Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Общие закономерности канцерогенеза 12
1.2. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска 14
1.2.1. Полиморфизмы некоторых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков 15
1.2.2. Основные механизмы биотрансформации ксенобиотиков 20
1.2.3. Полиморфизм глутатион-Б-трансфераз в патогенезе онкологических заболеваний 29
1.3. Роль метилирования ДНК в канцерогенезе 31
1.4. Генетика рака легкого 33
1.4.1. Генетические основы предрасположенности к раку легкого 35
1.5. Гормональный канцерогенез и рак предстательной железы 36
1.5.1. Молекулярный патогенез рака предстательной железы 37
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Характеристика клинического материала 41
2.1.1. Характеристика обследованных больных раком легкого 43
2.1.3. Характеристика больных раком предстательной железы 44
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Метод выделения ДНК из лейкоцитов венозной крови и опухолевого материала. 45
2.2.2. Бисульфитная модификация ДНК. 46
2.2.3. Анализ полиморфизма аллелей генов GSTT1, GSTM1 48
2.2.4. Определение полиморфизма reHaGSTPl 49
2.2.5. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция гена GSTP1 50
2.2.6. Статистический анализ результатов исследования 51
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 53
3.1 Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml, PI у больных раком легкого и здоровых доноров 53
3.1.1 Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml, PI у больных раком легкого в зависимости от распространенности злокачественного процесса 57
3.1.2. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI у больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли 58
3.1.3. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI у больных раком легкого в зависимости от стадии злокачественного процесса 61
3.1.4. Комбинации полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого. 63
3.1.5. Сочетания полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого в зависимости от клинико-морфологических особенностей опухоли 66
3.1.6. Метилирование промотора гена GSTP1 в опухолях легкого. 70
3.1.7. Анализ сочетаний делеционных вариантов генов глутатион-8-трансфераз и метилирования гена GSTP1 в опухолях легкого 71
3.2. Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз у больных раком предстательной железы и здоровых доноров 73
3.2.1.Анализ полиморфных вариантов генов GSTT1, Ml и PI у больных раком предстательной железы в зависимости от прогностических параметров распространенности опухоли 75
3.2.2. Комбинации полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком предстательной железы 78
3.2.3. Сочетания полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком предстательной железы в зависимости от стадии злокачественного процесса 80
3.3. Сравнительный анализ полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1 и их комбинаций у больных раком легкого и раком предстательной железы, как примера гормоннезависимых и гормонзависимых опухолей. 82
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 86
Выводы 100
Список литературы 101
- Полиморфизмы некоторых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков
- Молекулярный патогенез рака предстательной железы
- Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml, PI у больных раком легкого и здоровых доноров
- Комбинации полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого.
Введение к работе
В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. К причинам этого можно отнести неблагоприятную экологическую обстановку, образ жизни и генетические факторы. Факт, что рак является генетическим заболеванием уже не вызывает сомнений, а количество генов прямо или косвенно вовлеченных в канцерогенез неуклонно возрастает.
Одно из важнейших достижений в области онкологии - открытие нестабильности ДНК. Рак называют болезнью генетической нестабильности. ДНК - не статичная, а высокодинамичная структура. Ее нестабильность является основой эволюции, нормального индивидуального развития и одновременно - злокачественной трансформации [Coleman W.B., Tsongalis G.J., 1995, Kirsch I.R., Lista F., 1996, Wells R.D., 1996, Wells R.D. et al., 2005]. Без нестабильности генома практически невозможно возникновение в одной клетке достаточного числа мутаций в ключевых генах, ответственных за контроль над клеточным циклом, апоптозом, ангиогенезом, адгезией, трансмембранными сигналами, репарацией ДНК, определяющих злокачественный характер роста солидных опухолей. Создавая гетерогенность клеточных популяций, генетическая нестабильность постоянно предоставляет материал для отбора все более и более автономных и агрессивных клеток [Новик А.А., Комилова В.А., 2001, Копнин Б.П., 2002, Тимошевский В.А., Назаренко С.А., 2006, Wells R.D., 1996, Vanasse G.J., Concannon P., Willerford D.M. 1999, Wells R.D. et al, 2005].
