Центре лечения острых отравлений Научно-исследовательского института Скорой Помощи им. И.И.Джанелидзе, были учтены при разработке и внедрении в клиническую практику отечественных препаратов «Реамберин», «Цитофлавин», «Мексидол».
В процессе выполнения диссертационного исследования подано и принято к использованию в Военно-медицинской академии 14 рационализаторских предложений.
Апробация работы проведена на национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 1997, 2002), на международном симпозиуме "Биоан-тиоксидант" (Тюмень, 1997), на V научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства - человеку» (Харьков, 1998), на международной конференции "Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм» (Санкт-Петербург, 2000), на международном симпозиуме «Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), на юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2000), на Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), на VIII, IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003), на Всероссийской научной конференции «Биохимия - Медицине» (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), на 2-ом съезде токсикологов России (Москва, 2003), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), на Всероссийской научной конференции «Фармакотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях» (Санкт-Петербург, 2004), на XXXVI World Congress on Military Medicine (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 88 работ, в том числе 27 статей в отечественных научных журналах.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, 4 глав полученных результатов, их обсуждение, заключение и выводы. Работа изложена на 451 странице машинописного текста, содержит 7 рисунков, 145 таблиц (23 в тексте и 122 в приложении) и 1 схему. Список литературы состоит из 454 источников, из них 194 отечественных И 260 иностранных авторов.
Вопросы частной токсикологии исследуемых ксенобиотиков
За счет превращения восстановленной формы глутатиона в окисленную система глутатиона принимает ведущее участие в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в тканях [98. 170. 328. 349. 353. 367. 454]. необходимого для осуществления таких процессов жизнедеятельности клеток. как работа мембранных структур, деятельность цитоскелета. клеточное деление. регуляция активности гормонов пептидной структуры [353. 438]. Для эффективного поддержания динамического равновесия между содержанием белковых тиолов и дисульфидов (со значительным преобладанием концентрации первых) в организме высших животных параллельно функционируют две дисульфидредуктазиые системы: глутатионовая и тиоредоксиновая [98. 300, 353. 255. 450]. При этом глутатионовая является ведущей, так как в различных тканях она обеспечивает восстановление до 74-88 % низкомолекулярных и 88 % белковых дисульфидов, а также все смешанные дисульфиды глутатиона с белками [98, 353]. Перенос протонов с глутатиона на дисульфиды происходит под действием двух ферментов: протеииОис) чьфидиюмеразы [36. 438] и тиолтрапс- 26 феразы [296, 328, 349, 342], различающихся по специфичности к окисленным субстратам и компартментализации в клетке. Наряду с глутатион-зависимыми антиоксидантними ферментами, они также относятся ко второй группе ферментов обмена глутатиона [359].Тем не менее, эффективность функционирования глутатионовой дисульфидредуктазной системы во многом определяется не активностью этих ферментов, а соотношением концентраций восстановленной и окисленной форм глутатиона, в норме различающихся на 2 порядка и более [99]. Поэтому глутатион рассматривается в качестве основного компонента редокс-буфера клетки, устойчиво поддерживающего характерную для нее восстановленную среду [353, 454]. В свою очередь выполнение ферментами системы глутатиона функций поддержания тиол-дисульфидного равновесия и восстановленной среды клетки, антиоксидантной защиты во многом определяется возможностями быстрой наработки восстановленной формы глутатиона.
Как уже отмечалось выше, основными источниками поддержания высокого содержания ВГ в клетке являются ферменты третьей группы обмена глутатиона - глутатионредуктаза и гчюкозо-6-фосфит )сг\н)ригеназа [359].
