Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Пневмония как патология, протекающая с системной воспалительной реакцией 15
1.2. Эпидемиология пневмонии и сепсиса 18
1.3. Патогенез системной воспалительной реакции при пневмонии
1.3.1. Ключевые этапы противоинфекционной защиты при бактериальной инфекции 26
1.3.2. Механизмы индукции системной воспалительной реакции 32
1.3.3. Молекулярные аспекты системного воспалительного ответа при инфекционном воспалении 40
1.4. Определение и характеристика тяжести состояния при пневмонии
1.4.1. Общепринятые подходы к оценке тяжести пневмонии 78
1.4.2. Диагностика дисфункции печени при тяжелой бактериальной инфекции 81
1.5. Основные направления антибиотикотерапии и подходы к оценке ее эффективности, основанные на принципах доказательной медицины
1.5.1. Ключевые принципы доказательной медицины 83
1.5.2. Принципы рациональной антибактериальной терапии 85
1.5.3. Иммуномодулирующие свойства антимикробных препаратов: перспективы исследования новых терапевтических мишеней 94
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Общая характеристика исследования 99
2.2 Лабораторные методы исследования 108
2.3 Статистический анализ 125
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Характеристика больных 127
3.1.1. Характеристика критериев, составляющих ССВО 134
3.1.2. Тяжесть состояния 139
3.1.3. Характеристика антибактериальной терапии 142
3.2. Патофизиология системной воспалительной реакции при пневмонии
3.2.1 Системная концентрация про и противовоспалительных цитокинов в зависимости от тяжести пневмонии 146
3.2.2. Уровень МДА в плазме как маркер оксидативного стресса 157
3.2.3. Значение циркулирующих лейкоцитов в патофизиологии системной воспалительной реакции при пневмонии 158
3.3. Тяжесть состояния больных и функциональное состояние печени при пневмонии
3.3.1. Результаты исследования концентрации MEGX и гиалуроновой кислоты 180
3.3.2. Показатели стандартных биохимических печеночных тестов 183
3.3.3. Взаимосвязь функциональной активности печени с тяжестью состояния и выраженностью системной воспалительной реакции при тяжелой пневмонии 185
3.4. Оценка эффективности эмпирической антибактериальной терапии у больных тяжелой пневмонией с системным воспалительным ответом 189
3.5. Предсказательная способность исследуемых клинико-лабораторных параметров в отношении смертности при пневмонии 196
Глава 4. Обсуждение
4.1. Общая характеристика результатов исследования 202
4.2. ССВО и СКПО у больных пневмонией 206
4.3. Патофизиологические изменения у больных тяжелой пневмонией и ССВО..208
4.3.1 Особенности экспрессии egr-1 216
4.3.2. Особенности экспрессии HSP70 217
4.3.3. Особенности экспрессии MnSOD(SOD2) 219
4.3.4. Особенности экспрессии поверхностных молекул циркулирующих лейкоцитах 220
4.4. Системный воспалительный ответ и связь с исходом заболевания 221
4.5. Дисфункция печени на фоне системной воспалительной реакции как пример экстрапульмональной патологии при тяжелой пневмонии 226
4.6. Значение мониторинга IL-6 для оценки терапии больных с тяжелой пневмонией и ССВО 229
4.7. Прогностическая ценность клинико-лабораторных показателей 232
Выводы 234
Практические рекомендации 237
Список литературы 23 8
- Молекулярные аспекты системного воспалительного ответа при инфекционном воспалении
- Системная концентрация про и противовоспалительных цитокинов в зависимости от тяжести пневмонии
- Оценка эффективности эмпирической антибактериальной терапии у больных тяжелой пневмонией с системным воспалительным ответом
- Дисфункция печени на фоне системной воспалительной реакции как пример экстрапульмональной патологии при тяжелой пневмонии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Внедрение антибактериальных средств в клиническую практику в середине 20 века значительно изменило тяжесть течения и снизило смертность при бактериальной пневмонии. Однако существенная модернизация лабораторно-инструментального оснащения, развитие фармакологической промышленности, рост объемов клинических испытаний не позволяют значительным образом изменить стойкие отрицательные показатели заболеваемости и смертности, сложившиеся за последнее десятилетие. Очевидно, что негативная динамика, которая формируется за счет пациентов с тяжелым течением заболевания, требует выработки единого подхода к оценке тяжести и создания соответствующей тактики лечения пневмонии. Ежегодное число заболевших пневмонией больных в России составляет около полумиллиона человек (Чучалин А.Г. и соавт. 2002). Несмотря на доступность новых эффективных антибактериальных средств, около 10 % госпитализированных с диагнозом внебольничная пневмония попадают в ОИТ (Fine MJ et al. 1997; Niederman MS et al. 1998). В США пневмония занимает пятое место среди всех причин смерти. В 1999 году было зарегистрировано около 90 тысяч летальных исходов от различных форм пневмонии, 40 тысяч из которых были следствием пневмококковой пневмонии (Natl Vital Stat Report 1999). Пневмония, развившаяся в стационаре, занимает второе место по частоте заболеваемости и летальности среди всех нозокомиальных инфекций. Летальность при бактериальной пневмонии, по разным источникам, составляет от 5% до 20% (Чучалин А.Г. 1999; Ноников В.Е. 2000), а у пациентов, находящихся в отделениях интенсивной терапии, возрастает до 30-50% (Hirani NA et al 1997, Leroy О. et al. 1995). Если пневмония относится к разряду внутрибольничных, то по некоторым данным летальность колеблется от 60-80% (Sheld WM et al.1991). В настоящее время в клинической практике отсутствует единый подход к определению тяжелой пневмонии и характеристике тяжести состояния таких больных.