У каждого организма имеется свой собственный видовой и индивидуальный уровень общей и тканевой генетической нестабильности и, соответственно, - наследственной предрасположенности к раку, который, в свою очередь, не является константным, а изменяется с возрастом и под влиянием среды. Многими исследователями было показано [Засухина Г.Д., 2005], что в мутационном процессе, как и в других физиологических процессах, можно экспериментально определить ключевые моменты,
7 определяющие индивидуальную реакцию генома данного организма на внешние воздействия. К таким ключевым моментам относятся различия между людьми по особенностям метаболизма генотоксикантов, оксидантному и гормональному статусу, эффективности систем репарации ДНК. Все они генетически детерменированы, поэтому систему оценки нестабильности генома человека можно расширять практически бесконечно. Свой вклад в формирование первичной генетической нестабильности могут вносить эпигенетические модификации генома [Залетаев Д.В. и др., 2002, С.А.Назаренко, 2004] и индивидуальные вариации ферментных систем [Ревазова Ю.А. и др., 2006].
В данном исселедовании сделана попытка объединить две позиции в изучении нестабильности генома человека — нарушение статуса метилирования и генетический полиморфизм системы детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-Б-трансферазы. При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии - рак легкого и рак предстательной железы.
Противоречивость данных литературы по полиморфизму генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при раке легкого, раке простаты и отсутствие информации о влиянии комбинаций генотипов глутатион-8-трансфераз, о совокупном анализе всех способов инактивации данных генов при злокачественных новообразованиях делает целесообразным, на наш взгляд, проведение исследования по оценке вклада сочетаний полиморфных вариантов этих генов в предрасположенность к раку легкого и предстательной железы. Не менее актуальным представляется установление взаимосвязи повреждения исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями онкозаболеваний, а так же проведение
8 сравнительного анализа вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз и их комбинаций при раке легкого и предстательной железы. Цель исследования: установить роль инактивации генов глутатион-S-трансфераз ТІ, Ml и PI в патогенезе рака легкого и предстательной железы. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Выявить роль делеционных (0/0, АГ/ГТ) и нормальных (+/+ , 0/+, АА) вариантов генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) и их комбинаций в патогенезе рака легкого и предстательной железы.
Установить взаимосвязь функционально неполноценных генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI с клинико-морфологическими особенностями опухолей легких.
Определить соотношение делеционных и полноценных вариантов генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml, PI и их комбинаций в зависимости от прогностических критериев рака легкого и предстательной железы.
Провести сравнительный анализ индивидуальных эффектов и комбинаций полиморфных вариантов генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI при раке легкого.и предстательной железы.
Выявить комбинации полиморфных вариантов генов глутатион-S-трансфераз ТІ, Ml, PI специфичные для рака легкого и предстательной железы.
Определить инактивированные (делецией и метилированием) варианты генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI в опухолевых клетках легкого и установить роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 в развитии рака легкого.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное молекулярно-биологическое исследование суммарного вклада инактивированных вариантов генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI в развитие рака легкого.
Получены новые данные, касающиеся профиля поражения генов глутатион-8-трансфераз в опухолях легкого, учитывающие все возможные способы инактивации генов. данного семейства. Выявлена роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 и его сочетаний с полиморфными вариантами генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 в патогенезе рака легкого.
Впервые установлена ассоциация клинико-морфологических особенностей злокачественных опухолей легкого и предстательной железы и делеционных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз ТІ, Ml, PL
Впервые представлены данные исследования вариантных генотипов глутатион-8-трансфераз и их комбинаций у больных раком предстательной железы. Показано, что делеционные варианты генов этого семейства могут служить прогностическим критерием развития рака предстательной железы.
Получены новые данные сравнительного анализа по участию глутатион-S-трансфераз в патогенезе рака легкого и предстательной железы. Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI и их комбинаций при злокачественных процессах в легких и в предстательной железе. На основании полученных данных обоснована роль полиморфизма генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 и их комбинаций в развитии злокачественных опухолей легких и простаты, что дает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к профилактике и ранней диагностики онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачествнных опухолей. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI
играют важную роль в патогенезе рака легкого, рака предстательной
10 железы, поскольку доля инактивированных генов у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых лиц.
