Содержание к диссертации
Введение
1 Современные тенденции развития производства препаратов растительного происхождения 18
1.1 Характеристика фитопрепаратов 18
1.2 Современное состояние и перспективы заготовки лекарственного растительного сырья 29
1.3 Биомасса изолированных тканей растений - новый вид сырья в технологии лекарственных средств 31
1.4 Экстрагирование лекарственного растительного сырья и пути интенсификации процесса 42
1.5 Технологии фитопрепаратов на основе комплексной переработки лекарственного растительного сырья 58
2 Материалы и методы исследования 65
2.1. Объекты и материалы исследования 65
2.2 Методы анализа растительного сырья 76
2.3 Условия проведения электронно-микроскопического анализа 82
2.4 Методы проведения экстракции лекарственного растительного сырья 83
2.5 Методы анализа БАВ в извлечениях из лекарственного растительного сырья 85
2.6 Методы определения физико-химических показателей экстрагентов и извлечений из растительного сырья 96
2.7 Методы математической обработки результатов экспериментов 97
3 Разработка технологии целенаправленного обогащения БАВ биомассы растений 98
3.1 Получение промышленного штамма ткани раувольфии змеиной — продуцента аймалина 99
3.2 Изучение влияния физиологических процессов клеток растительных тканей на их продуктивность 104
3.3 Способы управления продуктивностью культур тканей растений 128
4 Разработка технологии выращивания биомассы раувольфии змеиной (штамм К-27) 133
4.1 Оптимизация параметров культивирования штамма К-27 133
4.2 Методы поддерживающего отбора штаммов продуцентов БАВ 139
4.3 Промышленное использование штамма К-27 142
5 Разработка высокоэффективных способов выращивания биомассы растительных тканей 144
5.1 Культивирование ткани раувольфии змеиной в жидких питательных средах 144
5.2 Масштабирование технологии выращивания штамма К-27 149
6 Разработка методов выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной в технологии N-(4)- пропилаймалин бромида (NTIAB) 153
6.1 Оптимизация стадии экстрагирования биомассы методом перколяции 160
6.2 Разработка ионообменного метода очистки аймалина 167
6.3 Технология выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной ионообменным методом 181
6.4 Получение МІАБ 192
7 Экстрагирование лекарственного растительного сырья (ЛРС) двухфазными системами экстрагентов 195
7.1 Изучение особенностей экстрагирования липофильных БАВ двухфазной системой экстрагентов (ДСЭ) 198
7.2 Извлечение БАВ гидрофильной природы при экстрагировании ЛРС ДСЭ 271
8 Особенности двухфазной экстракции (ДЭ) ЛРС в присутствии поверхностно-активных веществ (ПАВ) 280
9 Практическое использование метода двухфазной экстракции в технологии фитопрепаратов 292
9.1 Получение фитопрепаратов на основе спиртоводных извлечений при ДЭ растительного сырья 292
9.2 Получение фитопрепаратов на основе масляных извлечений при ДЭ растительного сырья 295
9.3 Комплексная переработка сухого сырья водорослей 300
9.4 Разработка лекарственных средств на основе экстрагирования ЛРС компонентами суппозиторных основ в составе ДСЭ 315
10 Методологические основы разработки ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения 341
Выводы 345
Список литературы 349
Приложения
- Современное состояние и перспективы заготовки лекарственного растительного сырья
- Условия проведения электронно-микроскопического анализа
- Изучение влияния физиологических процессов клеток растительных тканей на их продуктивность
- Методы поддерживающего отбора штаммов продуцентов БАВ
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время в медицинской практике важное место принадлежит лекарственным средствам растительного происхождения, т к они обладают широким спектром биологического действия, что позволяет использовать их для профилактики и лечения многих заболеваний
Между тем потребность населения, возможности расширения применения фитопрепаратов (ФП) в медицинской практике удовлетворяются далеко не полностью, главным образом из—за неэффективной переработки лекарственного растительного сырья (ЛРС) и дефицита некоторых его видов В связи с этим особое значение приобретают исследования по созданию эффективных, целенаправленных технологий в производстве фитохимических лекарственных средств с целью комплексного использования ЛРС, достижения более высоких выходов, расширения спектра извлекаемых БАВ и ресурсосбережения
Эти проблемы можно решить, разрабатывая прогрессивные технологии переработки ЛРС, обеспечивающие максимальное извлечение биологически активных веществ (БАВ), и используя новый вид фитосырья - биомассу лекарственных растении, получаемую биотехнологическим способом с направленным биосинтезом индивидуальных веществ
