Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. CLASS Обзор литератур CLASS ы 12
1.1. Этиологические факторы рака легкого 12
1.1.1. Химические канцерогенные соединения 16
1.1.2. Онкогенные вирусы как потенциальные инициаторы канцерогенеза 20
1.1.3. Наследственная восприимчивость к раку легкого 24
1.1.4. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска 25
1.2. Онкогенез - патогенез рака легкого 26
1.3. Основные механизмы биотрансформации ксенобиотиков 34
1.3.1. Полиморфизмы некоторых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков 43
1.3.2. Полиморфизм генов ферментов биотрансформаци ксенобиотиков и онкологические заболевания 49
1. 4. Участие цитокинов в онкогенезе 50
1.4.1. Хемокины и их рецепторы 52
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 63
2.1. Характеристика клинического материала 63
2.1.1. Характеристика обследованных больных раком легкого 65
2.1.2. Характеристика обследованных больных с хроническим бронхитом 67
2.2. Методы исследования 67
2.2.1. Метод выделения ДНК из лейкоцитов венозной крови 67
2.2.2. Анализ полиморфизма аллелей генов GSTT1, GSTM1 68
2.2.3. Определение полиморфизма гена СYP2C19 69
2.2.4. Определение полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 70
2.2.5. Статистический анализ результатов исследования 72
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 73
3.1. Полиморфизм гена CYP2C19 у больных с центральным раком легкого, пациентов с хроническим бронхитом и здоровых лиц 75
3.1.1. Полиморфизм гена CYP2C19 и клинические особенности рака легкого 77
3.1.2. Полиморфизм гена CYP2C19 у больных раком легкого с делецией гена хемокинового рецептора CCR5 78
3.1.3. Полиморфизм гена CYP2C19 у больных раком легкого в зависимости от носительства вируса Эпштейна-Барр 78
3.1.4. Полиморфизм гена CYP2C19 у больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли 79
3.1.5. Анализ полиморфных аллелей гена CYP2C19 у больных раком легкого в зависимости от курения 80
3.2. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных с центральным раком легкого, пациентов с хроническим бронхитом и здоровых лиц 81
3.2.1. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных с центральным раком легкого 84
3.2.2. Особенности полиморфизма генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных плоскоклеточным и мелкоклеточным раком легкого '. 86
3.2.3. Полиморфизм глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных раком легкого в зависимости от носительства вируса Эпштейна-Барр.90
3.2.4. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных раком легкого с делецией гена хемокинового рецептора CCR5..91
3.2.5. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению 94
3.3. Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком легкого, пациентов с диспластическими изменениями в эпителии бронхов, хроническим бронхитом и у здоровых лиц. 101
3.3.1. Генотипическая частота делеции хемокинового рецептора CCR5del32 у больных раком легкого 103
3.3.2. Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 у больных раком легкого в зависимости от носительства вируса Эпштейна- Барр 107
ГЛАВА 4. CLASS Обсуждение результато CLASS в 112
Выводы 138
Список литературы 139
- Наследственная восприимчивость к раку легкого
- Анализ полиморфизма аллелей генов GSTT1, GSTM1
- Полиморфизм гена CYP2C19 у больных раком легкого в зависимости от носительства вируса Эпштейна-Барр
- Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению
Введение к работе
Актуальность проблемы. Увеличение числа онкологических заболеваний в связи с ухудшением состояния окружающей среды вызывает огромную тревогу среди специалистов практического здравоохранения и ученых-онкологов. Среди многообразия злокачественных новообразований рак легкого привлекает к себе самое пристальное внимание ввиду его широкой распространенности, существующих трудностей своевременной диагностики, разнообразия клинических и морфологических проявлений, раннего метастазирования и недостаточной эффективности методов лечения. В России, как и в большинстве развитых стран мира, рак легкого занимает доминирующие позиции и составляет 14,7%, при этом у мужчин он определяется в 25,3%, у женщин - в 9% случаев [Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000; Jemal A. et al., 2002].