Например, для оценки тяжести внебольничной пневмонии Американское Торакальное Общество, Европейское Респираторное Общество, Британская Торакальная Ассоциация рекомендуют различные критерии с различной степенью чувствительности и специфичности, базирующиеся на оценке объема поражения легочной паренхимы, степени дыхательной недостаточности, внелегочных нарушениях, уровне артериального давления, потребности в вазопрессорах и т.д. В клиническую практику преимущественно отделений интенсивной терапии внедрены различные шкалы (APACHE, SAPS и т.д.), характеризующие тяжесть состояния и прогнозирующие исход заболевания на основании комплексной клинической и лабораторно-инструментальной оценки пациентов [1]. На неблагоприятное течение пневмонии указывает появление признаков синдрома системного воспалительного ответа (ССВО). ССВО, возникающий вследствие как инфекционных, так и неинфекционных причин, характеризуется двумя или более признаками: температура >38 С или <36 С, ЧСО90 в минуту, частотой дыхания >20 в минуту или РаСОг <32 мм.рт.ст., лейкоциты> 12000 кл/мл3 или <4000 кл/мл3 или незрелые формы >10% (Bone RC, et al. 1992). Данный подход к оценке заболеваний, протекающих с генерализованной воспалительной реакцией, сформулированный в 1991 году на согласительной конференции ACCP/SCCM, позволяет рассматривать комбинацию ССВО с верифицированным инфекционным воспалением нижних дыхательных путей как сепсис (Bone et al., 1992). При появлении только двух критериев этого синдрома летальность пациентов отделений интенсивной терапии повышается в 2 раза, а при регистрации всех четырех критериев - в 3 раза (Rangel-Frausto М, et al 1995). С позиций этого определения пневмония является самой распространенной причиной терапевтического cencnca.(Malot I, et al. 2001) Легкие более, чем у 50 % пациентов с тяжелым сепсисом, являются «первичным» очагом инфекции (Angus DC, et al. 2001). В то же время среди основных причин высокой летальности при пневмонии тяжелого течения выделяют септический шок и синдром полиорганной дисфункции, включающий острый респираторный дистресс синдром.
Ключевым патогенетическим звеном, приводящим к высокой летальности при
пневмонии, является системная воспалительная реакция, которая на определенном этапе
теряет свою защитную роль и приводит к многочисленным нарушениям как на клеточном,
так и на органном уровнях. Среди биомаркеров системного воспаления выделяют про- и
противовоспалительные цитокины, нарушение баланса между которыми может
предопределить направление развития патологии (Bone RC et al 1996). Синтез этих
полипептидов при инфекционном процессе происходит как реакция на внешний стимул. На
начальных этапах образование цитокинов преимущественно моноцитарно-макрофагальной
системой носит локальный характер и ограничивается первичным инфекционным очагом.
Преобладание системной концентрации провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNFa)
связывают с неблагоприятным исходом при сепсисе (van der Poll et al. 1997). Использование
бронхо-альвеолярного лаважа при пневмонии позволило выявить высокую концентрацию
провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNFa) в лаважной жидкости. При этом выраженность
местной воспалительной реакции преобладала над системным образованием медиаторов
(Monton et al. 1997). При генерализации процесса возрастает концентрация цитокинов в
системном кровотоке, усугубляющая «иммунный диссонанс» и приводящая к дисфункции
ранее интактных органов и систем с формированием полиорганной недостаточности. В связи
с тем, что ИЛ-10 подавляет образование и хемотаксис нейтрофилов, понижает синтез ИЛ-8,
остается неясным и требует дальнейшего изучения влияние противовоспалительных
медиаторов на активность иммунокомпетентных клеток и скорость элиминации
возбудителя у больных пневмонией. При противовоспалительной реакции, сопровождающейся снижением экспрессии HLADR моноцитами, нарушается формирование адекватного иммунного ответа, повышающее вероятность развития суперинфекции (Wakefield СН et al. 1993). Однако роль циркулирующих лейкоцитов, занимающих ключевое место в обеспечении адекватной иммунологической защиты и относящихся к основным эффекторным клеткам воспаления, при тяжелой пневмонии остается не выясненной.
Прогрессирование системного воспаления отрицательно влияет на функциональное состояние внутренних органов и систем. Формирование внелегочных осложнений в рамках СПОД значительно ухудшает прогноз, поэтому ранняя диагностика дисфункции внутренних органов может способствовать правильной оценке тяжести заболевания. Контроль за функциональным состоянием внутренних органов при развитии генерализованного воспалительного процесса позволяет своевременно скорректировать тактику терапии. Особое внимание требует изучение состояния печени при пневмонии, так как она принмает участие в обеспечение процессов детоксикации и элиминации продуктов жизнедеятельности инфекционных агентов. Кроме того, печень занимает центральное место в регуляции острофазовой воспалительной реакции, метаболизме биологически активных веществ и ряда антибактериальных средств. Принятые в клинической практике рутинные статические тесты не обладают высокой чувствительностью и прогностической ценностью в отношении функциональной активности печени и не отражают начальной стадии дисфункции при тяжелой пневмонии. Способность MEGX-теста идентифицировать латентную или субклиническую дисфункцию печени при пневмонии как при частном варианте сепсиса приобретает особенную ценность (Igonin АА et al. 2000). Ранняя диагностика патологии печени при тяжелой пневмонии может способствовать профилактике возможных осложнений, в том числе синдрома полиорганной дисфункции (СПОД). Однако для этого требуется оценка прогностических свойств применяемых для диагностики маркеров.