Метод культивирования растительных клеток и тканей вызывает боль- ' шой интерес у исследователей, пригодность его для решения ряда технологических и медицинских проблем не вызывает сомнений (Бутенко, 1986, Носов, 1991, Воллосович, 1992, Misawa, 1994) Особенно перспективно применение биомассы как источника БАВ тех видов растений, которые являются редкими, исчезающими, произрастающими в труднодоступных регионах или с трудом культивируемых на плантациях, а также импортируемых Однако сырье, получаемое методом культуры тканей, еще достаточно дорогое и в ряде случаев не может конкурировать с заготовкой интактных растений, поэтому остается актуальным поиск новых эффективных направлений, позволяющих снизить себестоимость сырья за счет повышения продуктивности штаммов-продуцентов, совершенствования методов выращивания биомассы и выделения активных субстанций
При разработке технологии суммарных фитопрепаратов целесообразно максимально извлекать природный комплекс БАВ, характерный для данного лекарственного растения При существующих, далеко не всегда прогрессивных технологиях промышленного производства фитопрепаратов эффективность извлечения в ряде случаев достигает лишь 40-50% из-за недостаточности истощения сырья по различным группам действующих веществ
В связи с указанным, разработка эффективных способов получения дефицитных видов сырья методом культуры тканей и создание новых технологий фитопрепаратов представляет собой актуальную научно-практическую проблему, решение которой позволит внести важный вклад в развитие фармацевтической технологии и увеличить выпуск необходимых здравоохранению лекарственных средств
Цель и задачи исследования
Целью диссертационной работы явилось совершенствование технологии выращивания биомассы как источника БАВ методом культуры тканей и создание эффективных ресурсосберегающих способов переработки сырья в производстве лекарственных средств растительного происхождения
Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач
Изучить особенности питания, газообмена и изменений в структурной организации клеток растительных тканей и установить закономерности их влияния на продуктивность штаммов-продуцентов.
Разработать технологию целенаправленного обогащения биомассы растительных тканей биологически активными веществами, обеспечивающую получение высокопродуктивных промышленных штаммов
Оптимизировать параметры культивирования штаммов, гарантирующие их высокую продуктивность и стабильность в условиях промышленных производств
4. Усовершенствовать метод выделения и очистки индивидуальных БАВ из культуры растительных тканей на примере биомассы раувольфии змеиной, сырья для выделения аймалина, с целью получения эффективного ан-тиаритмика М(4)-пропилаймалиния бромида (NIIAB),
Научно обосновать и эксперименгально разработать способ экстрагирования ЛРС двухфазной системой экстрагентов, а также исследовать влияние природы и соотношений экстрагентов на процесс двухфазной экстракции для выделения комплекса БАВ
Изучить особенности и выявить закономерности экстрагирования БАВ из различных видов лекарственного растительного сырья и установить факторы, влияющие на эффективносгь процесса
Разработать технологические режимы комплексной переработки различных видов ЛРС и показать возможности практического использования метода двухфазной экстракции
На основании анализа теоретических и экспериментальных исследований разработать методологические основы создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения
Научная новизна
Впервые изучены особенности потребления компонентов питания при выращивании различных штаммов раувольфии на агаризованных и жидких питательных средах При этом установлена динамика их накопления в биомассе, что позволило осуществить направленную регуляцию биосинтеза алкалоидов путем дополнительного введения в среду компонентов питания
В результате проведения комплекса фотохимических и биотехнологических исследований получена суспензионная культура раувольфии змеиной Установленные маркерные признаки (физиологические, фотохимические, биохимические) позволили охарактеризовать культуру как штамм R-ІП Но-
визна выполненных разработок подтверждена авторским свидетельством на штамм
Разработан алгоритм получения высокопродуктивных клеточных линий и посевного материала культуры растительных тканей, заключающийся в отборе клонов с ускоренным ростом, что позволило, на примере культуры раувольфии змеиной выделить производственный штамм-продуцент (К-27) с увеличением содержания аймалина в 2,5 раза Определены основные фотохимические, цитологические и биохимические показатели, характеризующие штамм, составлен паспорт, и штамм депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений за коллекционным № ВСКК-ВР-30-87 Приоритет полученных результатов подтвержден авторскими свидетельствами на штамм и его способ получения
Впервые проведенные комплексные исследования позволили выявить взаимосвязь формирования анатомо-морфологической структуры клеточных компонентов с процессами дыхания и роста тканей растений и определить наиболее интенсивные периоды биосинтеза вторичных метаболитов в пассаже