Онкологические заболевания по своей природе являются мультифакториальными, так как в их патогенез вовлекается многообразие функционально взаимосвязанных генов (генные сети), включающих наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры), второстепенные гены, так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется средовыми факторами [Баранов B.C. и соавт., 2000; Колчанов Н.А., 2000]. Особый интерес представляют гены «внешней среды», ответственные за биотрансформацию поступающих в организм чужеродных веществ (химических агентов, лекарственных средств, вирусов и др.) и определяющие реакцию организма на неблагоприятные внешние воздействия, и гены рецепторов, кодирующие структуру и функции мембранных белков, обеспечивающих внутриклеточное поступление ксенобиотиков и инфекционных агентов. В связи с тем, что эти гены кодируют белковые продукты, метаболизирующие ксенобиотики или определяющие их проникновение в клетки, они играют важную роль в процессах канцерогенеза [Кулинский В.И., 1999]. Генетические полиморфизмы этих генов в
определенных условиях могут предрасполагать, либо, напротив, препятствовать проявлению заболевания [Nebert D.W., Carvan M.J., 1997].
Помимо мутаций, возникающих в онкогенах или генах-супрессорах опухоли, которые необходимы для опухолевой трансформации, онкологическую предрасположенность могут модифицировать не только генетические повреждения, но и вариации в пределах нормы - аллельные полиморфизмы. По-видимому, особенности индивидуального генетического фона играют очень существенную, если не решающую, роль в детерминации онкологического риска. Однако генетическая конституция человека складывается из тысяч взаимодействующих полиморфных аллелей, причем каждый полиморфизм в отдельности обладает лишь весьма умеренным эффектом [Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2003]. Поэтому роль нормальных вариаций генома в патологии с трудом поддается изучению, а результаты отдельных работ отличаются плохой воспроизводимостью.
Исследования последних лет показали, что некоторые изменения функций системы биотрансформации ксенобиотиков приводят к повышенной восприимчивости организма к вредным воздействиям окружающей среды и, как следствие, к увеличению риска возникновения некоторых заболеваний, в том числе и рака легкого [Alexandrie А.-К. et al., 1994; Brockmoller J. et al., 1996; Баранов B.C. и соавт., 2000; Иващенко Т.Э. и соавт., 2001]. Работами ряда авторов [To-Figueras J. et al., 1996; Lloid D.R. et al., 2000; Wani M.A. et al., 2000; Liu G. et al., 2001] было показано, что в результате снижения функциональной активности белковых продуктов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков исчезает способность гена р53 останавливать клеточный цикл для свершения репарационных процессов, что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу.
Однако литературные данные по полиморфизму генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке легкого противоречивы в связи с популяционными особенностями и статусом других генов [Brockmoller J. et al., 1996; Garcia-Closas M. et al., 1997; Salagovic J. et al., 1998; Spitz M.R. et al.,
7 2000; Spurdle А.В. et al., 2001]. Кроме того, в литературе отсутствуют сведения о роли полиморфных генов «внешней среды» в прогрессии онкологических заболеваний.
Гены рецепторов, кодирующие структуру и функцию мембранных белков, определяющих внутриклеточное поступление ксенобиотиков и инфекционных агентов. Одним из наиболее изученных является ген хемокинового рецептора CCR5 (рецептор к ВИЧ). Лигандами этого рецептора являются хемокины RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and secreted), MIP-la,p (monocyte inflammatory protein la, p), а также MCP-2 (monocyte chemotactic protein-2), играющие важную роль в реакции иммуно-компетентных клеток как в процессе воспаления, так и при развитии опухоли [Khong J., Simon W., 1999].
В настоящее время показано двойственное влияние хемокинов на рост опухоли. С одной стороны, они регулируют активность противоопухолевых эффекторов (макрофаги, Тп-1 типа), с другой, - стимулируют пролиферацию опухолевых клеток и неоангиогенез, способствуя опухолевой прогрессии. Кроме того, недавно появились сведения о том, что хемокиновый рецептор CCR5 регулирует инициацию транскрипционной активности р53, запуская апоптоз клетки [Manes S. et al., 2003]. В частности, показано, что СС-хемокин RANTES продуцируется клетками рака молочной железы, и что на них экспресируется его рецептор CCR5 [Qin S. et al., 1998; Siveke J., 1998; Azenshtein E. et al., 2000; Manes S. et al., 2003].
Ген рецептора хемокина CCR5 характеризуется делеционным полиморфизмом. Обнаружен дефектный аллель гена CCR5 (CCR5del32 -аллель с делецией 32 пар нуклеотидов), лимфоциты гомозиготных по этому аллелю лиц не передают CCRS-опосредованный сигнал, а у гетерозигот уменьшается экспрессия рецепторов [Lukacs N.W., 1999]. В общей популяции около 10% лиц имеют такую делению.
