Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор литературы 10
1.1. Значение молочнокислой микрофлоры в сыроделии 10
1.2. Бактериальные закваски, применяемые при производстве сыров с низкой температурой второго нагревания 13
1.2.1 Состав заквасок для сыроделия 13
1.2.2. Принципы подбора микрофлоры заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания 18
1.3. Бактериофаги в сыроделии и меры борьбы с ними 21
1.3.1. Источники бактериофагов на сыродельных предприятиях
1.3.2. Строение и свойства фагов молочнокислых бактерий 25
1.3.3. Меры борьбы с фаголизисом 28
2. Обоснование выбранного направления работы
3. Организация работы, объекты и методы исследований 38
3.1. Организация работы 3 8
3.2. Объекты исследования 40
3.3 Питательные среды и реактивы, использованные в работе 41
3.4. Хранение и культивирование микроорганизмов и бактериофагов 43
3.5. Методы исследований 44
3.6. Математическая обработка экспериментальных данных 52
4. Изучение фаговой ситуации на сыродельных заводах республики беларусь 53
5. Характеристика бактериофагов лактококков, циркулирующих на сыродельных заводах Беларуси 67
5.1. Совершенствование методологии выделения вирулентных фагов 67
5.2. Выделение и изучение лактококкофагов на сыродельных заводах Беларуси . 71
6. Выделение и изучение фагоустоичивых штаммов лактококков
6.1. Выделение и изучение фагоустойчивых штаммов лактококков из подсырной сыворотки. 88
6.2. Выделение и изучение фагорезистентных мутантов, полученных на основе коллекционных культур лактококков 99
7. Подбор фагоустойчивых культур лактококков в по состав бактериальных заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания
8. Производство бактериальных заквасок и концентрата на основе фагоустойчивых культур. 120
9. Производственные испытания фагоустойчивых бактериальных закваски и концентрата при производстве твердых сычужных сыров 128
Выводы 138
Список использованных литературных источников 141
Приложения 151
- Принципы подбора микрофлоры заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания
- Изучение фаговой ситуации на сыродельных заводах республики беларусь
- Выделение и изучение лактококкофагов на сыродельных заводах Беларуси
- Выделение и изучение фагорезистентных мутантов, полученных на основе коллекционных культур лактококков
Принципы подбора микрофлоры заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания
Обычно спектр свойств, который учитывается при отборе культур для использования в составе заквасок, формируется, исходя из функций, выполняемых заквасочной микрофлорой.
Для сыроделия большое значение имеет интенсивность накопления молочной кислоты заквасочной микрофлорой при ее развитии в молоке. Поэтому большинство исследователей считают кислотообразующие свойства важнейшими характеристиками отдельных культур и закваски в целом [115,122, 126,129]. Кислотообразующие свойства оцениваются по энергии (или скорости) кислотообразования в молоке, сквашивающей активности, предельной титруемой кислотности, создаваемой в молоке, и т.д.
Гудков А. В. [27] отмечает, что сычужный фермент при внесении в молоко оказывает влияние на энергию кислотообразования микроорганизмов закваски. Селекция штаммов с повышающейся в присутствии сычужного фермента энергией кислотообразования может быть критерием подбора культур в состав заквасок для сыра.
Большое значение при отборе культур молочнокислых бактерий для использования в составе заквасок придается их газо- и ароматобразующей активностям [104,153].
Микроорганизмы закваски обнаруживают отчетливую, хотя и небольшую по сравнению с типичными микроорганизмами, расщепляющими белок, способность к протеолизу. Расщепление белка, преимущественно казеина, ведет через полипептиды и олигопептиды к образованию свободных аминокислот; процесс может остановиться на стадии полипептидов. Установлено, что МКБ различаются по степени протеолиза, в частности, у активных и слабых кисло-тообразователей протеолитическая активность в молоке не одинакова. Активные кислотообразователи во время культивирования в молоке снижают содержание растворимых белков и увеличивают содержание пептидов и свободных аминокислот; слабые кислотообразователи, наоборот, увеличивают содержание растворимых белков и снижают содержание пептидов при незначительном увеличении количества свободных аминокислот. Как показали исследования, при общей закономерности протеолиза у сильных и слабых кислотообразователей протеолитическая активность зависит и от штаммовых особенностей [44].