Делеционные варианты генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI участвуют в формировании повышенного риска возникновения рака легкого и предстательной железы.
Инактивированные варианты генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml и PI ассоциированы с клинико-морфологическими особенностями опухолей легкого и предстательной железы и участвуют в формировании неблагоприятного прогноза данных заболеваний.
Исходя из постулата - суммарный эффект генотипа превосходит сумму эффектов отдельных генотипов, выявлены протекторные (защитные) комбинации, интактные (не влияющие на развитие онкологических заболеваний данных локализаций) и неблагоприятные (способствующие развитию рака легкого и рака предстательной железы).
Ген GSTP1 в опухолях легкого инактивируется делецией и метилированием, что увеличивает частоту поражений генов семейства глутатион-8-трансфераз в опухолях легкого.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (г. Новосибирск, 2004); на конкурсе молодых ученых СО РАМН, посвященном 50-летию установления структуры ДНК «Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики» (г. Новосибирск, 2004); на конгрессах Российского общества онкологов (г.Баку и г.Москва, 2005-2006); на I конгрессе Российского общества онкоурологов (г.Москва, 2006); на региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г.Томск, 2006); на 5 региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» (г.Томск, 2006); на российской научно-практической
конференции «Современные методы лечения онкологических больных» (Барнаул, 2006) и на научных семинарах кафедры патологической физиологии ГОУВПО «СибГМУ» (г. Томск, 2004-2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале из «Перечня...» ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает 161 источник, из них 58 отечественных и 103 зарубежных.
Полиморфизмы некоторых генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков
В организме человека существуют специализированные ферментные системы, катализирующие биохимические превращения чужеродных соединений. В результате этих превращений изменяется как биологическая активность, так и скорость выведения ксенобиотиков из организма [Gilman A.G. et al., 1990]. Гены этих ферментов экспрессируются в печени, почках, легком, плаценте, мозге, кишечнике. Стадии метаболизма чужеродных веществ принято разделять на Фазу 1 (модификация молекулы в ходе реакций окисления, восстановления или гидролиза) и Фазу 2 (конъюгация с гидрофильным остатком) [Gilman A.G. et al., 1990; Крынецкий Е.Ю., 1996]. Активность ферментов каждой из этих фаз, принимающих участие в катализе данных биохимических превращений, определяет реакцию организма на неблагоприятные внешние воздействия. В отличие от ферментов, катализирующих биохимические превращения эндогенных субстратов, для ферментов биотрансформации ксенобиотиков характерна высокая степень полиморфизма [Gonzales F.G., 1993, Vineis P., 2002] (существование в популяции двух и более аллелей в локусе, каждый из которых встречается с частотой более 1%). Таким образом, полиморфизм можно определить как моногенный признак, вызванный присутствием более чем одного аллеля (частота наиболее редкого аллеля более 1%) и существованием более чем одного фенотипа, определяющего реакцию организма на воздействие ксенобиотиков.
Полиморфизм наблюдается среди целого ряда ферментов, метаболизирующих ксенобиотики. Среди ферментов первой фазы это холинэстеразы, арилэстеразы, альдегиддегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, флавинсодержащие монооксигеназы, изоформы цитохрома Р-450 - система микросомальных монооксигеназ. Цитохромы Р-450 - это одно из наиболее изученных семейств ферментов метаболизма многочисленных эндо- и экзогенных молекул, в том числе стероидов, биогенных аминов, феромонов, растительных метаболитов, лекарств и химических канцерогенов [Gonzales F.G., Nebert D.W., 1990]. Среди ферментов второй фазы - уридиндифосфатглюкуронилтрансферазы, сульфотрансферазы, N-ацетилтрансферазы, глутатион-8-трансферазы, N-акрилтрансферазы, N-, О-, S-метилтрансферазы [Timbrell J.A., 1988]. Существуют значительные этнические различия по полиморфизму ферментов биотрансформации ксенобиотиков [Попова С.Н. и соавт., 2002]. Наиболее демостративным примером этого является отсутствие альдегиддегидрогеназы-2 у 30% населения Азии и 100% присутствие активной формы фермента у европейских народов. Другим примером является отсутствие алкогольдегидрогеназы у 85-98%) населения Азии и лишь у 5-20% европейцев. В то же время потеря активности N-ацетилтрансферазы-2 чаще всего встречается среди европейских народов.