Таким образом, учитывая наличие противоречивой информации о связи полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с
8 риском развития рака легкого и отсутствие сведений о полиморфизме гена хемокинового рецептора CCR5 при раке легкого, а также при прогрессировании злокачественного роста, целесообразно оценить вклад сочетаний полиморфных вариантов этих генов в предрасположенность к раку легкого, а также установить взаимосвязь исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями данного заболевания.
Цель исследования: оценить роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, CYP2C19) и гена хемокинового рецептора CCR5 в патогенезе центрального рака легкого.
Предпринятое исследование было сосредоточено на решении следующих основных задач;
Оценить соотношение нормальных (+/+ и 0/+) и патологических (0/0) генотипов генов глутатион-8-трансфераз ТІ и Ml (GSTT1 и GSTM1) у больных с центральным раком легкого.
Провести сравнительный анализ распространения патологических генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у больных с центральным раком легкого и пациентов с хроническим бронхитом.
Изучить полиморфизм гена семейства ферментов цитохрома Р-450 типа CYP2C19 у больных с центральным раком легкого.
Выявить генетическую частоту делеции гена хемокинового рецептора CCR5 у больных с центральным раком легкого и пациентов с хроническим бронхитом.
Установить взаимосвязь генов GSTM1, GSTT1, CYP2C19, CCR5 с клинико-морфологическими особенностями центрального рака легкого.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков глутатион-8-трансфераз ТІ и МІ у больных с центральным раком легкого. Показано, что функционально неполноценные генотипы GSTT1 и Ml чаще регистрируются среди больных
9 центральным раком легкого, чем в популяционном контроле. При мелкоклеточной форме рака легкого отмечается более высокая частота патологических генотипов GSTT1 и МІ по сравнению с плоскоклеточным раком легкого. Впервые обнаружено значительное увеличение генетической частоты генов GSTT1 и МІ у больных с местно-распространенным онкологическим процессом по сравнению с пациентами с локализованным ростом опухоли.
Впервые обосновано, что частота патологического аллеля гена CYP2C19 у больных с центральным раком легкого превышает таковую у здоровых индивидуумов. При этом при мелкоклеточной форме опухоли распространенность патологического аллеля гена CYP2C19 выше, чем при плоскоклеточном типе опухолевого роста. Для больных с центральным раком легкого с метастазами характерно более высокое (чем у пациентов без метастазов) распространение аллеля CYP2C19*2, кодирующего функционально неполноценный фермент.
Впервые проведено исследование полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 у больных с центральным раком легкого. Установлено, что генетическая частота. делеционного аллеля CCR5del32 у больных, с центральным раком легкого превышает таковую в популяционном контроле. Частота патологического аллеля гена CCR5 у больных с мелкоклеточной и плоскоклеточной формами рака легкого практически одинакова. Обосновано также, что у больных с местно-распространенным опухолевым процессом частота патологического аллеля гена CCR5 значительно превышает соответствующий показатель у пациентов с локализованной формой опухоли.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена хемокинового рецептора CCR5 при злокачественных процессах в легких, могут служить основой для дальнейшего изучения механизмов канцерогенеза и прогрессирования
10 опухолевого процесса. На основании полученных данных обоснована роль полиморфизма генов хемокинового рецептора CCR5, GSTT1 и GSTM1 в развитии пренеоплазии и злокачественных опухолей легких, что дает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения заболевания, выживаемости больных раком легкого и созданию принципиально новых направлений патогенетически обоснованной терапии злокачественных новообразований легкого.
Основные положения, выносимые на защиту:
Частота патологических генотипов GSTT1, GSTM1, CYP2C19 при центральном раке легкого выше, чем при хроническом бронхите и особенно выражена при мелкоклеточной форме опухоли, что свидетельствует о важной роли генов глутатион-8-трансфераз ТІ и Ml, цитохрома Р-450 типа CYP2C19 в патогенезе рака легкого.
Частота делеционного варианта гена хемокинового рецептора CCR5 при центральном раке легкого более выражена, чем при хроническом бронхите, что может свидетельствовать о вовлечении CCR5 в патогенез опухоли данной локализации.