В технологии фитопрепаратов теоретически и экспериментально обоснован новый способ комплексной переработки ЛРС, позволяющий на основе целенаправленного выбора экстрагентов в одной стадии извлекать сумму как липофильных, так и гидрофильных БАВ и существенно повысить эффективность технологических процессов и качество получаемых препаратов
Установлены общие закономерности и индивидуальные особенности процесса экстракции двухфазной системой экстрагентов (ДСЭ) различных видов сырья, отлргчающегося анатомо-морфологическим строением и природой БАВ (трава зверобоя и сушеницы, цветки календулы и ромашки, плоды рябины и шиповника, а также бурые водоросли)
Впервые изучено влияние состава ДСЭ на эффективность процесса экстракции С применением методов математического планирования эксперимента установлено, что наиболее значимыми факторами, влияющими на перенос липофильных веществ в масляную фазу при двухфазной экстракции, являются соотношение объемов водно-органической и масляной фаз и природа полярной фазы
Впервые установлена возможность использования липофильных суп-позиторных основ для извлечения БАВ из ЛРС в составе двухфазных систем экстрагентов и показано, что по экстрагирующей способности твердые жиры не уступают жидким растительным маслам
Впервые показана перспективность двухфазной экстракции ЛРС в присутствии поверхностно активных веществ (ПАВ) При этом установлено, что степень извлечения липофильных БАВ при экстракции ДСЭ зависит от значения гидрофильно-липофильного баланса и состава вносимой в систему смеси эмульгаторов, что позволяет, создавая определенное соотношение используемых ПАВ, осуществлять направленный процесс экстрагирования комплекса БАВ
Разработан алгоритм создания ресурсосберегающей технологии лекарственных средств растительного происхождения Предлагаемая методология обосновывает объединение всех этапов технологического процесса в единую цепь и может быть рекомендована как типовая
Практическая значимость
Предложена комплексная технология выращивания биомассы промышленного штамма-продуцента, оценки качества и последующей переработки с выделением субстанции БАВ, позволившая в дальнейшем разработать лекарственный препарат В производственных условиях на ХПХФО «Здоровье» (г Харьков) и НПК «Биофарм» (г Казань) доказана эффективность разработанной технологии, которая включена в регламент на производство биомассы раувольфии змеиной В настоящее время NTIAB из биомассы раувольфии змеиной (штамм ВСКК-ВР-30-87) разрешен Фармакологическим Комитетом к медицинскому применению и утверждена НД для его промышленного выпуска ФСП 42-0166-181701 на субстанцию NUAB (про-малин), ФС (Т) 42-0075-01 на МІАБ-стандарт и ФСП 42-0J 66-186801 на таблетки NIIAB (промалина) 0,02 г, покрытые оболочкой
Для совершенствования метода выращивания биомассы с использованием штамма К-27 впервые разработана технология его культивирования в полиэтиленовых пакетах В производственных условиях показана эффективность этого способа выращивания, позволяющая снизить себестоимость биомассы на 15%
В результате оптимизации процесса экстрагирования аймалина из биомассы и очистки ионообменным методом увеличен выход фармакопейного продукта на 24% по сравнению с экстракционным методом Установлена возможность использования технического аймалина для синтеза NITAE Из биомассы раувольфии змеиной наработан аймалин по ионообменной технологии и МТАБ Показатели качества полученных субстанций соответствовали требованиям НД Составлен лабораторный регламент на получение аймалина ионообменным методом
Разработана технология ресурсосберегающей комплексной переработки сырья с применением двухфазной системы экстрагентов (ДСЭ), позволяющая достигать 85-90% выхода липофильных БАВ, что в 2-8 раз больше, чем при моноэкстракции Выход гидрофильных БАВ составляет 60-70%, что сопоставимо с экстракцией водно-спиртовыми экстрагентами При этом длительность процесса экстракции сокращается в 1,5 -2 раза
Составлены типовые технологические схемы получения фитопрепаратов методом двухфазной экстракции Полученные этим методом масляные и водно-органические экстракты из различных видов ЛРС используются в промышленном производстве лечебной косметики (ХБО при РАН «Фирма «Вита», ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга»)
Разработана технология двухфазного экстрагирования ЛРС компонентами суппозиторных основ с получением жировых экстрактов с высоким содержанием липофильных БАВ, которые могут быть использованы как суппо-
зиторные массы Показано противовоспалительное действие жирового и вод-но-пропиленгликолевого экстрактов из смеси травы зверобоя, цветков ромашки и цветков календулы Составлены проекты ФСП на водно-пропиленгликолевый экстракт и на суппозитории на основе жирового экстракта из смеси ЛРС