Системная воспалительная реакция может изменять характер клинического ответа на антибактериальную терапию при пневмонии. В то же время особенность течения пневмонии с системной воспалительной реакцией подразумевает возможность использования медиаторов, находящихся в системном кровотоке, в качестве индикаторов интенсивности воспаления и маркеров эффективности антибиотиков у данной категории больных. Применение стандартных методов лечения пневмонии, включающих даже самые современные генерации антибиотиков, не позволяет изменить общую устойчивую
тенденцию увеличивающейся смертности при возникновении осложнений пневмонии. Изучение патогенеза тяжелой пневмонии, протекающей с системным воспалительным процессом, может позволить сформулировать новую стратегию лечения и определить новые терапевтические мишени.
Цель исследования: изучить роль системной воспалительной реакции в патогенезе тяжелой пневмонии и оценить место биологических маркеров воспаления в определении эффективности эмпирической антибактериальной терапии. Задачи исследования
изучить концентрацию провоспалительных (IL-6, IL-8, TNFa, CRP) и противовоспалительных маркеров (IL-10) в плазме больных тяжелой пневмонией
исследовать экспрессию провоспалительного (мРНК IL-6) и противовоспалительного цитокинов (мРНК IL-10) циркулирующих лейкоцитов и сопоставить с их концентрацией в системном кровотоке у больных тяжелой пневмонией
исследовать экспрессию ранних стрессовых генов (egr-1, c-jun, c-fos, HSP70) циркулирующими лейкоцитами больных тяжелой пневмонией
оценить выраженность оксидативного стресса (МДА) и его влияние на состояние антиоксидантной защиты (мРНК Cat, Cu/Zn-SOD, GSH-Px, MnSOD, GR) циркулирующих лейкоцитов у больных тяжелой пневмонией
исследовать экспрессию CDllb, CD25, CD95 и HLADR на циркулирующих лимфоцитах, нейтрофилах и моноцитах у больных с пневмонией на фоне антибактериальной терапии
сопоставить состояние больных пневмонией с тяжестью системной воспалительной реакции
определить выраженность внелегочных поражений на примере исследования состояния печени (MEGX-тест и ГК) и выяснить связь между ее функциональной активностью и тяжестью системного воспаления при тяжелой пневмонии
изучить значимость изменений системной концентрации цитокинов для оценки эффективности эмпирической антибактериальной терапии
сопоставить прогностическую ценность стандартных клинических критериев, отражающих эффективность эмпирической антибактериальной терапии, и биологических маркеров воспаления (IL-6, IL-10, CRP)
разработать критерии для оценки эффективности эмпирической антибактериальной терапии с использованием маркеров, отражающих активность циркулирующих лейкоцитов и выраженность системного воспаления у больных тяжелой пневмонией с ССВО.
Научная новизна
Впервые в мире у больных с тяжелой пневмонией с применением молекулярно-биологических технологий, включающих количественную полимеразно-цепную реакцию в режиме «реального» времени (РТ-ПЦР) проведено детальное изучение роли циркулирующих лейкоцитов в патогенезе системного воспаления.
На основании новых данных, полученных при изучение экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов, были охарактеризованы внутриклеточные механизмы самоограничения воспалительной активности циркулирующих лейкоцитов.
Впервые у больных тяжелой пневмонией с ССВО было установлено влияние системного воспаления на тяжесть течения заболевания и значение шкалы, предложенной Британской торакальной ассоциацией (BTS), для клинической оценки выраженности системного воспаления у данной категории пациентов.
Впервые была показана связь между функциональной активностью печени и выраженностью системной воспалительной реакции при пневмонии, также были установлены ключевые механизмы, ведущие к метаболической дисфункции печени.
Показана информативность MEGX-теста в диагностике патологии печени у больных тяжелой пневмонией и установлена высокая чувствительность MEGX-теста по сравнению со стандартными биохимическими тестами печени. 5. Разработаны новые рекомендации по оценке эффективности эмпирической антибактериальной терапии, базирующиеся на клинической характеристике и изменение концентрации интерлейкина-6 в системном кровотоке, для больных тяжелой пневмонией с системной воспалительной реакцией.
Практическая значимость
Полученные результаты исследования позволяют рассмотреть патогенез тяжелой пневмонии с точки зрения системной воспалительной реакции, а также оптимизировать подходы к антибиотикотерапии. В работе показано, что динамический мониторинг за уровнем IL-6 в плазме позволяет пересмотреть существующие критерии оценки эмпирической антибактериальной терапии у больных с тяжелой пневмонией на фоне ССВО. Указания на связь неблагоприятного исхода с выраженностью системной воспалительной реакцией подчеркивает важность мониторинга за концентрацией IL-б еще до начала терапии, так как высокий риск смертности у данной категории больных требует использования дополнительных неантибактериальных средств для локализации воспаления. Использование молекулярно-биологических методов исследования для изучения экспрессии генов, кодирующих IL-10 и HSP70, не обладает выраженной прогностической ценностью по сравнению с определением циркулирующих в крови белков (IL-6, IL-10 и CRP), а высокие материальные затраты делают рутинное исследование этих маркеров при тяжелой пневмонией нецелесообразным.
Результаты исследования функциональной активности печени с использованием MEGX-теста доказывают его более высокую информативность по сравнению со стандартными функциональными тестами печени. Дисфункция печени при снижении
концентрации MEGX ниже 30|ig/l отражает тяжесть течения пневмонии, а также свидетельствует о необходимости ограниченного использования комбинаций лекарственных средств с печеночным клиренсом для избежания нежелательных реакций.