При местно-распространенном злокачественном процессе выявляется более высокая частота функционально неполноценных генов GSTT1, GSTM1, CYP2C19 и CCR5, чем при локализованном росте опухоли, что указывает на их участие в механизмах метастазирования рака легкого.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IV Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (г. Москва, 2003); на научно-практической конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» (г. Киев, Украина, 2003);
на 13th ERS Annual Congress (Vienna, Austria, 2003); на научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии» (г. Томск, 2003); на 21-ой сессии общего собрания Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск, 2003); на VI-й конференции молодых онкологов Украины «Основные проблемы экспериментальной и клинической онкологии», посвященной 75-летию со дня рождения выдающегося онколога-патофизиолога З.А. Бутенко (г. Киев, 2003); на четвертом конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2003); на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (г. Новосибирск, 2004); на конкурсе молодых ученых СО РАМН, посвященном 50-летию установления структуры ДНК «Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики» (г. Новосибирск, 2004) и на научных семинарах кафедры патологической физиологии ГОУВПО «СибГМУ» (г. Томск, 2003-2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 31 таблицей. Библиографический указатель включает 328 источников, из них 105 отечественных и 223 зарубежных.
Наследственная восприимчивость к раку легкого
Хотя причиной большинства случаев рака легкого является курение сигарет, имеется также значительное эпидемиологическое свидетельство о случаях семейного рака легкого [Харченко В.П., Кузьмин И.В., 1994; Sekido Y. et al., 1998]. Эти исследования уточняют воздействие курения, возраста, пола и рода занятий, и приводят к выводу об увеличении семейного риска (в 2,5 раза) рака легкого среди родственников пробандов, имеющих этот диагноз. Существует более высокий риск (в 6 раз) развития РЛ среди некурящих родственников и потомков (относительный риск - 7,2) младше 40-59 лет в случаях курения и других факторов. Сегрегационный анализ формально показал, что восприимчивость к РЛ может быть унаследована менделевским способом. Современная модель предсказывает менделевское кодоминантное наследование редкого главного аутосомного гена, который действует совместно с курением сигарет, обусловливая более ранний возраст начала РЛ. Этот же ген может также давать наследственную восприимчивость к другим ракам, таким как рак головы и шеи, поджелудочной железы, мочевого пузыря, почки, шейки матки после начала курения [Sekido Y. et al., 1998].
Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска Онкологическую предрасположенность могут модифицировать не только генетические повреждения, но и вариации в пределах нормы -аллельные полиморфизмы. Особенности индивидуального генетического фона играют очень существенную, если не решающую, роль в детерминации онкологического риска. Однако генетическая конституция человека складывается из тысяч взаимодействующих полиморфных аллелей, причем каждый полиморфизм в отдельности обладает лишь весьма умеренным эффектом. (Поэтому роль нормальных вариаций генома в патологии с трудом поддается изучению, а результаты отдельных исследований отличаются плохой воспроизводимостью). На сегодняшний день идентифицированы десятки полиморфных генов-кандидатов, которые могут принимать участие в формировании онкологического риска. К ним относятся представители семейств цитохромов, глутатионтрансфераз, ацетилтрансфераз, некоторые онкогены и антионкогены, участники гормонального метаболизма, репарации ДНК, апоптоза, ангиогенеза и т.д. К наиболее достоверным наблюдениям можно отнести ассоциацию «нулевого» генотипа GSTM1 с риском развития рака легких, длиной тринуклеотидного повтора рецептора андрогенов (AR) и риском развития рака простаты, увеличенную представленность аллельного варианта гена СНЕК-2 у больных раком молочной железы и т.д. [Nazar-Stewart V. et al., 1993; Caporaso N., Goldstein A., 1997; Ryberg D. et al., 1997; Sekido Y. et al., 1998; Belogubova E.V. et al., 2000; Имянитов E.H., Хансон К.П., 2003].
Значение всех этих факторов резко увеличивается, если принять во внимание возможность их совместного действия, тем более что не существует минимальных доз, ниже которых может быть исключено их канцерогенное действие [Наста М. и соавт., 1963).
Рак - пример сложной мультифакториальной генетической болезни. В развитие опухоли вовлекается огромное разнообразие генов. Происходит разрегулирование множества клеточных функций, включая механизмы контроля клеточной пролиферации, репарации ДІЖ, стабильности хромосом, межклеточных взаимодействий, взаимодействий клетки с матриксом, ангиогенеза, т.е. образования кровеносных сосудов, клеточного старения (senescence), апоптоза и т.д. [Имянитов Е.Н. и соавт., 1993].
Трансформация нормальной клетки в опухолевую протекает по классической схеме канцерогенеза: инициация, промоция и прогрессия.