Глутатиащждуктиш - флавопротеин, состоящий из двух идентичных субъединиц, содержащих флавинадениндинуклеотид, молекулярная масса фермента около 105 кДа (эритроциты человека) [330, 359]. ГР является классическим цитозольным ферментом [261], активность которого регулируется цАМФ-зависимым механизмом [87, 305]. Каталитическая активность ГР также зависит от состояния ее SH-групп, поэтому при физиологических концентрациях ВГ оказывает ингибирующее влияние на фермент [227, 235, 330]. ГР катализирует следующую реакцию: 2 НАДФН + ОГ - 2 НАДФ + 2 ВГ. Действительно, скорость НАДФН-зависимого восстановления окисленного глутатиона в ВГ под действием глутатион-редуктазы (ГР) намного превосходит возможности его синтеза de novo в тканях [98, 246]. Необходимым условием для осуществления глутатионредуктазной реакции является наличие в тканях достаточного уровня НЛДФН, так как его расходование при этом в 6 раз выше, чем на биосинтез жирных кислот и обеспечение процессов микросомального окисления [184]. Основным источником восстановленной формы НАДФ является ключевая реакция пентозофосфатного пути метаболизма углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная (Г-6-Ф-ДГ). которая и лимитирует возможности редокс-циклирования глутатиона [ 180, 181, 426].
Особенностью действия ГТ является то, что она осуществляет не только пероксидазную реакцию, но и необратимую конъюгацию ВГ с липофиль-ными токсическими соединениями, причем не только со вторичными продуктами пероксидации (4-гидроксиалк-2-еналями, эпоксидами и холестерин-а-оксидом) [199, 352]. но и с другими субстратами, обладающими достаточно электрофильным центром [100, 353]. Это позволяет отнести глутатион-трансферазу к четвертой группе ферментов обмена глутатиона.
Глутатион-Б-трансфераш - группа ферментов с полифункциональной активностью [85, 444]. В настоящее время приводятся сведения о не менее 11 изоформах фермента [85, 351, 356]. ГТ осуществляют четыре основных типа реакций [85]: 1) присоединения к субстрату (R) полной молекулы восстановленного глу татиона (GSH): R + GSH - HRSG; 2) нуклеофильное замещение: RX + GSH -» HSG + НХ, «уходящей» группой в этой реакции может быть галоген". N02\ HSO , RO. RS", CN" и др.: 3) восстановления органических гидроперекисей: ROOH + 2 GSH - ROH+ GSSG + Н20, эта реакция (неселеновая глутатионпероксидазная) рассматривалась выше; 4) изомеризация (стероидов и простагландинов). Все ГТ- гомо- и гетеродимеры с молекулярной массой 43-57 кДа [85, 320]. В каждой субъединице имеется по одному независимому активному центру. В активном центре различают субцентры G и Н. Первый связывает ВГ в вытянутой конформации. в этом субцентре содержатся гистидин, аргинин и SH-rpynna [85, 209, 353]. Субцентр Н связывает гидрофобный субстрат, в нем содержится глицин [224].
Методика проведения и структура экспериментального токсикологического исследования
Глутатионовая конъюгация занимает одно из центральных мест в механизмах детоксикации ряда ксенобиотиков [49, 180, 181]. В настоящее время известно более 40 типов химических соединений (не менее 3000), вступающих в реакции конъюгации с глутатионом [85, 379]. Их объединяет наличие электрофильного центра, способного реагировать с SH-группой восстановленного глутатиона, кроме того, субстрат обязательно должен быть гидрофобным или иметь гидрофобные зоны. На первом этапе глутатионовой конъюгации, катализируемом ГТ, происходит образование комплекса глута-тион-ксенобиотик. Этот фермент обладает высокой специфичностью к ВГ, но низкой по отношению к субстрату.
«Платой» за низкую каталитическую активности ГТ является ее высокое содержание в тканях, особенно в печени (от 2-4 % до 10 % от всех растворимых белков) [297, 379]. Фермент локализуется преимущественно в цитоплазме, около 4-6 % суммарной активности ГТ в клетке приходится на долю эндоплазматического ретикулума, что позволяет обеспечить наиболее эффективную детоксикацию активных метаболитов, образующихся под действием микросомальных оксигеназ [49].
На втором этапе глутатионовой конъюгации под воздействием фермента у-глута.\\штранспвппшдазы от комплекса глутатион-субстрат происходит отделение остатка глутаминовой кислоты. Данный фермент является мембраносвязанным, максимальная его активность определяется в почках. ГГТП имеет молекулярную массу около 68 кДа и представляет собой гете-родимер, состоящий из двух субъединиц, молекулярной массой 46 и 22 кДа. соответственно [359, 360, 424, 426].