Основные положения, выносимые на защиту
У больных тяжелой пневмонией, в системном кровотоке определяется повышенный уровень как воспалительных (IL-6, IL-8, CRP), так и противовоспалительных (IL-10) маркеров, которые характеризуют системную воспалительную реакцию, ассоциирующуюся с неблагоприятным исходом заболевания.
На фоне ССВО при пневмонии происходит активация защитных противовоспалительных механизмов, способствующих ограничению системной воспалительной реакции.
Дисфункция печени, как пример внелегочных осложнений при пневмонии связана с выраженностью системного воспалительного ответа и отражает тяжесть состояния больных пневмонией.
Назначение антибактериальных средств сопровождается уменьшением выраженности признаков системной воспалительной реакции у больных тяжелой пневмонией с ССВО.
Динамический контроль за уровнем IL-6 может быть использован в качестве дополнительного маркера, отражающего эффективность эмпирической антибактериальной терапии у пациентов с тяжелой пневмонией и ССВО.
Внедрение. Использованные методики и результаты работы внедрены в практическую деятельность пульмонологического и терапевтического отделений ГКБ №23 им. Медсантруд, лаборатории клинической фармакологии НИЦ ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики и клинической химии Института клинической фармакологии НЦ ЭСМП Министерства Здравоохранения РФ. Полученные данные применяются при
чтении лекций и проведении практических занятий, семинаров и элективных курсов со студентами на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ.
Апробация работы. Основные результаты, полученные в ходе исследования, доложены на конференции кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики НИЦ ММА им. И.М. Сеченова (Москва 2003), на 7 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2000), на Европейском конгрессе по биомаркерам патологии внутренних органов (Кембридж, Великобритания 2000), на 7 конгрессе ассоциации терапевтического мониторинга ЛС (Вашингтон, США 2001), на 12 ежегодном конгрессе Европейской Респираторной Ассоциации (Стокгольм, Швеция 2002), на 13 ежегодном конгрессе Европейской Респираторной Ассоциации (Вена, Австрия 2003), на 3 международной конференции «Клинические исследования ЛС» (Москва, 2003), на 2 международной научной конференции Европейской респираторной ассоциации по проблемам легких (Таормина, Сицилия, Италия, 2004). Работа проводилась при поддержке научно-исследовательского гранта Германского фонда академических обменов (DAAD # А/02/14013) и Университета Георга-Августа (Геттинген, ФРГ). Различные фрагменты работы были отмечены индивидуальными грантами и премиями конгрессов: EMBODY 2000 (travel grant), IATDMCT 2001 (Roger Boekx Memorial Award), ERS 2002 (Gold Sponsorship) и ERS 2003 (Young Scientist Sponsorship, Silver Sponsorship).
Структура и объем диссертации: Основной текст диссертации изложен на 262 страницах машинописи и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждение, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 54 таблицами и 65 рисунками. Библиография состоит из 19 отечественных и 225 зарубежных источников.
Молекулярные аспекты системного воспалительного ответа при инфекционном воспалении
Первым защитным барьером, препятствующим проникновению микробов в ткани, являются наружные и эпителиальные покровы. Кожные покровы служат как механическим барьером, так и снабжаются секретом потовых и сальных желез, что приводит к быстрому удалению патогенов, не относящихся к нормальной микрофлоре. Секрет желез (слюнные, пищеварительные, слизистые) слизистых эпителиальных поверхностей, соприкасающихся с внешней средой, содержит различные ферменты с бактерицидной активностью (лизоцим), а также компоненты гуморального иммунитета - секреторный IgA. Проникновению микроорганизмов в дыхательные пути препятствуют анатомические структуры (надгортанник, голосовые связки) и физиологические механизмы (кашель). Мерцательный эпителий дыхательных и мочевыводящих путей очищается от бактерий благодаря движению ресничек. Представители нормальной микрофлоры (комменсалы), колонизирующие слизистые, также препятствуют адгезии и внедрению патогенных микроорганзимов.
Однако нарушение в вышеперечисленных механизмах или попадание в организм штаммов, способных преодолевать защитные барьеры, приводит к проникновению патогенов в ткани. Способность возбудителей к адгезии (прилипание), относящейся к начальным этапам развития инфекционного процесса, относится к одному из факторов вирулентности. Адгезия бактерий подразделяется на два этапа - обратимый ("docking") и необратимый ("anchoring") и происходит за счет взаимодействия комплементарных рецепторов бактерий (адгезины) и эпителия организма-хозяина. Например, развитие инфекционного воспаления нижних отделов мочевыводящих путей вызывают только штаммы Е.соН, экспрессирующие пили 1 типа, которые соединяются с протеином Tamm-Horsfall, локализованного в слизистой эпителия. Бактерии, не обладающие данным фактором вирулентности, вымываются из организма. У изолятов кишечной палочки из верхних мочевыводящих путей обнаруживают Р-пили, прикрепляющиеся к клеткам почечной ткани и приводящие к воспалению почечной паренхимы. Проникновению бактерий через защитные барьеры способствуют специфические экстрацеллюлярные ферменты и белки (инвазины), облегчающие диссеминацию бактерий в ткани организма за счет своего цитотоксического эффекта. К инвазинам принадлежат некоторые экзотоксины Г+ бактерий, гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа и т.д.