Гены, вовлеченные в опухолеобразование, могут действовать на опухолевую прогрессию, либо меняя структуру кодируемого продукта вследствие мутаций, либо вследствие изменений в их экспрессии в ответ на какие-либо события в клетке. В результате может облегчаться инициация прогрессии опухоли, как это происходит при активации протоонкогенов, или может сниматься ингибирование этой прогрессии, как при инактивации генов-супрессоров опухолей [Агеенко А.И., 1986; Аничков Н.М., 1988; Yiraku Y., Kawanishi S., 1996; Свердлов Е.Д., 1999]. То, что не только мутации, меняющие структуру продуктов протоонкогенов, но и изменение уровня их экспрессии может приводить к стимуляции опухоли, легко видеть на примере стимуляции опухолевой трансформации при внедрении рядом с протоонкогенами ретровирусов, не содержащих онкогенов. При этом ретровирус меняет экспрессию протоонкогенов, но не их структуру. При опухолеобразовании часто наблюдается амплификация области хромосом, содержащих протоонкогены. Это также приводит к увеличению количества синтезированных продуктов, а не к изменению их структур [Быкорез А.И., Рубенчик Б.Л, 1987; Свердлов Е.Д., 1999; Fong К.М. et al., 1999].
В развитие злокачественной опухоли вовлекается значительно большее число генов, чем количество генов, реально получивших мутации. В настоящее время часто высказывается мнение, что на самом деле «раковым» геном следует считать любой ген, изменение структуры или экспрессии которого вовлекается в качестве необходимого элемента опухолеобразования. Например, раковые гены, такие как myc, p53,WTl, кодируют транскрипционные факторы, которые в свою очередь регулируют экспрессию множества других генов [Киселев Ф.Л. и соавт., 1990; Имянитов Е.Н. и соавт., 1997; Горькавцева Р.Ф., Горькавцев И.В., 1999; Rom W.N. et al., 2000]. Ясно, что изменение в уровне их экспрессии может вызывать целый каскад событий, среди которых могут оказаться и такие, которые приведут к опухолевому изменению фенотипа клетки. Среди таких событий могут оказаться и изменения, вызывающие дестабилизацию генома клетки. Возможно, это необходимый момент опухолевой трансформации, поскольку для быстрого прогресса опухоли нужно несколько мутационных событий [Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 1998]. В нормальной клетке мутации возникают с незначительной скоростью. Чтобы эту скорость повысить, и нужны изменения, приводящие к дестабилизации генома. Пути для этого могут быть разными, но стадия дестабилизация генома является, возможно, универсальным событием на пути к опухоли [Свердлов Е.Д., 1999].
Анализ полиморфизма аллелей генов GSTT1, GSTM1
Образцы ДНК были протипированы по полиморфизму двух генов биотрансформации: GSTT1 и GSTM1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 01 и п.1). Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной ПЦР с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER, (F: 5 -caa-gtccc-cct-caccc-cc; R: 5 -gtg-cga-gtg-gct-caggt-gt) и генов GSTT1 (F: 5 -ggt-catct-gaa-ggc-caa-gg; R: 5 tt-gtg-gacgcga-gga-cg), и GSTM1 (F: 5 gctc-acggtat-gga-ggtc; R: 5 -gtt-ggg-ctc-aaaat-acg-gtg-g) [Spurdle A.B. et al., 2001]. Смесь для амплификации объемом 12 мкл содержала 100-200 нг ДНК, 2,5 нМ каждого праймера, 1 мМ смесь четырех dNTP, 1 мМ MgCl2, 0,5 ед./акт. Гад-ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск) и Юхбуфер, поставляемый производителем вместе с ферментом. Программа амплификации включала 5 мин предварительной денатурации при 94С, 4 цикла амплификации: 94С - 20 с, 65С - 25 с, 72С -20 с; 4 цикла: 94С - 20 с, 63С - 25 с, 72С - 20 с; 25 циклов: 94С - 20 с, 61С - 25 с, 72С - 20 с. Программу завершала элонгация при 72С в течение 3 мин.
Продукты амплификации фракционировали в 3%-ном агарозном геле с бромистым этидием в течение 30 мин при напряжении 130 В и визуализировали в УФ-свете.
Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов размером 131 и 114 п.н. соответственно (рис. 1). Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии по крайней мере одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, +/+ и +/0). Участок гена ER размером 183 п.н. использовали в качестве внутреннего контроля амплификации. 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTT1 и GSTM1.