Полиморфизм глутатион-Б-трансфераз. К настоящему времени установлено, что ключевую роль во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков играют глутатион-Б-трансферазы (GST), которые широко экспрессируются в тканях человеческого организма. Эти ферменты катализируют присоединение глутатиона к электрофильному центру разнообразных химических соединений, что приводит к потере токсичности и образованию более гидрофильных продуктов, которые в дальнейшем могут быть метаболизированы и выведены из клетки. GST обладают также некоторой пероксидазной активностью, благодаря чему играют важную роль во внутриклеточном связывании и транспорте большого числа как эндогенных, так и экзогенных соединений.
GST человека образуют семейство ферментов, которое подразделяется на 8 классов, они непосредственно вовлечены во вторую фазу биотрансформации эндогенных и экзогенных ксенобиотиков. Ферменты детоксикации имеют широкий изоформный спектр, что определяется полиморфизмом кодирующих их генов. По данным последних исследований, определенные аллели могут играть роль предрасполагающих факторов в процессе канцерогенеза и развития тяжелых заболеваний дыхательной системы [Nakajima Т. et al., 1995; Baranova Н. et al., 1997; Harrison D.J. et al., 1997; Salagovic J. et al., 1998; Ford J.G. et al., 2000; Yim J.J. et al., 2000; Попова C.H. и соавт., 2002; Stucker I. et al., 2002]. GST класса M подразделяются на 5 групп, все эти ферменты кодируются одним геном, картированным на длинном плече хромосомы 1 (lql3), и образуются вследствие альтернативного сплайсинга первичного РНК-транскрипта. Встречаются три аллельных варианта гена GSTM1: GSTM1A и GSTM1B, кодирующие белки со сходной ферментативной активностью, и GSTM10, протяженная делеция которого (около 10 тыс.п.н.) приводит к полному отсутствию синтеза белкового продукта. Еще один механизм инактивации гена GSTM1 состоит в изменении промоторного участка за счет гиперметилирования. Именно этот, так называемый нулевой аллель (генотип 0/0), широко распространен в популяции человека (до 50% в некоторых популяционных группах) [Ford J.G. et al., 2000; Garte S. et al., 2001; Попова C.H. и соавт., 2002].
Ген GSTT1 картирован на 22 хромосоме (22qll.23). Так же, как и в случае с GSTM1, обширная делеция в структурной части этого гена встречается с высокой частотой в популяциях человека (до 30% европеоидов гомозиготны по 0/0 аллелю этого гена) [Баранов B.C. и соавт., 2000] и ассоциируется с низкой эффективностью детоксикации потенциальных канцерогенов, что может быть связано с высокой предрасположенностью к раку [Ketterer В. et al., 1992; Rebbeck Т. R., 1997; Jourenkova-Mironova N. et al., 1998; London S.J. et al, 2000; Malats N. et al., 2000; Spurdle A.B. et al., 2001]. В литературе приводятся противоречивые сведения относительно ассоциации нуль-генотипа генов GSTT1 и GSTM1 с риском возникновения рака легкого.
Молекулярный патогенез рака предстательной железы
В конце прошлого столетия сформировалось устойчивое представление, что гормоны индуцируют опухоли за счет традиционных механизмов действия на ткани-мишени, способствуя в них, прежде всего, процессам клеточного размножения, на которые накладывается воздействие какого-либо истинного канцерогена. В усовершенствованном варианте такой точки зрения, разделяемой в настоящее время, оговаривается, что усиленная гормон-индуцированная пролиферация создает условия для большей частоты нерепарируемых и закрепляемых в последующих клеточных поколениях повреждений ДНК, или мутаций, но, что при этом сами гормоны последних не вызывают [Берштейн Л.М., 2002]. Когда идет речь о гормональном канцерогенезе, чаще всего имеется в виду такие гормонозависимые опухоли как рак молочной железы, рак матки, т.е. эстроген-зависимые онкологические процессы. Тем не менее, целый ряд гормонально-метаболических особенностей рака молочной, предстательной железы, рака эндометрия, новообразований яичников, толстой кишки и ряда других опухолей, выявляемых, прежде всего, во второй половине жизни, связан с общими закономерностями изменений гомеостатической эндокринной регуляции, присущими зрелому периоду жизни и старению.