Во-первых, в реакциях обезвреживания образующихся при окислении липофильных ксенобиотиков системой цитохрома Р450 гидрофильных метаболитов, которые могут быть еще более токсичными, чем их предшественники. И если при относительно низком уровне токсического воздействия все метаболиты вступают в реакции конъюгации и обезвреживаются, то увеличение его интенсивности может приводить к истощению возможностей системы конъюгации, накоплению метаболитов в тканях и взаимодействию их С молекулами белка, ДНК, РНК [223].
Во-вторых, несмотря на то, что ВГ, необходимый для осуществления конъюгации, нельзя отнести к макроэргическим соединениям (в отличие от ацетил-СоА, уридиндифосфоглюкуроновой кислоты, 3 -фосфоаденозин-5 -фосфосульфата, S-аденозил-1-метионина), его синтез de novo или восстановление из окисленной формы, осуществляемые ферментами системы глутатиона, требуют затрат энергии за счет расходования НАДФН и АТФ [98, 359].
В-третьих, осуществление четвертого этапа детоксикации липофильных ксенобиотиков непосредственно связано с механизмами антиперекисной защиты клетки, ключевое место в которых принадлежит системе глутатиона. Как выше, данная биохимическая система принимает нспосредсі-велнос участие в ofiempcarn ванни как ЛФК, образ у ю и J и хея в результате деятельности мнк-росомалшых моноокснгснаі гак н продуктов, свободЕіорадп-калыюго окислення орган н ческ н к ономоле кул J10Ч 11, 32. А9 І 80. 1 В З J.
В настоящее время имеются сведения и о взаимосвязи нарушений системы глутатиона и процессов биоэнергетики в тканях [Зі. 43, 86. 142]. Показано. что причинами угнетения процессов синтеза макроэргов могут стать активация свобод норад и кал ьных процессов и повреждение мембран митохондрий. угнетение активности тиолзависимых ферментов энергетического обмена (гексокиназа. 6-фосфофруктокиназа. глицероальдегидфосфатдегид-ро-геназа, пиру ватки наза. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. сукцинатдегид-рогеназа). снижение содержания липоевой кислоты (кофермент пируватде-гидрогеназы и а-кетоглутаратдегидрогеназы). изменение структуры (за счет перезамыкания тиоловых связей) и гормональной активности инсулина и глюкагона. Все эти изменения прямо связаны с истощением функциональных возможностей системы глутатиона.
Таким образом, повреждения данной биохимической системы тесно связаны с реализацией эффектов цитотоксичности.
В настоящее время появились данные и о существенной роли системы глутатиона в механизмах развития гипоксии [43, 52. 62. 142]. занимающей важное место в реализации цитотоксических эффектов ряда ксенобиотиков [65, 68. 119]. Так. в целом ряде работ приводятся сведения о нарушениях ти-ол-дисульфидного равновесия в тканях при различных формах гипоксии [377]. о снижении уровня ВГ и повышении концентрации его окисленной формы [275, 283. 327, 377, 408. 430. 439]. об угнетении активности ферментов антирадикальной защиты и интенсификации процессов СРО [203. 224. 235. 275. 283. 364. 377. 407]. При этом, нарушениям состояния системы глутатиона отводят лидирующую роль в реализации механизмов гибели клетки. вызванной воздействием гипоксии [203. 239, 240, 307. 314, 321. 354. 439].
Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях 1,2-дихлор-этаном
Действие многочисленных химических веществ на организм человека сложно и многообразно. Существенно различаются механизмы токсического действия ксенобиотиков, патогенез и проявления интоксикации. Поэтому решение задачи совершенствования оказания помощи отравленнным сопряжено с необходимостью разработки новых многочисленных этиотропных препаратов (антидотов), а также средств патогенетической и симптоматической терапии острых интоксикаций. Вместе с тем организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антирадикальной защиты, репарации поврежденных биологических молекул и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсикантов разного строения. К числу таких систем относится и система глутатиона. Она принимает участие в реализации целого ряда важнейших физиологических процессов: детоксикации и антиоксидантної! защиты; в биохимических превращениях витаминов С, Е, липоевой кислоты и убихинона; в регуляции тиол-дисульфидного равновесия, в процессе транспорта аминокислот; в поддержании восстановленной среды клетки; в регуляции углеводного, липидного, белкового и нуклеинового обменов; в поддержании гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии; в поддержании оптимального состояния и функций биологических мембран; в регуляции клеточной пролиферации; в обмене ряда эйкозаноидов - простаг-ландинов и лейкотриенов; глутатион выступает и в качестве резерва цистеи-на в клетке; участвует в регуляции функциональной активности лимфоцитов и обеспечении иммунного ответа организма; оказывает регулирующее влия 8 ниє на синтез белков теплового шока; принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели [98, 99, 350, 352, 359].