ER - контроль амплификации (183 п.н.); 1 - генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5, 7-GSTT1 +GSTM1 +(131 и 114 п.н. соответственно); 3,4,6 - GSTT1 0/0 GSTM1 +; 8 - GSTT1 + GSTM1 0/0.
Для гена CYP2C19 определяли полиморфизм, связанный с наличием в пятом экзоне гена «дикого типа» или «мутантного» аллелей, характеризующихся соответственно наличием или отсутствием сайта рестрикции для Sma I [de Morals S.M.F. et al., 1994]. По современной номенклатуре эти аллели обозначаются соответственно CYP2C19 1 и CYP2C19 2. Для генотипирования индивидов по этому полиморфизму использовали следующие праймеры: F: 5 -aatac-aac-cag-agctg-gc и R: 5 at-cactt-ccaaa-aag-caa-g. Состав остальных компонентов смеси для амплификации был аналогичен используемым для типирования полиморфизмов генов GST. Программа амплификации включала 5 мин предварительной денатурации при 94С, тридцать три цикла: 94С - 40 с, 60С - 1 мин, 72С - 40 с и финальную элонгацию при 72С в течение 5 мин. Размер продукта амплификата составляет 169 п.н. После амплификации образцы гидролизовали в течение ночи рестриктазой Sma I («Сибэнзим», Новосибирск) при 37С. Эта температура отличается от рекомендованной производителем (25С), так как при этом повышается эффективность рестрикции.
Продукты рестрикции фракционировали в 3%-ном агарозном геле с бромистым этидием в течение 30 мин при напряжении 130 В и визуализировали в УФ-свете. Гомозиготность по аллелю CYP2C19 1 определяли по наличию двух бэндов в 120 и 49 п.н., гомозиготность по альтернативному аллелю — по наличию одного бэнда в 169 п.н., гетерозиготы имели все три бэнда.
ДНК анализировали на наличие делеции гена хемокиного рецептора CCR5 (CCR5del32), используя аллель-специфичную полимеразную цепную реакцию. Амплифицировали фрагмент размером 276 п.н., несущий потенциальную делецию в 32 п.н.1 [Юдин Н.С. и соавт., 1998]. Применяли праймеры CCR5F: 5 -GAA-GGT-CTT-CATAC-ACCG и CCR5R: 5 - данный раздел исследования был выполнен в ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Колъцово, Новосибирская обл. AGA-ATT-CCT-GGA-AGGGTC из генетического банка, каталожный номер U54994. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 200 нг геномной ДНК, 5 Нм каждого праймера, 0,2 мМ каждого dNTP, 1,8 мМ MgCb, 1 ед/акт Tag-ДНК-полимеразы («Литех», Москва, Россия), буфер: 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 10 мМ меркаптоэтанола, 0,01 М Tween-20.
Для амплификации фрагментов гена CCR5 использовали следующие условия ГШР: после денатурации проводили 30 циклов амплификации в режиме: 94С - 50 с, 53С - 70 с, 72С - 2,5 мин. После амплификации продукты реакции анализировали в 4-8% полиакрилкамидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете. Наличие при амплификации только продукта размером 276 п.н интерпретировалось как гомозиготное состояние по нормальному аллелю (генотип CCR5/CCR5), наличие только продукта размером 244 п.н - как гомозиготное состояние по делеции CCR5del32 (генотип CCR5del32/CCR5del32), наличие фрагментов 276 и 244 п.н - как гетерозиготное (генотип CCR5/CCR5del32) (рис. 2).
При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез [ЛакинГ.Ф., 1980].
Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова).
При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р 0,05 [Лакин Г.Ф., 1989].
Полиморфизм гена CYP2C19 у больных раком легкого в зависимости от носительства вируса Эпштейна-Барр
Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей гена CYP2C19 у вирус-позитивных и вирус-негативных больных раком легкого позволил установить (табл. 6), что у ВЭБ-позитивных больных раком легкого распределение частот генотипов гена CYP2C19 статистически значимо отличалось от соответствующих показателей у ВЭБ-негативных пациентов (р=0,038). Патологический аллель CYP2C19 2 у ВЭБ-позитивных и у ВЭБ-негативных больных РЛ отмечался в 34,1% и 23,5% соответственно, при этом различия сравниваемых показателей оказались статистически значимыми (р=0,040).