Разработан новый метод комплексной переработки сухого сырья бурых водорослей экстракцией ДСЭ, позволяющий получать в одном технологическом процессе масляный экстракт, маннит и альгинат натрия Способ защищен патентом и используется на НПФ «Фаркос»
Установленные закономерности экстрагирования растительного сырья двухфазной системой экстрагентов используются в научно-исследовательской работе, проводимой на кафедрах технологии лекарств и фитопрепаратов Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПГХФА) и технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии (ПГФА)
Результаты выполненной работы используются в учебном процессе СПГХФА, ПГФА, Казанского государственного медицинского университета при изучении дисциплин «Биотехнология растительных тканей», «Химия и технология фитопрепаратов», «Фармацевтическая технология» и «Биотехнология» по специальностям 240901 «Биотехнология» и 060108 «Фармация», а также при обучении слушателей и интернов на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) СПГХФА
Результаты научных исследований использованы при подготовке учебных пособий «Биотехнология растительных тканей» СПб, 2003, «Химия и технология фитопрепаратов», М , 2004, рекомендованного УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования провизоров.
Практическое использование результатов работы подтверждено соответствующими публикациями и Актами о внедрении
Публикации
По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, из них 13 статей в журналах, рецензируемых ВАК, 4 авторских свидетельства СССР на изобретение и 1 патент РФ
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы прошли апробацию на Международной конференции «Культура растений и биотехнология» (Кишинев, 1983), Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (Новосибирск, 1988), Международного симпозиума «Проблемы и перспективы биотехнологии» (Братислава, 1989), Всесоюзной конференции «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток» (Новосибирск, 1991), научной конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1992), Международной конференции «Биология куль-
тивируемых клеток растений и биотехнология» (Алма-Ата, 1993), International Conference "Biotechnology St Petersburg'94", (Санкт-Петербург, 1994), научном семинаре «Фундаментальные основы диагностики состояния человека» (Санкт-Пегербург, 1994), Всероссийской научной конференции, посвященной 50-летию Академии медицинских наук «Актуальные вопросы медицины» (Москва, 1994), Всероссийской научной конференции «Химия и технология лекарственных веществ» (Санкт-Петербург, 1994), симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1999, 2004), Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997), Международной научно-практической конференции «Биологически активные вещества в косметике» (Москва, 1999), Международной конференции «Фармация в XXI веке инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999), Международном сьезде «Актуальные проблемы создания новых препаратов природного происхождения» (2000, 2002, 2003, 2004), Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), Международной научно-практической конференции, посвященной 85-легию СПХФА «Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» (Санкт-Петербург, 2004), научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (Санкт-Петербург, 2004), IX Международном съезде «Фитофарм 2005» (Санкт-Петербург, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), Межрегиональной конференции Пятигорской фармацевтической академии (Пятигорск, 2004, 2005,2006)
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Исследования проводились в соответствии с планами НИР СПГХФА по проблеме «Фармация»
Работы по совершенствованию технологии биомассы раувольфии змеиной и созданию противоаритмических препаратов на ее основе являлись частью исследований, выполняемых по целевой комплексной программе «Биотехнология» (№ roc per О Ц 043), утвержденной Госпланом, ГКНТ и АН СССР
Объем и структура диссертации
Современное состояние и перспективы заготовки лекарственного растительного сырья
Лекарственным растительным сырьем (ЛРС) для производства фитопрепаратов служат различные части растений: почки, листья, цветки и соцветия, плоды и семена, корни и корневища, луковицы, кора [303]. В действующую ГФ XI включены 83 частные статьи на ЛРС, которое используется для получения фитопрепаратов [90, 201]. Сырьевая база для производства фитопрепаратов формируется из нескольких источников: заготовка сырья из дикорастущих лекарственных растений; заготовка из культивируемых лекарственных растений; закупка по импорту. Большая часть ЛРС собирается путем промышленной заготовки дикорастущих и культивируемых растений. С началом рыночных реформ в нашей стране в период 1991-1999 г.