Участие гормонов в канцерогенезе может быть двояким, с одной стороны они способны создать условия для опухолевого роста, с другой -обеспечивать механизмы, так называемого гормонального канцерогенеза, который в свою очередь принято делить на два типа: промоторный и генотоксический канцерогенез.
Рак предстательной железы во многих странах является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин [Ruijter Е., 1999]. В последние годы отмечается исключительно быстрый рост заболеваемости РПЖ, достигающий в среднем 3% за год, что позволяет прогнозировать удвоение числа регистрируемых случаев к 2030 г. [Boyle Р.,]. Эпидемиологические исследования показывают, что уровень заболеваемости в отдельных странах существенно различается, при чем одно из первых мест по данному показателю занимают США [Watanabe М., 2000]. Самая высокая заболеваемость РПЖ описана в популяции афроамериканцев США (116 на 100000 человек в год), в то время как среди белых мужчин она составляет 71 на 100000 человек в год. Средняя заболеваемость (20-50 на 100000 человек) характерна для Южной Америки и европейских стран, а наиболее низкая заболеваемость РПЖ ( 10 на 100000 человек) регистрируется в Японии, Китае и Индии [Watanabe М., 2000]. Как следует из приведенных данных, различия по данному показателю между разными странами весьма значительны (до десятков раз), причем они сохраняются на этом уровне на протяжении длительного времени [Nomura A.M.J., 1991].
Заболеваемсть РПЖ в России сопоставима с таковой в азиатских странах (10-15 на 100000 человек), однако отмечается ее существенный рост, составивший за 90-е годы почти 50% [Мерабишвили В.М., 2000;Trapeznikov N.N., Aksel Е.М., 2000]. В Санкт_Петербурге стандартизированный показатель заболеваемости в 1999 г. составил 19,2 на 100000 населения, что несколько выше среднероссийского, но существенно уступает таким регионам, как Архангельская и Томская области (30 и 39 на 100000 соответственно) [Мерабишвили В.М., 2000].
В этиологии рака предстательной железы ведущее место занимает гормональная теория развития опухоли, что подтверждается определенными успехами гормональной терапии в лечении данного заболевания. В соответствии с этой теорией, главным фактором развития опухоли является появляющийся с возрастом дисбаланс между отношением эстрогенов и андрогенов, проявляющийся усилением токсического действия наиболее мощного метаболита тестостерона - дегидротестостерона. Помимо этого, широко дискутируется влияние и многих других факторов, например диеты (потребление большого количества животных жиров), инфекционных агентов (вирус папилломы человека, цитомегаловирусы, вирус простого герпеса, И111111), полового поведения, факторов внешней среды, профессиональных вредностей и генетических особенностей [Кушлинский Н.Е., 2002].
По крайней мере, семь регионов генома были предложены в качестве кандидатных на содержание аутосомно-доминантного гена наследственного рака простаты, включая Iq24-lq25 (НРС1), Iq42-q43 (РСАР), Xq27-q28 (НРСХ), 1р36 (САРВ), 20ql3 (НРС20), 17pll (ELAC2) и 16q23 [Nwosu V. et al., 2001; Bratt О., 2002; Simard J. et al., 2002]. Ни один из данных регионов не был последовательно идентифицирован в различных популяциях, и ни один из данных генов не был столь же специфичным для рака предстательной железы, как, например, делеция в районе 5q21 при колоректальном раке. Это дает основание считать, что генетическое предрасположение к раку простаты не может следовать стандартной схеме.