После прохождения бактерий через барьеры в ткани включаются неадаптивные реакции, относящиеся к звеньям врожденного иммунитета и обеспечивающие защиту до активации антигенспецифических механизмов. Неадаптивный иммунитет включает активацию системы комплемента, мононуклеарных фагоцитов (макрофаги/моноциты), полиморфно-ядерных гранулоцитов (нейтрофилы) [11].
Индукция каскада системы комплемента относится к одной из центральных реакций врожденного иммунитета и способствует активации лейкоцитов, облегчает фагоцитоз микробов (опсонизация), а также напрямую участвует в элиминации внеклеточных возбудителей. Определение некоторых субъединиц комплемента (СЗ, С4, С5) при грам-отрицательном сепсисе показало, что активация данной системы происходит непосредственно под воздействием эндотоксина или ФНОа [181]. Особое значение при развитии сепсиса приобретает стимуляция дегрануляции тучных клеток с выделением различных медиаторов, активацией ЦОГ и образованием ТАг, повышением проницаемости сосудистой стенки. Индукция классического пути отмечается на 4-7 день после синтеза специфических антител. В первые часы инфекционного процесса осуществляется активация комплемента по альтернативному пути. При этом образуемый «мембранный атакующий комплекс» (МАК), приводит к перфорации бактериальной мембраны и гибели бактерий. Однако свойства и строение некоторых бактерий препятствуют запуску альтернативного пути комплемента и формированию МАК. Например, защитная капсула N.meningitis и Н.influenza предохраняет от воздействия комплемента.
Центральным механизмом, обеспечивающим уничтожение патогенов, является фагоцитоз, в котором главная роль принадлежит макрофагам и нейтрофилам. Мононуклеарные фагоциты в организме распределены между системным кровотоком (моноциты) и тканями внутренних органов (тканевые макрофаги - купферовские клетки, альвеолярные макрофаги и т.д.). Гранулоциты составляют большинство из циркулирующих лейкоцитов и относятся к короткоживущим клеткам. При несостоятельности местных звеньев иммунитета в ответ на бактериальную инвазию происходит миграция фагоцитирующих клеток из системного кровотока в пораженные ткани. Миграции предшествует процесс адгезии клеточных элементов к эндотелию сосудов. Пройдя через последовательные этапы адгезии (краевое стояние, активация, прикрепление, миграция и лизис), фагоцитирующие клетки попадают за пределы сосудистого русла (рисунок 5).
Направленное движение клеток в экстрацеллголярном пространстве обеспечивается хемотаксисом. К основным веществам, вызывающим хемотаксис (хемоатрактантам), принадлежат бактериальные элементы, система комплемента (субъединица СЗЬ), интерлейкин-8 и производное каскада арахидоновой кислоты - лейкотриен В4 (LTB4). Взаимодействие между бактерией и фагоцитами обеспечивается за счет их рецепторного аппарата. Как гранулоциты, так и мононуклеарные фагоциты экспрессируют рецепторы к иммуноглобулину (Fc-рецептор для IgG) и системе комплемента (CR1, CR2, СЮ или Масі, CR4), что обеспечивает полноценное взаимодействие с возбудителем, предопределяющее дальнейший механизм его элиминации. Связыванию также способствуют компоненты, присоединившиеся к бактериальной поверхности после проникновения в организм. Например, депозиция субъединицы комплемента СЗЬ на поверхности бактерий обладает опсонизирующим эффектом, так как усиливает фагоцитоз бактерий. К ключевым отличиям между основными фагоцитирующими клетками относится антигепрезентирующая функция макрофагов и их способность в активированном состоянии синтезировать медиаторы межклеточной кооперации - цитокины, модулирующие иммунный ответ организма, увеличивая хемотаксис нейтрофилов, пролиферацию иммунокомпетентных клеток и выраженность клеточного и гуморального иммунитета. Например, при инфекции нижних дыхательных путей, вызванных пневмококком (колонизация более 107), происходит активизация альвеолярных макрофагов, которые ускоряют «рекрутинг» полиморфно-ядерных нейтрофилов из капилляров легких и системного кровотока, разрушение и элиминацию бактерий.
Системная концентрация про и противовоспалительных цитокинов в зависимости от тяжести пневмонии
Дисрегуляция синтеза IL-6 относится к составной части патогенеза многих нозологии, среди которых выделяют коллагенозы, инфекционную патологию, онкологические заболевания.
Является неотъемлемой частью системной координированной воспалительной реакции в ответ на инвазию инфекционного агента. Синтезируемый после образования TNFa, он, с одной стороны, стимулирует дальнейшее воспаление, а с другой стороны, служит ограничителем продукции TNF, демонстрируя противовоспалительные свойства [110]. При острофазовой реакции, в индукции которой участвует IL-6, происходит синтез более 40 белков, обладающих про и противовоспалительными свойствами. Например, образование фибриногена препятствует гематогенной диссеминации возбудителя, а С-реактивный белок является опсонином, способствующим элиминации патогенов. Функции IL-6 тесно интегрированы со «стрессовой» системой организма, включающей гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, автономные центры и стволовые структуры мозга и периферической нервной системы. При стрессе, триггером которого в том числе является воспалительная реакция, наблюдается торможение роста и репродуктивной функции, отмечается сдвиг иммунного ответа в сторону Т хелперг иммунитета, изменяются свойства тиреоидных гормонов. В эксперименте секреция IL-6, опосредуемая Р-адренорецепторами, увеличивалась под действием катехоламинов и физической нагрузки [127]. Учитывая, что биологическая роль воспаления, развитие которого напрямую зависит от уровня IL-6, сводится к ограничению распространения возбудителя, функцию IL-6 в целом можно оценить как защита внутренней среды и поддержание гомеостаза. В тоже время чрезмерная IL-6 - зависимая острофазовая реакция оказывает пагубное воздействие на организм. Индукция острофазовой реакции небактериальным триггером у нормальных мышей приводит к синтезу TNFct, IL-6, приводит к анорексии, потере в весе, в то время как мыши с дефицитом образования IL-6 сохраняют высокую толерантность к таким стимулам [99]. В ситуации «неконтролируемого» воспаления IL-6 превращается в фактор, повышающий повреждение тканей и способствующий развитию полиорганных нарушений. Сообщается о связи высокой концентрации IL-6 в плазме с тяжестью состояния больных внебольничной пневмонией [120]. Также отмечалась зависимость между повышенной летальностью и уровнем циркулирующего IL-6 при сепсисе [76].