г. произошло резкое изменение товарной структуры в пользу дикорастущего сырья, доля которого за этот период увеличилась с 51,79 % до 83,17 % [107]. В номенклатуру заготавливаемых дикорастущих лекарственных растений входит до 160 видов, однако только около 30 видов, включая эфиромасличное сырье, составляет максимальную часть заготовок. В это ЛРС входят: трава череды, пустырника, плоды шиповника, боярышника, рябины, листья березы, толокнянки, брусники, побеги черники, багульника и ДР Поставку культивируемого ЛРС на внутренний рынок осуществляют около 40 специализированных совхозов, акционерных обществ, крестьянских и фермерских хозяйств. В настоящее время выращивается около 60 видов ЛРС (наперстянка, ромашка, ноготки, мята, зверобой, шалфей и др.). На долю акционерных обществ и государственных предприятий приходится более 80 % рынка, крестьянские и фермерские хозяйства формируют около 8 %, остальное количество ЛРС предлагают товарищества, кооперативы и т.п. В среднем каждый из поставщиков предлагает на рынок 3-5 наименований сырья, при этом монопольные производители отдельных видов ЛРС отсутствуют [305]. Преимущественно культивируются те виды ЛРС, которые не произрастают в России (паслен дольчатый, дурман индейский, амми большая и зубная и др.), имеют ограниченный ареал произрастания или трудно заготавливаются в природе (красавка, женьшень, валериана и др.) [322]. В перечень импортируемых видов ЛРС входит сырье тропических растений или видов, не произрастающих на территории России (семена строфанта, семена чилибухи и др.). Однако, следует отметить четкую тенденцию к снижению доли импортируемых видов ЛРС в общем объеме заготовок. Если в 50-х годах она составляла более 40 %, то в 90-х годах уменьшилась до 8 % [180].
Не случайно в последние годы в Росси прекращен выпуск ряда препаратов, главным образом индивидуальных, производство которых осуществлялось из сырья, поставляемого из зарубежья [352]. Так дефицит коры корней и корневищ раувольфии, растительного сырья, поступавшего в нашу страну по импорту в недостаточном количестве и нерегулярно, не позволил наладить промышленный выпуск высокоэффективного препарата противоаритмического действия -промалина. В настоящее время на рынке ЛРС номенклатура и объем предложений практически по всем видам сырья ниже складывающего спроса [50,107]. Как видно из приведенных в табл. 1.1 данных, практически во всех отраслях народного хозяйства наблюдается устойчивый рост потребностей в ЛРС. Проблему бесперебойного обеспечения химико-фармацевтической промышленности ЛРС можно решить с помощью метода культуры изолированных органов, тканей и клеток растений [397,447,453]. Главными преимуществами культивируемых in vitro растительных клеток перед интактными растениями являются: изолированность от влияния различных факторов внешней среды, таких как климатические и географические условия произрастания, повреждение вредителями, исключение попадания пестицидов и др., четкость системы производства продукта в заданные сроки и в необходимых количествах для обеспечения рынка; высокий выход и стабильное качество продукции (возможность быстрого получения достаточного количества сравнительно однородной биомассы в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания; возможность синхронизации процессов клеточного деления роста и дифференцировки; применение принципов непрерывного культивирования; возможность регулирования процессами роста и метаболизма клеток) [45,46,62,117,141,254,333,340,368,452 ]. К настоящему времени на основании значительного объема информации установлено, что практически все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, стероиды, гликозиды, терпеноиды и др.) синтезированы изолированно выращиваемыми клетками растений. Перечень соединений, идентифицированных в культурах клеток растений, представленный в табл. 1.2, свидетельствует об огромном синтетическом потенциале и разнообразии вторичного метаболизма в изолированных тканях [25,62,183,185,253,299,327,340,452,456,474,481,492,521]. Особую ценность представляют штаммы, так называемые суперпродуценты, способные к синтезу индивидуальных вторичных метаболитов в количествах, значительно превышающих их содержание в интактных растениях, что очень важно для развития и повышения эффективности технологического процесса. К настоящему времени только для меньшей части из многочисленного перечня растений, введенных в культуру получены штаммы-суперпродуценты, приведенные в табл. 1.3. Как правило, получаемые на стадии введения в культуру, неорганизованно пролиферирующие каллусные и суспензионные культуры характеризуются низким содержанием синтезируемых БАВ, примерно на порядок ниже, чем в заготавливаемом органе растения. Для преодоления этого свойства культур in vitro, значительно ограничивающего применение их как продуцентов существует ряд подходов. Одни из них связаны с регуляцией процессов роста и биосинтеза на физиологическом уровне путем оптимизации условий культивирования, использовании предшественников биосинтеза, элиситоров, создания стресса [65,255,460,473,521].