Вместо мутаций в определенных генах, приводящая к высокому риску, генетическая восприимчивость к раку простаты может зависеть от распространенных полиморфизмов, умеренно увеличивая риск для болезни у гетерозиготных или гомозиготных особей. Полиморфизмы в генах, связанных с рецепторами и метаболизмом гормонов, защитой клетки, репарацией ДНК, метаболизмом нуклеотидов могут быть вовлечены в канцерогенез [Schulzl W.A.et al., 2003].
В первой группе наиболее изучены полиморфизмы гена рецептора андрогенов (AR) и рецептора витамина D (VDR). В N-концевом районе транскрипционной области гена AR обнаружен полиморфизм CAG и повторений GGN, которые кодируют глутамин и глициновые повторения соответственно. В целом, полиморфизм тандемных (коротких) повторов, кажется, связаны с небольшим увеличением риска, хотя некоторые исследования меняют данные представления [Simard J. et al., 2002]. Из нескольких полиморфизмов гена VDR лучше всего коррелируют с изменением восприимчивости к раку предстательной железы изменения длины тандемных повторов в 3 -регионах данного гена [Correa-Cerro L. et al., 1999].
Другой хорошо изученный полиморфизм Ala49Thr в гене SRD5A2, кодирующий одну из форм 5-а редуктазы, фермента который конвертирует в простате тестостерон в более активный метаболит дегидротестостерон. Этот полиморфизм может увеличивать риск в определенных популяцих Афро-американцев, но не доказан в популяциях европеоидов [Makridakis N.M. et al., 1999].
В раковых образованиях, вызванных химическими канцерогенными веществами, полиморфизмы в генах метаболизма ксенобиотиков могут существенно смоделировать риск развития рака простаты. Среди них особое место занимают глутатион-8-трансферазы, которые защищают против потенциально мутагенных эндогенных и экзогенных соединений. Действительно, полиморфизмы в GSTT1 и GSTP1 бьши описаны, как связанные с увеличением риска развития рака простаты в работах Steinhoff С. et al. (2000), Gsur A. et al (2001), Kote-Jarai Z. et al. (2001). Повреждениям генов репарации ДНК, генов BRCA1 и BRCA2 также присуждают увеличение риска развития рака простаты [Rosen Е.М. et al., 2001; Edwards S.M. et al. 2003]. Распространенный полиморфизм гена MTHFR (метилентетрогидрофолатредуктаза), Ala677Val, также может быть связан с восприимчивостью рака простаты [Kimura F. et al., 2000].
Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз ТІ, Ml, PI у больных раком легкого и здоровых доноров
Для сравнительного анализа частот аллелей и генотипов исследованных генов у больных раком легкого в группы обследованных были включены здоровые жители г. Томска (п=172). В выборке больных раком легкого было 23 женщины и 232 мужчины, в выборке здоровых жителей г. Томска - 82 мужчины и 90 женщин. Результаты анализа аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты 2 фазы биотрансформации, у онкологических больных и в контрольной группе представлены в табл.2. Частота гомозиготных особей по нулевому аллелю (0/0) гена GSTT1 в контрольной группе обследованных оказалась несколько ниже популяционной (23,3%) [Попова С.Н., Сломинский П.А., 2002] и составила 18,6 %. В исследованных выборках наибольшая частота нулевого генотипа гена GSTT1 была отмечена у больных раком легкого, при этом различия между онкологическими больными и здоровыми лицами оказались статистически значимыми (%2=38,65; р 0,000...).
Анализ доли гомозигот по нулевому аллелю глутатион-Б-трансферазы МІ у здоровых доноров показал, что частота GSTM1 0/0 соответствует таковой в популяции Северо-Западного региона России (42,2%) [Попова С.Н., Сломинский П.А.., 2002] и составила 39,5%. У больных раком легкого частота гомозигот GSTM1 0/0 (59,4%) превышала популяционный уровень и статистически значимо отличалась от соответствующих показателей у обследованных здоровых лиц (% =7,20; р 0,001).
Исследование функционально неполноценных генотипов гена GSTP1 было проведено у 100 больных раком легкого и 72 здоровых доноров. Делеционные варианты данного гена, кодирующие синтез белка со сниженной ферментативной активностью на первом этапе были объединены в одну группу показателей. При этом частота делеционных вариантов гена GSTP1 (61%) более чем в два раза превышала таковую у здоровых доноров (29,5%), а уровень статистической значимости отличий составил 0,0000722.