Для выявления особенностей распределения генотипов и частоты аллелей CYP2C19 у больных с различными гистологическими типами опухоли всех обследованных пациентов разделили на группы: первую группу составили больные мелкоклеточной формой рака легкого (п=31), вторую больные, имевшие плоскоклеточный вариант опухоли (п=150) (табл. 7).
У пациентов с мелкоклеточным раком легкого были выявлены статистически значимые различия в распределении генотипов CYP2C19 по сравнению со здоровыми донорами (р 0,05), кроме того, у данных больных частота патологического аллеля CYP2C19 2 в 2 раза превышала таковую у здоровых (37 и 17,5% соответственно при р 0,05). У больных с плоскоклеточным раком легкого в распределении генотипов была обнаружена лишь тенденция к достоверности по сравнению с контрольными значениями (р=0,07). Аналогичная тенденция оказалась хаоактерной и для результатов сравнительного анализа частоты патологического аллеля CYP2C19 2 у больных данной группы и у здоровых лиц (25,3 и 17,5% соответственно, р=0,051). Распределение генотипов в выборке больных мелкоклеточным раком легкого (МРЛ) не имело статистически значимых отличий (р=0,075) от такового в выборке больных плоскоклеточным раком легкого (ПРЛ). Частота аллелей гена CYP2C19 у больных МРЛ также статистически не отличались от таковой у больных ПРЛ (р=0,083).
При сравнении генотипов и частот аллелей гена CYP2C19 в группах больных с плоскоклеточным низкодифференцированным и умереннодифференцированным раком легкого достоверных отличий не обнаруживалось (р=0,573 и р=0,425 соответственно).
Для анализа частоты аллелей и генотипов исследованных генов в выборке курящих больных раком легкого (п=144) в качестве группы сравнения использовали выборку некурящих пациентов с диагнозом рак легкого (п=37). В выборке курящих больных раком легкого было 9 женщин и 135 мужчин, в выборке некурящих пациентов с РЛ — 8 женщин и 29 мужчин. Результаты анализа генотипов и аллельных вариантов гена CYP2C19, кодирующего фермент 1 фазы биотрансформации ксенобиотиков, у онкологических больных и обследованных лиц контрольной группы представлены в табл. 8. При анализе полиморфизма гена CYP2C19 статистически значимых различий в распределении генотипов между выборками курящих и некурящих больных раком легкого не обнаруживалось (р=0,075). Частота аллелей гена CYP2C19 у курящих больных раком легкого статистически достоверно не отличалась от таковой у некурящих пациентов (р=0,093).
Для анализа частоты аллелей и генотипов исследованных генов у больных с центральным раком легкого в группы сравнения вошли пациенты с хроническим бронхитом, а также здоровые жители г. Томска (п=100). Результаты анализа аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты 2 фазы биотрансформации, у онкологических больных и в контрольных группах обследованных представлены в табл. 9.
Частота носителей нулевого аллеля (0/0) гена GSTT1 в контрольной группе обследованных оказалась несколько ниже популяционной (23,3%) [Иващенко Т.Э. и соавт., 2003] и составляла 15%. В исследованных выборках наибольшая частота нулевого генотипа гена GSTT1 была отмечена у больных раком легкого, при этом различия между сравниваемыми показателями у онкологических больных и здоровых лиц оказались статистически значимыми (х =34,51; р=0,0001). Различия между анализируемыми критериями в выборках пациентов с хроническим бронхитом без диспластических изменений в эпителии бронхов и у здоровых доноров
9 оказались статистически не значимы (% =1,54; р=0,215). У больных с ХБ, имевших диспластические изменения в бронхиальном эпителии, было зарегистрировано повышение частоты нулевого генотипа GSTT1 в 2 раза по сравнению с таковой у здоровых лиц (х2=4,69; р=0,030).
Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз Ml и ТІ у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению
Для сравнительного анализа частоты генотипов исследованных генов ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков глутатион-S-трансфераз Ml И ТІ у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению были использованы группа курящих больных раком лёгкого (п=144) и группа некурящих больных раком лёгкого (п=37). В выборке курящих больных раком легкого было 9 женщин и 135 мужчин, в выборке некурящих пациентов с РЛ - 8 женщин и 29 мужчин. Результаты анализа аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты 2 фазы детоксикации, в сравниваемых группах больных РЛ представлены в табл. 18.