Распространенным пороком сыров является горечь, одна из причин которой - образование горьких пептидов, характеризующихся относительной молекулярной массой 2000—3000, образующихся при расщеплении казеина сычужным ферментом и микрофлорой закваски. Установлено, что микроорганизмы закваски, чаще сильные кислотообразователи, подобно штаммам Lc. lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. cremoris, могут образовывать горькие полипептиды. Способность образовывать в сыре и молоке с сычужным ферментом и мелом больше полипептидов с относительной молекулярной массой 2000—3000 может служить критерием для исключения горьких штаммов при селекции микроорганизмов закваски. Таким образом, отбор подходящих штаммов имеет особое значение для предотвращения горького вкуса [27]. Кроме того, доказано, что слабые кислотообразователи могут, ассимилируя горькие пептиды, снижать горечь.
В настоящее время установлено, что липазная активность МКБ может выступать как регулятор липолитического процесса в сырах. МКБ обладают способностью к гидролизу молочного жира и фосфолипидов молока, продукты которого влияют на вкус и аромат сыра. Установлено, что МКБ имеют разные уровни липазной и фосфолипазной активности. Сыры, выработанные с применением закваски, обладающей высокой липолитической и фосфолипазной активность характеризуются выраженным вкусом и пластичной консистенцией. Поэтому оценка производственных свойств культур, планируемых в состав заквасок для сыра, может вестись по липазной и фосфолипазной активности культуры [49,55,89,92].
Одним из способов предотвращения развития посторонней микрофлоры при производстве сыра является использование антагонистических свойств за-квасочной микрофлоры. Установлено, что молочнокислые бактерии ингибиру-ют рост посторонней микрофлоры в сырах за счет специфического и неспецифического антагонизма. Неспецифический антагонизм молочнокислых бактерий обусловлен снижением рН, образованием органических кислот, анаэробных условий и конкуренцией за лактозу [27]. Но, так как в промышленных условиях обеспечить оптимальную скорость кислотообразования во время выработки сыра не всегда удается, что снижает степень неспецифического ингиби-рования роста посторонней микрофлоры, возникает необходимость поиска молочнокислых бактерий, обладающих специфическим антагонизмом. Многие исследователи изучали антагонистическую активность молочнокислых бактерий [13,46]. Установлено наличие среди них штаммов, подавляющих рост кишечной палочки. Штаммы с такими свойствами выделены как среди молочнокислых палочек, так и среди молочнокислых лактококков и лейконостоков. Введение их в состав заквасок для сыра положительно влияло на качество продукта [46,94]. Анализ литературы показывает, что антагонистическая активность МКБ варьирует в довольно широких пределах и зависит от видовых и штаммовых особенностей. Поэтому показатель антагонистической активности МКБ может служить критерием подбора в состав заквасок для твердых сычужных сыров.
Важными показателями, характеризующими свойства культуры, являются фагочувствительность и лизогенность. Многочисленные литературные дан 21 ные свидетельствуют о важности отбора культур в состав заквасок по признаку фагоустойчивости [20,27,30,132,150]. Принципы отбора фагоустойчивых культур можно охарактеризовать следующим образом: использование фагоустойчивых штаммов, выбранных по чувствительности к коллекционных фагам или полученных путем повышения фагоустойчивости коллекционных культур с помощью спонтанных мутаций [32,56] , воздействий различных мутагенов (например, Гамма- и УФ-облучением) [37], генетическими методами (конъюгацией, трансдукцией и т. д.) [6,80]; использование в заквасках нескольких штаммов с различными фаготипами [27].
В настоящее время установлено, что многие молочнокислые бактерии ли-зогенны. В популяции таких бактерий всегда имеется небольшое количество фаговых частиц, образующихся при спонтанных мутациях. Согласно имеющимся в литературе рекомендациям лизогенные культуры либо не используются в составе заквасок [147], либо используются в составе комбинаций, составляющихся из нечувствительных к данному фагу штаммов [79].
Изучение фаговой ситуации на сыродельных заводах республики беларусь
Анализ приведенных выше литературных данных свидетельствует, что основные направления предотвращения лизиса заквасочной микрофлоры и стабилизации молочнокислого процесса при получении сыра представляют собой комплекс мер, с одной стороны направленных на ужесточение санитарно-гигиенических аспектов, особенно повышение асептики при производстве производственных заквасок; а с другой стороны - усиление фагоустойчивости культур молочнокислых бактерий.
Одним из перспективных направлений борьбы с бактериофагом является использование фагоустойчивых концентратов непосредственного внесения в смесь для выработки сыра. Преимущество этого метода заключается в исключении опасных в плане обсеменения бактериофагом стадий приготовления производственной закваски, повышение стабильности молочнокислого процесса, экономия производственных площадей. Недостатками этого направления является большой расход концентратов и увеличение затрат на производство сыра.