Основным источником цитокинов при инфекционном процессе становятся клетки «первичного» очага инфекции. Использование бронхо-альвеолярного лаважа при пневмонии позволило выявить высокую концентрацию провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNFct) в лаважной жидкости. При этом выраженность местной воспалительной реакции преобладала над системным образованием медиаторов [161]. При нетяжелом течении пневмонии воспалительная реакция ограничивается только легочной тканью. У больных с односторонней пневмонией легкого течения, концентрация IL-6, TNFct, IL-lp в пораженном органе была значительно выше, чем в интактном легком и выше чем в лаважной жидкости здоровых добровольцев. В плазме у больных пневмонией обнаруживались лишь немного повышенные концентрации IL-6 [77]. При генерализации процесса возрастает концентрация цитокинов в системном кровотоке, усугубляющая «иммунный диссонанс» и приводящая к формированию полиорганной недостаточности. Однако уровень цитокинов (IL-6 и TNFct, но не IL-ip) в плазме у больных тяжелой пневмонией был значительно выше, чем у пациентов, также находящихся на искусственной вентиляции легких по неинфекционным причинам [161]. Значение повышения системного уровня цитокинов подчеркивает тот факт, что концентрация TNFcc в плазме коррелировала с тяжестью пневмонии [184], а повышение IL-6 ассоциировалось с неблагоприятным прогнозом при пневмонии, особенно у пациентов с пневмококковой бактериемией [182]. Инфузия эндотоксина и перитонит у экспериментальных моделей приводили к значительному росту синтеза IL-6 клетками слизистой тощей, подвздошной кишки и различными отделами толстого кишечника. Обнаружение мРНК IL-6 указывало на высокую транскрипционную активность в клетках слизистой кишечника [174]. Таким образом, при сепсисе, когда механизмы, ограничивающие воспаление, оказываются поврежденными, первоначальный местный синтез IL-6 в очаге инфекции трансформируется в системную реакцию. Медиаторы, попадающие в системный кровоток, стимулируют синтез воспалительных молекул, в том числе в изначально интактных органах. Синтез факторов агрессии при сепсисе может осуществляться клетками, находящимися непосредственно в сосудистом русле. Предполагается, что повышенный синтез лейкоцитов и чрезмерное образование молекул адгезии при инфекционном воспалении нарушает миграцию клеток через сосудистую стенку в инфекционный очаг. Активированные клетки служат источником для поражения эндотелия, а высокие адгезивные свойства вызывают образование микроагрегатов. Однако роль циркулирующих лейкоцитов в синтезе цитокинов при сепсисе остается до конца не изученной. Инкубация ЛПС с изолированными из крови здоровых добровольцев моноцитами стимулировало как активацию транскрипции генов провоспалительных цитокинов, так и увеличение концентрации конечных продуктов синтеза. В первый час регистрировался рост концентрации мРНК TNFa, IL-8, IL-1J3, а через 2 часа инкубации - IL-6 и IL-la. Появление непосредственно белков в супернатанте отмечалось в течение первого часа инкубации. Определенная очередность в экспрессии генов и появлении цитокинов указывают на комплексный контроль за их синтезом, который осуществляется на уровне транскрипции, трансляции и секреции. Особенность реакции IL-6 на стимул заключалась в том, что индукции экспрессии мРНК предшествовало появление протеина в супернатанте. Рост концентрации IL-6 после повторной стимуляции 10 нг/мл ЛПС на 4 часу эксперимента продолжался на фоне падения уровня мРНК, что свидетельствует о роли трансляционных и посттрансляционных событий в образовании этого цитокина [243]. В исследовании Ertel et al. стимуляция ЛПС (1 мкг/мл) циркулирующих мононуклеарных клеток, полученных от не септических пациентов, приводила к резкому увеличению концентрации IL-6, TNFcc и IL-lp уже в течение первых 2 часов, как на уровне мРНК, так и на уровне протеинов. Рост концентрации IL-6 наблюдался в течение 24 часов. Обратный феномен был характерен для клеток, изолированных из крови септических больных.