У курящих больных РЛ 0/0-генотип гена GSTT1 был выявлен у 83 пациентов из 144, среди некурящих он отмечался в 10 случаях из 37. Частота гомозигот по нулевому аллелю (0/0) гена GSTT1 в группе курящих больных РЛ оказалась значительно выше, чем у некурящих пациентов - 57,6 и 27% соответственно при р=0,0008. При этом следует отметить, что для курящих лиц с О/0-генотипом GSTT1 риск развития рака легкого увеличивается в 3,67 раза (СІ95% 1,56-8,83) по сравнению с некурящими, имеющими данный генотип GSTT1.
Частота гомозигот по нулевому аллелю гена глутатион-Б-трансферазы Ml у обследованных нами курящих больных раком легкого (69,4%) несколько превышала таковую у больных РЛ Новосибирской области (54,6%) [Ляхович В.В. и соавт., 1997]. У курящих больных раком легкого частота 0/0-генотипа GSTM1 статистически значимо отличалась от таковой у некурящих и составляла 69,4 и 21,6% соответственно при р=0,0001. Для курящих лиц, имевших 0/0-генотип GSTM1, по сравнению с некурящими, риск развития рака лёгкого возрастает в 8,24 раза (СІ95% 3,27-21,41).
Нами была проведена также оценка связи частот нулевых генотипов исследованных генов у курящих и некурящих больных раком легкого с такими клиническими особенностями заболевания как наличие очагов регионарного метастазирования, исход заболевания. Особый интерес, на наш взгляд, представляют результаты определения частоты нулевых генотипов (0/0) генов GSTT1 и GSTM1 среди курящих и некурящих больных раком легкого, имевших метастазы в регионарные лимфатические узлы (табл. 19). Оказалось, что у курящих больных раком легкого с метастазами частота 0/0-генотипа GSTT1 была несколько выше таковой у некурящих больных, но статистически значимых различий в распределении генотипов GSTT1 в анализируемых группах обследованных лиц выявлено не было (р=0,053). Следует отметить, что для 0/0-генотипа гена GSTM1 было установлено более чем 2-кратное увеличение частоты данного генотипа у курящих больных РЛ, имевших метастазы, при сравнении с аналогичными показателями у некурящих больных с наличием очагов регионарного метастазирования (74,4 и 31,3% соответственно при р=0,0007). Риск возникновения метастазов в регионарных лимфоузлах при сочетании у пациентов таких признаков как курение и наличие в геноме гомозиготной делении гена GSTM1 составил 6,39 (С195% 1,77-24,30) по сравнению с некурящими носителями данной делеции. Распределение генотипов GSTT1 у курящих и некурящих больных РЛ с неблагоприятным исходом заболевания отличалось незначительно (р=0,101)(табл.20). При оценке полиморфизма GSTM1 между сравниваемыми выборками обследованных лиц увеличение частоты нулевого генотипа у курящих пациентов с неблагоприятным исходом заболевания было выражено в значительно большей степени нежели у некурящих (86,2 и 37,5% соответственно при р=0,001). При этом риск неблагоприятного исхода заболевания для курящих больных РЛ, несущих 0/0-генотип гена GSTM1, оказался в 10,42 раза (СІ95% 1,68-71,62) выше, чем для некурящих больных РЛ. В связи с тем, что при статистической обработке данных было выявлено значительное увеличение частоты нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у больных РЛ, имевших делецию хемокинового рецептора CCR5, на наш взгляд представлялось, целесообразным выявить распределение генотипов генов ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 в группах больных РЛ с делецией гена CCR5 в зависимости от курения (табл. 21). Частота гомозигот по нулевому аллелю гена глутатион-8-трансферазы ТІ у курящих больных раком легкого с делецией гена CCR5 (CCR5/del32) статистически не отличалась от таковой у некурящих пациентов (р=0,67). Среди больных РЛ с делецией гена CCR5 оказалось 63 курящих и 6 некурящих, при этом в группе курящих 0/0-генотип GSTM1 встречался у 52, в группе некурящих — у 2 пациентов, что составляло 82,5 и 33,3% соответственно. Таким образом, частота гомозигот по нулевому аллелю гена глутатион-Б-трансферазы МІ у курящих больных раком легкого с делецией гена CCR5 достоверно превышала таковую у некурящих пациентов (% =7,80; р=0,005). Риск развития заболевания у курящих больных РЛ, имевших делению гена хемокинового рецептора CCR5 и при этом 0/0-генотип GSTM1, увеличивается в 9,45 раза (СІ95% 1,24-87,12) по сравнению с некурящими носителями делеции CCR5.