Важнейшей проблемой, стоящей перед сыроделием, является производство сыров гарантированного качества. Необходимым компонентом биотехнологии сыров, определяющим их органолептические свойства, пищевую и биологическую ценность, безопасность для потребителя, являются закваски, представляющие собой подобранные и определенным образом подготовленные комбинации молочнокислых бактерий.
В настоящее время при производстве сыров с низкой температурой второго нагревания, в зависимости от особенностей их биотехнологии, используют моно- и поливидовые одно- и многоштаммовые закваски, в составе микрофлоры которых используют отобранные по комплексу свойств культуры мезофильных молочнокислых бактерий родов Lactococcus, Leuconostoc и Lactobacillus.
Молочнокислые бактерии осуществляют преобразование основных компонентов молока во вкусовые, ароматические, биологически активные вещества сырной массы, участвуют в формировании консистенции, структуры и рисунка сыра, подавляют развитие вредных для потребителя микроорганизмов.
Снижение интенсивности и направленности микробиологических процессов может быть обусловлено несколькими причинами, главными из которых являются: использование молока нестандартного состава, в том числе с ингибирующими веществами, поражение бактериофагами полезной микрофлоры, нарушение параметров технологических процессов и несоблюдение санитарно-гигиенических условий производства. Чаще всего нарушение размножения и метаболизма молочнокислой заквасочной микрофлоры происходит из-за присутствия бактериофагов, которые выявляются в исходном сырье, в нормализованном пастеризованном молоке и в самих заквасках. Нарушение молочнокислого процесса при получении сыров приводит к снижению качества продукции, потерям сырья и возможности возникновения пищевых инфекций.
Анализ имеющихся в литературе материалов показывает, что стабилизация активности заквасочной микрофлоры может быть достигнута комплексом мероприятий, включающих проведение системного и систематического фагового мониторинга на конкретном предприятии, применение эффективных и доступных средств защиты молочнокислой заквасочной микрофлоры от фаголизиса, использование в составе бактериальных заквасок фагоустойчивых культур, полученных, например, из под сырной сыворотки или коллекционных культур.
Целью настоящей работы является стабилизация молочнокислого процесса при производстве сыров с низкой температурой второго нагревания, повышение качества и безопасности выпускаемой продукции на основе разработки практических мер предотвращения фаголизиса и повышения фагорезистентности заквасочной микрофлоры. Для достижения поставленной цели и проверки сформулированной гипотезы в диссертационной работе решались следующие задачи: изучить фаговую ситуацию на сыродельных заводах республики Беларусь, определить источники фаголизиса заквасочной микрофлоры; провести выделение и изучение свойств бактериофагов, распространенных на сыродельных предприятиях; - получить фагорезистентные культуры лактококков из подсырной сыворотки и изучить их свойства, важные для сыроделия; - изучить и отобрать культуры лактококков, перспективные для использования в составе бактериальных заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания, из коллекции УП "БЕЛНИКТИММП", и провести эксперименты по повышению их фагоустойчивости; - провести подбор и испытание состава бактериальных заквасок для твердых сычужных сыров из фагоустойчивых культур в производственных условиях; - разработать состав и технологии производства бактериальных концентратов из фагорезистентных культур; - провести промышленные испытания бактериальных концентратов на сыродельных заводах Беларуси; - разработать методические указания по предотвращению фаголизиса заквасочной микрофлоры.
Выделение и изучение лактококкофагов на сыродельных заводах Беларуси
Перед выделением культур пробы сыворотки обогащали молочнокислой микрофлорой. В качестве среды обогащения образцов культурами МКБ использовали стерильное обезжиренное молоко. Температуру термостатирования при обогащении образца выбирали в зависимости от вида бактерий: 30С - для культур Lc. lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. diacetilactis и 25 С для обогаще-ния образца Lc. lactis subsp. cremoris. 0,5 см подсырной сыворотки вносили в пробирки, содержащие (10 + 1) см питательной среды.
Для ингибирования роста посторонней микрофлоры (дрожжи, плесени, аэробные бактерии) в пробирки с молоком, содержащие образцы сыворотки, непосредственно после посева вносили 5-7 % этилового спирта. Пробирки с посевами инкубировали в термостате до образования сгустка, затем выдерживали при комнатной температуре 48- 72 часа, после чего каждый образец пересевали в 3 пробирки: № 1 - стерильное обезжиренное молоко с добавлением 1 % натрия лимоннокислого для обогащения образца культурами ароматообразующих бактерий; температура культивирования (30+1) С; №2 - стерильное обезжиренное молоко для обогащения мезофильными культурами; температура культивирования (30+1)С; №3 - стерильное обезжиренное молоко, для обогащения образца L. lactis subsp. cremoris; температура культивирования (25+1) С. Для дальнейшего обогащения проб производили 2-4-х кратные перевивки каждого образца при минимальной дозе инокулята (1 петля) до получения ровного, плотного сгустка и каждый раз фиксировали время образования сгустка при различных температурах. Из обогащенных образцов отбирали лучшие по органолептике, микроскопическому препарату и наличию летучих веществ. Остальные образцы отбраковывали и в дальнейшей работе не использовали. Для рассева было отобрано 16 образцов, 2 образца были отбракованы по органолептическим показателям (пороки вкуса).