Все это позволяет, по мнению Л.А.Тиунова (1988, 1995), рассматривать систему глутатиона в качестве механизма обеспечения неспецифической резистентности организма к действию широкого круга токсикантов. Указанное выше способствует появлению новых фармакологических препаратов на основе глутатиона, в том числе, для профилактики и лечения токсического повреждения тканей при действии ипритов, цитостатиков и других цитотоксических агентов [3, 33,47, 73, 101].
В системе диагностики риска развития поражений тканей внутренних органов при воздействии цитотоксических агентов прослеживаются существенные недостатки: выявляемые современными лабораторными и инструментальными методами изменения часто указывают на глубокий, мало обратимый характер повреждений тканей [3, 73]. В то же время имеются данные о перспективности определения содержания концентрации восстановленного глутатиона в клетках крови при оценки тяжести отравлений различными токсикантами [45, 70, 112]
По мере накопления фактического материала становится очевидным, что роль нарушений системы глутатиона в патогенезе интоксикаций веществами с различными механизмами действия далеко не одинакова. Подтверждением этого может служить и низкая эффективность цитопротекторных препаратов, которые назначаются порой без должных на то показаний.
Таким образом, выявление закономерностей реагирования системы глутатиона на острое воздействие химических веществ с различными механизмами токсического действия является важной проблемой современной токсикологии, решение которой может способствовать существенному рост} эффективности оказания помощи отравленным, благодаря целенаправленному совершенствованию средств фармакологической коррекции, точного определения показаний к их назначению.
1. Острые отравления ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия вызывают существенные изменения состояния системы глутатиона в тканях отравленных животных. Их направленность, выраженность и длительность определяются величиной введенной дозы токсиканта, его токсико-кинетическими и токсико-динамическими параметрами (распределением в организме и преимущественным накопле-ниием в тканях, особенностями метаболических превращений, наличием специфических механизмов токсического действия и т.д.), тканевыми особенностями обмена глутатиона.
2. В основе нарушений обмена глутатиона в органах и тканях отравленных животных лежит реализация цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков. Возможно существование ряда независимых самостоятельных пусковых механизмов повреждения системы глутатиона и связанных с этим путей реализации цитотокси чес кого действия токсикантов.
3. При разработке новых препаратов цитопротекции и изучении их эффективности в экспериментальных условиях и в клинике может использоваться оценка динамики изменений системы глутатиона в тканях различных органов отравленных животных и в эритроцитах пациентов.
4. Динамическое исследование показателей системы глутатиона в эритроцитах отравленных лиц может быть включено в систему лабораторной диагностики тяжести цитотоксического поражения тканей, эффективности проводимого лечения и прогноза исхода интоксикации.