Условия проведения электронно-микроскопического анализа
Измельченное растительное сырье экстрагировали спирто-водными и водно-органическими смесями различной концентрации. Соотношение сырье : экстрагент, как правило, составляло 1:10. Экстракцию проводили методом мацерации при нагревании и периодическом перемешивании. В случае использования спирто-водных экстрагентов процесс проводили на водяной бане в колбе с обратным холодильником. Температура и время экстрагирования варьировались. Смесь охлаждали, отжимали через капроновое сито, затем извлечение фильтровали через бумажный фильтр. К навеске измельченного растительного сырья прибавляли масла или жиры соотношении 1 : 10. Экстракцию проводили методом мацерации при нагревании и периодическом перемешивании. Время и температура процесса варьировались. Навеску измельченного растительного сырья заливали спирто-водным (водно-органическим) экстрагентом до зеркала, перемешивали и оставляли для набухания в течение 120 минут. По истечении этого времени добавляли оставшееся количество спирто-водного экстрагента и масляный или жировой экстрагент. Экстракцию проводили методом мацерации при нагревании и периодическом перемешивании. В случае использования в качестве полярной фазы спирто-водных экстрагентов процесс проводили на водяной бане в колбе с обратным холодильником. Температура и время экстракции, а так же соотношение сырье : спирто-водный экстрагент: масляный экстрагент варьировались. Затем смесь охлаждали до температуры 45-50С, отфильтровывали через капроновое сито в делительную воронку и разделяли на масляную и спирто-водную фазы. В случае ДСЭ, содержащих твердые жиры, извлечения разделяли после затвердевания жировой фазы. Время расслоения фаз, в зависимости от системы экстрагентов и природы экстрагируемого сырья, составляло от 5 до 25 минут. В качестве полярной составляющей двухфазной системы экстрагентов использовали воду очищенную, пропиленгликоль (ПГ), диметилсульфоксид (ДМСО), полиэтиленгликоль (ПЭГ) 400, этиловый спирт, а также их водные растворы. В качестве неполярной - масла: соевое, оливковое, вазелиновое. В качестве ПАВ использовали моноглицериды дистиллированные (МГД), ланолин, твин-80, оксиэтилированные высшие жирные спирты (препарат ОС-20), в различных соотношениях. В колбу вместимостью 50 мл помещали навеску сырья, ингредиенты экстракционной системы в соответствии с планом опыта. Экстракцию проводили методом мацерации при нагревании на водяной бане при 70-80 С в течение 1,5 часов при перемешивании. Затем смесь охлаждали до t 40 С, фильтровали и отжимали через капроновое сито № 69 и разделяли фазы, время расслоения фаз 5-10 мин. Навеску измельченного растительного сырья заливали органическим экстрагентом в соотношении 1 : 10. Экстрагировали в течение 30 минут в колбе с обратным холодильником на водяной бане при температуре кипения растворителя. Вытяжку отфильтровывали через бумажный фильтр. Сырье с фильтра количественно переносили обратно в колбу, заливали свежим экстрагентом в соотношении 1 : 5 или 1 : 10 (в зависимости от степени набухания сырья) и вновь экстрагировали в тех же условиях. Повторяли до тех пор, пока не получали практически бесцветную вытяжку. Фильтраты объединяли. Навеску измельченного сырья массой 5-10 г (точная навеска) загружали в аппарат Сокслета, заливали органическим экстрагентом до зеркала, оставляли для смачивания и набухания в течение 60 минут. Затем доливали экстрагент до уровня сифонной трубки и вели процесс экстракции до тех пор, пока в экстракторе не накапливалось практически бесцветное извлечение. В спирто-водных вытяжках травы зверобоя, цветков ромашки, цветков календулы, в спирто-водных вытяжках смеси этих видов сырья, в водно пропиленгликолевых, водно-полиэтиленгликолевых и ДМСО-извлечениях из травы зверобоя и сушеницы определяли флавоноиды; в спирто-водных вытяжках из травы зверобоя и смеси травы зверобоя, цветков ромашки и цветков календулы, в водно-пропиленгликолевых, воднополиэтиленгливолевых и ДМСО-извлечениях из трав зверобоя обнаруживали антраценпроизводные. В спирто-водных вытяжках плодов шиповника, рябины и их смеси определяли наличие аскорбиновой кислоты.