Изолированные колонии МКБ получали на чашках Петри с агаризован-ной средой при глубинном посеве 1 см образца в разведениях 10" , 10" , 10" (с целью получения на одной чашке 20-30 изолированных колоний). После застывания агара чашки помещали в термостат на 48 72 часа при оптимальных для выделяемых видов температурах. Далее чашки дополнительно выдерживали 3-4 суток при комнатной температуре для проявления устойчивого окрашивания колоний различных видов.
Для выявления колоний, принадлежащих культурам Lc. lactis subsp. cre-moris и Lc. lactis subsp. diacetilactis, их рассматривали при увеличении. Культуры Lc. lactis subsp. cremoris на агаре с гидролизованным молоком давали округлые темные колонии с выраженной зернистостью. Культуры Lc. lactis subsp. diacetilactis на плотной питательной среде с 3 % агара образовывали глубинные колонии неправильной формы в виде кусочков ваты.
Отмеченные колонии переносили в промаркированные пробирки с молоком и помещали в термостат при соответствующих температурах до образования сгустка не более, чем на 48 часов. Все культуры, образовавшие и не образовавшие сгусток, подвергали микроскопическому исследованию. Препараты окрашивали метиленовои синью и по Граму. При просмотре микроскопических препаратов отбраковывали все Грам (-) культуры, а также культуры, имеющие скученность клеток, неоднородные клетки, постороннюю микрофлору. В оставшихся препаратах описывали форму, расположение клеток и их размеры. Определяли наличие ароматических веществ, газообразование, время образования сгустка. Штаммы, образующие сгусток за 10+-16 часов, относили в группу быстросвертывающих; за 16- -48 часов - слабосвертывающих; штаммы, не свернувшие молоко за 48 часов - в группу несвертывающих. Из группы слабосвертывающих и несвертывающих штаммов мезофильных лактококков отбраковывали штаммы, не образующие ароматических веществ. Штаммы, способные к образованию ароматических веществ, оставляли для дальнейших исследований и идентификации. С твердой питательной среды было сколото 180 колоний и отвито в стерильное молоко. Свернувшие молоко колонии проверялись 3-х кратно по ор-ганолептическим показателям, газо- и ароматообразованию, активности кисло-тообразования, микроскопическому препарату. Отбраковывались культуры с нечистым вкусом, слабой консистенцией, со слабой или уменьшающейся сквашивающей активностью (кроме штаммов Lc. lactis subsp. diacetilactis слаб.). В результате проведенных исследований было забраковано по активности кислотообразования 15 штаммов, по характеру сгустка 8 штаммов, по органо-лептическим показателям 17 штаммов. Показатели, по которым проводился первоначальный отбор, приведены нарис. 6.2. Идентификацию молочнокислых бактерий проводили с помощью традиционных (классических) методов, основанных на изучении морфологических, культурально-физиологических и биохимических признаков [8,48,70]. Далее изучались следующие свойства штаммов: предельная кислотность, рост в лакмусовом молоке, образование NH3 из аргинина, рост в гидролизован-ном молоке, содержащем 2; 4; 6,5 % NaCl, рост в гидролизованном молоке при разных температурах культивирования (30 С, 40 С, 45С). В результате проведенной работы идентифицировано 140 культур мезо-фильных лактококков. Из них 32 штамма отнесены к Lc. lactis subsp. lactis, 8 штаммов - к Lc. lactis subsp. cremoris, 48 штаммов - к Lc. lactis subsp. diacetilactis сильным и 52 - к слабым.
Выделение и изучение фагорезистентных мутантов, полученных на основе коллекционных культур лактококков
На основе подобранных комбинаций бактериальных заквасок для твердых сычужных сыров с низкой температурой второго нагревания в соответствии с разработанным технологическим регламентом (Приложение 8) на опытно-технологическом участке отдела микробиологии УП ЪЕЛНИКТИММП" выработано по 3 опытно-промышленные партии бактериальных жидких и сухих заквасок (Приложение 9) и бактериального концентрата для приготовления производственной закваски (Приложение 10).