На втором этапе анализа функционально неполноценных генотипов гена GSTP1 был проведен развернутый анализ возможных генотипов и аллелей данного гена (табл.3). Было показано, что и при сравнении частот генотипов, и при сравнении частот аллелей достигнут высокий уровень статистической значимости отличий (0,00015 и 0,00004 соответственно) между группами больных раком легкого и здоровых доноров.
Часть представителей контрольной группы (72 человека) предоставила информацию о наличии родственников первой и второй степени родства, имеющих в анамнезе онкологические заболевания. Анализ этих данных показал (табл.4), что существенных различий носительства делеционных вариантов генов GSTT1 и GSTM1 в группах здоровых доноров с отягощенной и неотягощенной онкологической наследственностью не обнаруживалось.
Исследование патологических форм гена GSTP1 показало, что не смотря на двукратное превышение доли неполноценных форм данного гена у лиц с отягощенной онкологической наследственностью, статистически значимого уровня отличий достигнуто не было. Тем не менее, обращала на себя внимание тенденция (р=0,1) к увеличению доли носителей патологических форм гена GSTP1 в группе здоровых доноров с отягощенной онкологической наследственностью. Аналогичные данные были получены и при развернутом анализе делеционных вариантов и аллелей гена GSTP1 (табл. 5). Отмечалаь тенденция к увеличению доли носителей делеционных вариантов генотипов и аллелей гена GSTP1 в группе здоровых доноров с отягощенной онкологической наследственностью.
В связи с тем, что метастазирование представляет собой важнейший этап в патогенезе злокачественных опухолей как с клинической, так и прогностической точки зрения, особый интерес, на наш взгляд, представляло определение частоты гомозиготных носителей нулевого аллеля (0/0) гена GSTT1, GSTM1 и GSTPlcpeflH больных раком легкого с регионарными и отдаленными метастазами (табл.6). Для этого все больные раком легкого были разделены на 2 группы в зависимости от наличия либо отсутствия очагов метастазирования. Для этой градации нами была использована классификация злокачественных новообразований по системе TNM. Первую группу (п=117) составили больные без очагов метастазирования (Т1-4 N0 МО), а вторую (п=137) - с Т1-4 N0-2 М0-1 по системе TNM. Во вторую группу входили больные с поражением в регионарных лимфатических узлах (T1-4N1-2M0) - 121 пациентов, с сочетанными метастатическими процессами как в регионарных лимфоузлах, так и в отдаленных органах (Т1-4N1-2M1) - 16 пациентов. Группу больных раком легкого без метастазов составляли пациенты со II (22,2%) и III (55,5%) стадиями злокачественного процесса. Больные с метастазами имели в основном Ш (48,9%) и IV (39,4%) стадии заболевания. Изучение распределения генотипов исследуемых генов показало, что у больных раком легкого с метастазами частота гомозигот по 0/0-генотипу GSTT1 была статистически значимо выше по сравнению с соответствующими показателями у больных без метастазов (55,5%и41,1% соответственно; %=4,71; р=0,029). Следует отметить также, что для 0/0-генотипа GSTM1 была установлена тенденция к увеличению нуль-генотипов у больных раком легкого с метастазами (66,4% и 55,6% соответственно; Х2=2,7;р=031).
Комбинации полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого.
С целью выяснения зависимости частоты нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 от клинических особенностей заболевания все обследованные больные раком легкого были разделены на группы по стадиям развития опухолевого процесса, согласно отечественной 4-стадийной клинической классификации [Черенков В.Г., 1999]. При этом у 15 и 42 пациентов были установлены I и II стадии заболевания, что составляло 5,9 и 16,5% соответственно. В 52,5 и 25,1% случаях диагностировались III и IV стадии злокачественного процесса (табл.8).
В настоящей работе было установлено, что частота гомозигот по 0/0-генотипу GSTT1 оказалась достоверно повышенной, начиная со II стадии заболевания(р 0,0001).