Изучение влияния физиологических процессов клеток растительных тканей на их продуктивность
Известно, что образование биологически активных веществ, в том числе и алкалоидов, приурочено к определенным фазам клеточного цикла [46,186]. Установление и стабильное поддержание большей части клеточных популяций именно на этих фазах роста может открывать большие возможности для получения так называемых сбалансированных культур, клетки которых синхронно выполняют свои биологические функции [254]. Для таких культур реально направленное регулирование процессами биосинтеза, а также проведение технических расчетов, необходимых для проектирования промышленного культивирования. Кроме того, данные об особенностях поведения клеток в изолированной культуре, о возможной зависимости продуктивности штамма от его анатомо-физиологических особенностей необходимы для исследования с целью повышения продуктивности клеточных линий и штаммов культур тканей.
При этом, научный и практический интерес представляет проведение обширных исследований, направленных на изучение особенностей процессов роста и развития клеток растений, культивируемых in vitro, и установления закономерностей их влияния на пути биосинтеза и накопления БАВ при комплексном использовании электронно-микроскопических и биохимических методов анализа. Следует отметить, что работ в указанном направлении сравнительно немного [170,187,339]. Так, для культуры тканей раувольфии змеиной таких исследований не проводилось. Известно, что каждая клетка в процессе своего развития потребляет питательные вещества из внешней среды. Процесс проникновения веществ через плазмалемму должен удовлетворять различным, подчас противоположным требованиям. Во-первых, должно быть обеспечено проникновение в ткани воды и питательных веществ из среды. Во-вторых, должна быть предотвращена потеря клеткой необходимых ей веществ в результате так называемой обратной диффузии. И, в-третьих, необходимо, чтобы процесс поступления веществ мог происходить против градиента концентрации, для этого требуется затрата энергии, как правило в форме АТФ [169,250,300].
Темновое дыхание является основным процессом, обеспечивающим энергией клетки культур изолированных тканей [80,343]. Дыхание тесно связано как с углеводным, так и с азотным обменом в клетке и, следовательно, ее ростом. По данным исследователей, именно дыхание представляет собой средство оценки подвижности метаболизма [334,335, 336, 337].
Освобождающаяся при дыхании энтальпия используется для образования АТФ. Передвижение питательных веществ, происходящее за счет освобождающейся в процессе обмена веществ энергии, называют активным (метаболическим) транспортом, в отличие от пассивного, не требующего затраты энергии.
Нарушение снабжения клеток энергией приводит к приостановке активного транспорта, влияющего на продуктивность культур. С другой стороны, в процессе жизнедеятельности клеточных культур морфофизиологические изменения затрагивают практически все структурные уровни организации клеток. При этом ультраструктурные перестройки, происходящие в достаточно короткие промежутки времени, свидетельствуют о лабильности клеточных компонентов и тесной взаимосвязи между структурой и функцией клеточных органелл.
С целью выявления физиологических закономерностей развития тканей растений, которые определяли бы наиболее интенсивные этапы биосинтеза БАВ, нами, на примере культуры раувольфии змеиной, определены особенности потребления компонентов питания, процессов дыхания, а также изменения в структурной организации клеток [148,156].
Изучены особенности потребления ионов Са, К, Mg, N в аммонийной и нитратной форме, фосфат и сульфат ионов, являющихся важными структурными элементами белков, нуклеиновых кислот, липоевой кислоты, кофермента А и др. коферментов, и, таким образом, участвующих в процессах дыхания, обмена и синтеза метаболитов. Установлено, что динамика их потребления носит нелинейный характер.
Определена практически противоположная зависимость в потреблении ионов К и Са. В первые 21-28 сут. интенсивно потребляется К и незначительно Са. В последующем Са начинает интенсивно поглощаться, а К вымывается из биомассы, уменьшение калия в биомассе соответствует интенсивному синтезу БАВ (рисунок 3.1).