Для выработки жидких и сухих заквасок были использованы комбинации БЗ 1,Б3 2,Б3 5,Б3 8.
Средой для накопления бактериальной массы являлось стерильное обезжиренное молоко. Обезжиренное молоко стерилизовали при (121±2)С в течение 13 мин. В охлажденное до температуры заквашивания стерильное молоко вносили 0,1 % культур, входящих в состав комбинации в соответствующих пропорциях.
Накопление бактериальных клеток осуществлялось при температуре (28±2) С в течение 16 часов до образования сгустка. Полученную закваску охладили до 6 С, смешали с защитной средой в соотношении 1:1, разлили по флаконам и высушили. В качестве защитной среды применяли натрий лимоннокислый и сахарозу. При выборе защитной среды использовали результаты, полученные на опытно-технологическом участке при выработке заквасок для творога и сметаны. Как видно из табл. 8.1., при сравнении выработанных жидких и сухих заквасок с первоначально подобранными комбинациями ухудшения их производственно-ценных свойств не происходит, что свидетельствует о правильно подобранных режимах культивирования и сушки. Выработанные закваски по своим показателям полностью соответствуют действующему в Республике Беларусь СанПин 1163РБ98. Бактериальные концентраты вырабатывались на основе БЗ 1, БЗ 2 и БЗ 8. В качестве сырья использовали подсырную сыворотку с добавлением буферных солей и стимуляторов роста. Для отделения сывороточных белков сыворотку подвергали тепловой обработке, нагревая до температуры (95±2) С с выдержкой 30-60 мин без перемешивания. Осветленную сыворотку осторожно сливали до белкового осадка. При использовании фильтрата сыворотки тепловая обработка исключается. К сыворотке добавляли сернокислый марганец, лимоннокислый натрий, томатный сок и дрожжевой автолизат. Питательную среду стерилизовали при температуре (121+2) С с выдержкой 60-65 мин, охлаждали до температуры (30±1) С, добавляли стерильное гидролизованное молоко и вносили посевной материал в количестве 10 %, приготовленный на обезжиренном стерильном молоке. Накопление бактериальных клеток осуществлялось при температуре (30±1) С в течение 7-Ю часов при постоянной нейтрализации среды. Активная кислотность среды на уровне 6,5-6,8 ед. рН поддерживалась путем непрерывного подщелачивания культуральной жидкости 25 %-ым водным раствором аммиака при постоянном перемешивании. Развитие культур контролировалось по изменению активной кислотности, расходу нейтрализующего средства, а также по микроскопическому препарату в конце культивирования. По окончании процесса культивирования культуральную среду охладили до температуры (13±4) С и направили на бактофугирование. Отделение бактериальных клеток от культуральной среды производилось на суперцентрифуге. Степень отделения клеток от среды контролировали по прозрачности жидкости, отходящей от суперцентрифуги, и по микроскопическому препарату. Для получения сухого бактериального концентрата суспензию бактерий смешали с защитной средой в соотношении 1:1 и разлили в стерильные кюветы сушилки слоем высотой (6±1) мм. Замораживание производили при температуре минус (40±5) С в течение 3 часов, после чего суспензию бактерий высушили методом сублимации при следующих режимах: температура в начале сушки - минус (40±5) С, в конце -плюс (30±2) С, продолжительность сушки - 20 часов, массовая доля влаги в готовом продукте не более 5 %. Сухой концентрат измельчили в порошок в стерильной фарфоровой ступке. Данные контрольных выработок представлены в табл. 8.2. Концентрат проверили в соответствии с планируемыми физико-химическими и микробиологическими показателями. Данные результатов анализов приведены в табл. 8.3. При сравнении характеристик первоначальной комбинации культур и производственной закваски, полученной из бактериального концентрата на основе данной комбинации, нужно отметить, что используемая питательная среда и технологический режим культивирования не приводят к изменению качественных показателей поливидовой закваски. В табл. 8.4 приведено сравнение полученных бактериальных концентратов с концентратами Угличской биофабрики (наиболее используемый на предприятиях Беларуси зарубежный аналог). Из всех концентратов НПО "Углич" был выбран БП №4, как более близкий по составу к испытуемому. Как видно из табл. 8.4., выработанные бактериальные закваски и концентрат по основным микробиологическим и физико-химическим показателям соответствуют требованиям мировых аналогов для данного вида продукции.
Похожие диссертации на Изучение фаговой ситуации на сыродельных заводах Республики Беларусь и усиление защиты заквасочной микрофлоры сыров с низкой температурой второго нагревания