На П-ой и Ш-ей стадиях рака легкого отмечалось увеличение частот носителей нулевого генотипа GSTT1 в 2,5 раза по сравнению с контрольными значениями, на IV стадии процесса частота носителей патологического генотипа троекратно превышала соответствующие значения у здоровых доноров. Достоверным также оказалось превышение частоты делеционного варианта гена GSTT1 у больных раком легкого на четвертой стадии заболевания по сравнению с аналогичным показателем больных на третьей стадии злокачественного процесса.
Для нулевого генотипа GSTM1 было зарегистрировано статистически значимое увеличение его частоты у больных раком легкого на второй, третьей и четвертой стадиях заболевания. У больных на IV стадии рака легкого была зарегистрирована максимальная доля носителей патологического генотипа (71,3%). Следует отметить также достоверное увеличение доли патологических генотипов GSTM1 на IV стадии заболевания по сравнению с таковой у больных с первой и третьей стадией онкологического процесса.
Анализ патологических генотипов гена GSTP1 (GSTPl/dell05 и del 105/del 105) показал статистически значимое увеличение доли патологических генотипов на III и IV стадиях рака легкого по сравнению с контрольными значениями.
Исходя из известного факта перекрестной специфичности генов семейства глутатион-8-трансфераз, была проведена оценка комбинации патологических вариантов генов этого семейства, способных к образованию полиморфных вариантов. В исследование были включены 100 больных раком легкого (92 мужчины и 8 женщин) и 72 здоровых донора (23 мужчины и 49 женщин). Анализ комбинаций глутатион-8-трансфераз проводили попарным сравнением частот полноценных и делеционных вариантов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого и здоровых доноров.
Результаты исследования приведены в таблице 9. Показано, что частота комбинаций морфологически и функционально полноценных аллелей генов семейства глутатион-8-трансфераз у здоровых доноров в пять раз превышал этот показатель у больных раком легкого (% =16,76; р=0,00004), при этом относительный риск (OR) развития рака легкого при носительстве функционально неполноценных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз увеличен в 6,89 (С195%2,44-20,44).
Неблагоприятной, с точки зрения риска развития рака легкого, оказалась комбинация нулевого аллеля гена GSTT1, ненулевого аллеля гена GSTM1 и гетерозиготной делеции гена GSTP1 {% =8,35; р=0,003), при этом относительный риск возникновения опухоли составил 1,15 при колебании интервалов от 1,07 до 1,24.
Из литературы известно, что в отличие от генов GSTT1 и GSTM1, гетерозиготная делеция которых полностью скомпенсирована и не влияет на активность продуцируемого фермента, и гетерозиготная, и гомозиготная деления гена GSTP1 (GSTPIAT/ГТ) приводит к продукции белка с измененной ферментативной активностью. Описано снижение активности относительно большинства экзогенных и эндогенных ксенобиотиков, но происходит семикратное увеличение каталитической активности фермента по отношению к полициклическим ароматическим соединениям. Этот факт позволил проанализировать комбинации генотипов, который подтвердил и дополнил исследование аллельных комбинаций (табл.9)
Было показано наличие протекторной комбинации — морфологически и функционально полноценных генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1, подтверждено, но уже с большим уровнем статистической значимости (р=0,001; % =10,02), увеличение доли носителей комбинаций нулевого аллеля гена GSTT1, ненулевого аллеля гена GSTM1 и делеционных вариантов гена GSTP1. Показано также статистически достоверное (р=0,04) увеличение частоты комбинации нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 и делеционных вариантов гена GSTP1 (GSTT10/GSTM10/GSTPl/dell05(del 105/ del 105)) у больных раком легкого, сопровождавшийся увеличением относительного риска развития рака легкого у здоровых носителей данной комбинации в 3,48 (CW,03-1239).
Нужно отметить, что сочетания генотипов, содержащих 2 и более мутации генов глутатион-8-трансфераз, в два раза чаще обнаруживались у больных раком легкого (63%), по сравнению с группой контроля (36,1%), что позволило определить относительный риск развития при данном состоянии, который составил 3,01 (С195%1,53-5,95).