Оценка эффективности эмпирической антибактериальной терапии у больных тяжелой пневмонией с системным воспалительным ответом
В клинических исследованиях, изучавших роль цитокинов при сепсисе, впервые опубликованных в середине 90-х годов была, обнаружена повышенная концентрация IL-10 в плазме, достигающая 20000 пг/мл. Отмечалось, что более высокий уровень цитокина был характерен для пациентов с септическим шоком по сравнению с лицами с бактериальной инфекцией и ССВО [145]. Тяжесть состояния больных статистически достоверно была связана с концентрацией IL-10 в системном кровотоке. При ОРДС в группе выживших больных был отмечен локальный рост IL- 10 в лаважной жидкости по сравнению с умершими пациентами [101]. Значительное местное повышение уровня IL-10 по отношению к уровню в плазме свидетельствует о важности локальной противовоспалительной реакции при сепсисе. Прямая корреляция концентрации TNFa с IL-10 при сепсисе указывает на то, что рост IL-10 зависит от воспалительного ответа организма и регулируется проксимальными провоспалительными цитокинами. Эксперимент со здоровыми добровольцами подтверждает эту гипотезу, так как внутривенное введение TNFct приводило к монофазному увеличению концентрации IL-10 в крови. В то же время введение рекомбинантного IL-10 добровольцам за 30 минут до ЛПС значительно снижало выработку TNF-a, IL-6, IL-8, и IL-lra, по отношению к контролю [187]. В настоящее время IL-10 относят к неотъемлемым атрибутам «компенсаторной противовоспалительной реакции», которая развивается при сепсисе в ответ на ССВО и характеризуется подавлением активности иммунного ответа, дефектом антигешгрезентирующих клеток, торможением пролиферации лимфоцитов и снижением синтеза провоспалительных цитокинов. Продолжительный период иммуносупрессии при сепсисе может смениться стойким иммунным «параличом», одну из ключевых ролей в патогенезе которого играет IL-10. Таким образом, предполагается, что данный цитокин может служить одним из регуляторов системной воспалительной реакции при инфекционной патологии.
HSP синтезируется клеткой в ответ на воздействие разнообразных экзогенных факторов, ведущее место среди которых занимает повышение температуры, характеризующее многие инфекционные заболевания и такие их осложнения, как тяжелый сепсис (таблица 10).
Основная биологическая функция данного класса белков сводится к защите клеточных структур (клеточные хапероны) за счет повышения стабильности внутриклеточных структур к внешнему воздействию. HSP облегчают биосинтез белка и формирование его конечной конформации, а также препятствуют деградации белка. Кроме того, HSP способствуют доставке белка к его внутриклеточным мишеням, облегчая транслокацию белков через внутриклеточные мембраны, ограничивающие органеллы от цитозоля [128, 90].
Для HSP характерна конституциональная экспрессия. В отсутствие стрессовой ситуации HSP связаны с фактором теплового шока (HSF), который относится к факторам транскрипции. Стимулом для высвобождения HSP служит появление в цитозоле денатурированных белков. В результате в цитозоле образуются свободная активная фракция HSF-мономера. Фосфорилирование HSF приводит к проникновению в ядро и к присоединению к промоутерной области генов, кодирующих HSP. Вновь синтезированные HSP связывают либо оставшиеся денатурированные белки, либо инактивируются факторами теплового шока. Таким образом, одним из механизмов активации транскрипции HSP генов является негативная регуляция HSF. С другой строны, в ситуации, когда воздействие триггера повышает активность протеинкиназы С, возможна непрямая индукция HSF с последующим запуском транскрипции HSP генов. В активации транскрипции HSP, обладающих низкой молекулярной массой (HSP27), участвуют МАРК.
В зависимости от своей молекулярной массы (kDa) HSP делятся на несколько классов: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 и более мелкой массы. Наиболее важное значение из всех классов белков теплового шока отводится HSP70, который кодируется 11 различными генами. Два гомологичных белка HSP70-1 и HSP70-HOM, кодируемые одноименными генами, демонстрируют конституциональную экспрессию. Их роль особенно важна в различных фазах клеточной пролиферации дифференцировке. Также они участвуют в корректном формировании белковой конформации и транспорте белков через мембраны, в процессе апоптоза и функции стероидных рецепторов. С другой стороны, индуцибильные протеины HSP70-1 и HSP70-2 синтезируются в ответ на экзогенный стимул и выполняют протективную функцию, препятствуя денатурации белков и способствуя доставке уже разрушенных молекул в лизосомы [160]. Например, блокирование внутриклеточного синтеза HSP70 повышает чувствительность клеток к высоким температурам и приводит их к гибели при превышения порога в 45 [199]. В сравнении, клетки с повышенным уровнем экспрессии HSP70 обладают более высокой термоустойчивостью. Высокая стрессоустойчивость таких клеток может быть объясняться блокированием индукции апоптоза.
Место белков теплового шока в патогенезе сепсиса иллюстрируют ряд экспериментальных исследований. Сниженный уровень апоптоза клеток легочной ткани, печени и почек, наряду с низким образованием провоспалительных цитокинов характеризовал группу экспериментальных животных с сепсисом с изначально индуцированным синтезом HSP [137]. Негативное влияние HSP на образование провоспалительных цитокинов подтверждалось в других работах [213, 68]. Предварительная индукция синтеза HSP70, вызванная воздействием высокой температуры, снижала уровень смертности животных при последовательном введении летальных дох ЛПС [106]. Способность к экспрессии HPS70 при индукции ЛПС изучалась на примере больных с тяжелым сепсисом, здоровых добровольцев и пациентов в послеоперационном периоде. Для мононуклеарных клеток, полученных от больных сепсисом, была характерна высокая спонтанная экспрессия HPS70, которая усиливалась при однократном воздействии высокой температуры. ЛПС в больших дозах (10-100 ng/ml) снижал образование HSP70 у здоровых добровольцев, но индуцибильность образования HSP70 периферическими моноцитами была в значительно большей мере снижена при тяжелом сепсисе.