Согласно литературным данным, в растениях К в наибольшем количестве накапливается в молодых делящихся клетках, Са - в стареющих клетках и органах, при этом он взаимодействует с кальциевым внутриклеточным рецептором белка кальмодулином и активизирует процессы метаболизма, в том числе и синтеза алкалоидов [203]. Для растений рода раувольфии отмечено, что в период созревания плодов, количество Са в листьях возрастало, а К — уменьшалось. Именно в это время в коре корней накапливается наибольшее количество алкалоидов [408,514].
Для культуры раувольфии змеиной, установленные особенности потребления К и Са согласуются с динамикой митотической активности клеток и накопления алкалоидов (рисунок 3.1). Именно в первые 20-28 сут. наблюдается интенсивное деление клеток, а после 40 суток - начинается синтез алкалоидов.
Следовательно, прослеживается сходство влияния процессов питания на синтез алкалоидов в растениях и изолированных тканях, а также закономерность в обмене ионов клетками с окружающей средой.
Методы поддерживающего отбора штаммов продуцентов БАВ
Использование клеток растений продуцентов БАВ может быть промышленно реализовано только в том случае, если они будут обладать стабильной продуктивностью, гарантирующей стандартность биомассы, как лекарственного растительного сырья. Поэтому необходимым является не только увеличение продуктивности культур, но и ее сохранность на достигнутом уровне. Однако, поскольку изменчивость популяций является характерной особенностью клеточных культур [399], потеря селектируемого признака (высокой продуктивности) весьма вероятна при длительном культивировании из-за отбора малопродуктивных, но более жизнеспособных клеточных линий. Поэтому, чтобы сохранить биосинтетическую активность штаммов, следует проводить постоянный поддерживающий отбор при выращивании их в коллекции, интенсивность которого определяется стабильностью селектируемых признаков. Взаимосвязь роста и биосинтеза вторичных метаболитов в культуре клеток может иметь большое значение для сохранения стабильной продуктивности в клеточных линиях и штаммах при длительном субкультивировании. Для ряда культур показано, что рост и уровень биосинтеза связан обратной корреляцией, что создает определенные трудности при выборе критерия для селекции [265,299,509]. В большинстве работ отмечается параллельное увеличение для штаммов-продуцентов массы клеток и содержания БАВ [114,252]. Поскольку наибольший вклад при селекции штаммов-продуцентов играет не интенсификация роста, а суперсинтез целевого метаболита, для оценки культур был введен также показатель «продуктивность» - содержание искомого вещества не на единицу массы клеток, а на биомассу, полученную в определенном объеме питательной среды [308]. искомого вещества не на единицу массы клеток, а на биомассу, полученную в определенном объеме питательной среды [308]. При получении штамма К-27 был разработан и успешно использован поддерживающий отбор по признаку «скорость роста», который, как нами было установлено, прямо связан с уровнем накопления алкалоидов. Этот метод, гарантирующий стабильность штамма, был включен в регламент на производство биомассы [309]. Однако, для массового отбора посевного материала и поддержания тканей в коллекции в промышленных условиях был разработан экспресс-метод на основании результатов изучения процессов дыхания штамма. В основу метода положен отбор культур с ускоренным ростом по величине массы остатка питательной среды в первые 7-10 суток выращивания, что соответствует наибольшей интенсивности дыхания культуры на единицу биомассы (см. раздел 3.2.3). Указанный метод позволил уменьшить длительность стадии отбора посевного материала в 4 раза и сократить период наработки биомассы на 7 суток (рисунок 4.3). - продуктивность штамма К-27 до поддерживающего отбора; 2 - продуктивность штамма К-27 в результате поддерживающего отбора развития культуры в пассаже. Установлено, что штамм характеризуется устойчивой высокой продуктивностью, что указывает на его соответствие требованиям, предъявляемым к промышленным продуцентам (рисунок 4.4). Таким образом разработка способа поддерживающего отбора культуры в коллекции позволила получать биомассу со стандартными показателями, несмотря на выявленный нами высокий уровень гетерогенности клеточной популяции и генетической изменчивости [266]. Применение такого отбора, как свидетельствуют наши данные и результаты выращивания культуры в промышленных условиях на ХПХФО «Здоровье», обеспечивает стабильную продуктивность штамма в течение десятков лет. О высоком уровне стабильности отселектированного штамма К-27 свидетельствуют также исследования, проводимые в Институте молекулярной биологии и генетики АН Украины и Казанском Университете, в результате которых было установлено, что данная культура практически не меняет свою продуктивность в ответ на действие различных стрессовых факторов [58,190].