Состояние системы глутатиона при острых интоксикациях веществами с возбуждающим действием на ЦНС
Впервые проведена комплексная оценка изменений состояния системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов в различных тканях экспериментальных животных (печень, почки, сердце, легкие, головной мозг, эритроциты) при острых отравлениях токсикантами с различными механизмами токсического действия. Показана взаимосвязь между направленностью и глубиной изменений состояния естественной системы цитопротекции и выраженностью цитотоксических свойств ксенобиотиков - активация ферментов обмена глутатиона (ГП, ГР, Г-6-Ф-ДГ) на фоне обратимого снижения содержания ВГ на 20 - 40 % при острых интоксикациях регуляторными ядами; уменьшение уровня ВГ в 2-Ю раз ниже контроля, угнетение активности ферментов обмена глутатиона, срыва гомеостатиче-ских функций этой биохимической системы в тканях животных с острыми отравлениями веществами с выраженными цитотоксическими свойствами. Проведен анализ причин, вызывающих нарушения состояния системы глутатиона при острых отравлениях, выявлены механизмы развития данных изменений (истощение запасов ВГ при осуществлении глутатионовой конъюгации; повышенная наработка активных форм кислорода при относительной недостаточности резервов активности глутатионпероксидазы и ферментов восстановления глутатиона; образование в организме свободнорадикальных промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и критическое снижение уровня восстановленного глутатиона; развитие нарушений энергетического метаболизма клеток и тканей; прямое повреждение ферментов обмена глутатиона или нарушения процессов их биосинтеза; критическое расходование ВГ на поддержание нативной структуры биологически значимых макромолекул) и их роль в формировании цитотоксических эффектов действия широкого круга ксенобиотиков. Показана возможность использования показателей системы глутатиона в тканях отравленных животных при разработке новых направлений поиска средств фармакологической коррекции цитотоксических эффектов действия ксенобиотиков и оценке их эффективности. Обоснованы некоторые патогенетические направления цитопротекции (синтез антиоксидантов, антигипоксантов, комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона и предшественников его синтеза, индукторов белкового синтеза), связанные с восстановлением состояния обмена глутатиона. Показана принципиальная возможность использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов для установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и про 12 гноза исхода интоксикации. Разработаны диагностические схемы использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов с острыми отравлениями седативно-гипнотическими препаратами, включающие в себя динамическое определение (в течение 1-3 суток) содержания восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида. активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы. глутатионредуктазы. глутати-OH-S-трансферазы. глутатионпероксидазы и каталазы.
Практическая значимость работы заключается в том. что полученные в ходе диссертационного исследования данные о динамике изменений состояния системы глутатиона в тканях человека и лабораторных животных в условиях острых отравлений ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия позволяют сформулировать представление об обших механизмах цитотоксического действия ксенобиотиков, связанных с повреждениями указанной биохимической системы. Представления о механизмах нарушений состояния естественной системы цитопротекции могут быть положены в основу поиска новых лекарственных препаратов (антиоксидантов. антигипоксантов. комплексообразующих соединений, препаратов экзогенного глутатиона. индукторов белкового синтеза), обладающих цитопротектор-ными свойствами. Оценка состояния системы глутатиона в биосредах пациентов может использоваться в качестве метода установления степени тяжести интоксикации, эффективности проводимого лечения и прогноза течения интоксикации седативно-гипнотическим и препаратами, цитостатиками (ииклофосфан. доксорубицин). Определение параметров системы глутатиона и сопряженных биохимических процессов (концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков, малонового диальдегида. диеновых конъюгат. активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. глутатионредуктазы. глутатионпероксидазы. глутатион-Б-трансферазы. каталазы) может использоваться при проведении доклинических и клинических испытаний новых фармакологических препаратов для скриниговой оценки их цитопро-текторных свойств.
Реализация результатов исследования- Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, в лечебно-диагностическом процессе в Центре лечения острых отравлений Научно-исследовательского института Скорой Помоши им. И.И.Джанелидзе, были учтены при разработке и внедрении в клиническую практику отечественных препаратов «Реамберин», «Цитофлавин», «Мексидол». Апробация работы проведена на национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 1997, 2002), на международном симпозиуме "Био-антиоксидант" (Тюмень, 1997), на V научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства - человеку» (Харьков, 1998), на международной конференции "Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм» (Санкт-Петербург, 2000), на международном симпозиуме «Здоровье и химическая безопасность на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000). на юбилейной научной конференции с международным участием, посвященной 140-летию кафедры душевных и нервных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2000), на Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), на VIII, IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002, 2003), на Всероссийской научной конференции «Биохимия - Медицине» (Санкт-Петербург. 2002), на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), на 2-ом съезде токсикологов России (Москва, 2003), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004), на Всероссийской научной конференции «Фармакотерапия гипоксии и ее последствий при критических состояниях» (Санкт-Петербург, 2004), на XXXVI World Congress on Military Medicine (Санкт-Петербург, 2005). Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 89 работ, в том числе 27 статей в отечественных научных журналах, оформлено 14 рационализаторских предложений.