Дисфункция печени на фоне системной воспалительной реакции как пример экстрапульмональной патологии при тяжелой пневмонии
Образование СР происходит в процессе жизнедеятельности организма и является частью нормальной физиологии (таблица 13). К СР относятся молекулы, несущие на своей внешней орбите непарный электрон. Свободный непарный электрон в химической структуре резко повышает активность молекулы. Способность молекулы принимать (восстановление) или отдавать (окисление) электрон обуславливает ее редокс-потенциал. В основном кислородные радикалы образуется в процессе клеточного дыхания в митохондриях. При сепсисе дополнительным источником становятся активированные полиморфно-ядерные гранулоциты и мононуклеарные фагоциты, продукты метаболизма арахидоновой кислоты и активация в результате ишемическо-реперфузионных нарушений ксантин оксидазы.
Период жизни супероксида и пероксида водорода составляет не более 10 секунд. Супероксид неспособен непосредственно преодолеть мембрану митохондрий, поэтому он трансформируется в пероксид водорода. Эффекты пероксида водорода проявляются после попадания его из митохондрий в цитозоль при взаимодействии со свободными фракциями некоторых металлов и, прежде всего, с железом (Fe3+ -» Fe2+). В реакции Фентона пероксид водорода восстанавливается с образованием гидроксильного иона, наиболее реактогенного из всех СР [108].
СР принадлежит роль в защите внутренней среды от микроорганизмов и различных экзогенных факторов, в том числе аэроплоютантов. Другая биологическая функция СР - это роль мессенджеров, которая заключается в посредничестве в передаче внутриклеточого сигнала. Свободно-радикальные реакции рассматриваются как биологические стимулы, которые регулируют экспрессию многих генов и, тем самым, влияют на дифференцировку клеток и осуществляют регуляцию иммуно-воспалительной реакции при сепсисе. Однако СР запускают реакции перекисного окисления липидов, повреждающие белковые структуры и ДНК клеток не только возбудителей инфекционных заболеваний, но и организма-хозяина. СР также повышают внутриклеточное содержание кальция, приводят к высвобождению протеолитических ферментов, участвуют в образовании продуктов, тормозящих транскрипцию ДНК и формирующих хромосомные аномалии [173]. Основным барьером, ограничивающим цитотоксические реакции оксидантов, является антиоксидантная система, состоящая из ферментных и неферментных компонентов. Чрезмерное повышение активности оксидантов или ослабление защитных свойств антиоксидантов приводит к нарушению баланса и развитию оксидативного стресса. Повышенное образование свободных радикалов отмечено при множестве патологий, в том числе при различных синдромах, сопутствующих сепсису. Например, выделение пероксида водорода нейтрофилами при ишемическо-реперфузионном синдроме, высвобождение ионов железа, способствующих синтезу гидроксильных радикалов при воспалении, активация НАДФН и миелопероксидазы нейтрофилов при дыхательной недостаточности с образованием хлорамина. СР также демонстрируют способность модулировать иммунный ответ организма. Супероксид анион активирует систему комплемента, повышают концентрацию LTB4 и хемотаксис нейтрофилов. Стимуляция СР макрофагов приводит к увеличенному высвобождению интерлейкинов. Кроме того, под действием СР может изменяться профиль экспрессируемых адгезивных молекул, таких как ICAM-1, которые способствуют адгезии лейкоцитов к эндотелию. СР являются звеном в механизме регуляции экспрессии факторов транскрипции. ЛПС опосредованное образование СР приводит к активации NF-kB и АР-1, экспрессия которых регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием, а также зависит от «редокс»-потенциала клетки [212]. Редокс регуляция факторов транскрипции осуществляется через цистеиновый остаток в ДНК-связывающем домене. Антиоксиданты понижают активность NF-kB, но повышают активность АР-1, в то время как оксиданты, наоборот, активируют NF-kB, оказывая умеренное влияние на АР-1 [174]. Триггером образования СР при сепсисе могут быть цитокины, также индуцирующие экспрессию факторов транскрипции. Известно, что TNFct, являясь мощным индуктором факторов транскрипции, стимулирует синтез супероксид-аниона митохондриями, который трансформируясь в пероксид водорода, попадает в цитозоль и способен активировать NF-kB. Синтез TNFa, сопровождающийся активацией нейтрофилов и макрофагов, стимулирует эти клетки высвобождением (V за счет активации НАДФН оксидазы.
Косвенные данные, указывающие на повышение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид), были выявлены у пациентов ОИТ, соответствующих ССВО, по сравнению с больными без данного синдрома. Развитие оксидативного стресса у лиц с ССВО ассоциировалось с признаками активации лейкоцитов (миелопероксидаза, эластаза) и более тяжелым течением заболевания (APACHE III) [230]. Galley et al. обнаружили высокую активность ксантин оксидазы и СР у пациентов с сепсисом по сравнению со здоровыми добровольцами и лицами с неинфекционной патологией [125]. Повышение концентрации в плазме малонового диальдегида и активности ксантин оксидазы наряду с SOD и GPx при неонатальном сепсисе расценивалось как несостоятельность антиоксидантной защиты клеток [49].
Основным барьером, препятствующим разрушению клеток эндогенными оксидантами, является антиоксидантная защита, синергично предотвращающая образование СР (первичные антиоксиданты) и ингибирующая активность уже синтезированных СР (вторичные антиоксиданты). Выделяют ферментные и неферментные механизмы защиты, локализующиеся внутри и внеклеточно, а также существующие в мембранной форме (таблица 14). Регуляция антиоксидантной защиты осуществляется концентрацией самих оксидантов, ЛПС, TNF, IL-1, парциальным давлением кислорода крови и вдыхаемой смеси. Экспрессия многих антиоксидантов регулируется факторами транскрипции, чувствительными к окислительно-восстановительному потенциалу клетки (STAT, АР-1).
