Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1.Липосомы как системы доставки противоопухолевых препара тов 15
1.1.1.Состав липосомальных везикул 18
1.1.2.Технологические приемы получения липосом 20
1.1.3 Основные характеристики липосомальных препаратов 24
1.1.4. Распределение липосомальных препаратов в организме 26
1.2. Препараты из класса 1Ч-алкил-]Ч-нитрозомочевин 31
1.2.1.Противоопухолевые препараты созданные на основе нитрозоалкимоче вины (зарубежные) 32
1.2.2. Отечественные представители из класса АНМ 35
1.2.2.1. Метилнитрозомочевина 35
1.2.2.2. 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина 36
1.2.2.3. Араноза 38
1.2.2.4.Лизомустин 42
Заключение 55
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования
2.1.Технологические методы, используемые при разработке липосомальных лекарственных форм лизомустина и БХНМ 59
2.1.1. Методика получения многослойных стерически стабилизированных липосом БХНМ 62
2.1.2 Методика получения многослойных стерически стабилизированных ли посом лизомустина з
2.1.3. Методика получения многослойных стерически стабилизированных липосом лизомустина для лиофилизации 64
2.1.4. Методика получения малых однослойных липосом БХНМ и лизомустина 65
2.1.5. Методика сублимационной сушки липосомальной дисперсии лизомустина 65
2.2.2. Химико-фармацевтические методы, используемые при разработке ли посомальных лекарственных форм БХНМ и лизомустина 66
2.2.2.1. Метод лазерной спектроскопии рассеивания для определения размера липосомальных дисперсий лизомустина и БХНМ 66
2.2.2.2. Разработка методики количественного определения БХНМ в липосомальных лекарственных формах 67
2.2.2.3. Применение метода тонкослойной хроматографии для анализа БХНМ в липосомах 73
2.2.2.4. Разработка методики количественного определения лизомустина в липосомальных лекарственных формах 77
2.2.2.5.Определение эффективности включения лизомустина в свежеприго товленные липосомы 81
2.2.2.6.Определение количества свободного не включенного лизомустина в липосомы 82
2.2.2.7.Разработка методики количественного определения лизомустина в липосомах после лиофилизации 84
2.2.2.8.Определение эффективности включения лизомустина в липосомы по сле лиофилизации 85
2.2.2.9. Применение метода тонкослойной хроматографии для анализа лизо мустина в липосомах 86
2.2.2.10. Определение степени окисления липидов липосом БХНМ и лизо мустина 91
2.2.3. Биологические методы изучения противоопухолевой активности, ис пользуемые при разработке липосомальных лекарственных форм БХНМ и лизомустина 92
2.2.3.1. Характеристика лейкоза L-1210 92
2.2.3.2. Характеристика карциномы легкого Льюис 93
Заключение 94
ГЛАВА 3 Обоснование и разработка липосомальной формы БХНМ и изучение ее биофармацевтических характеристик
3.1. Разработка состава и технологии получения многослойных и малых однослойных стерически стабилизированных липосом БХНМ 96
3.2. Химико-фармацевтический анализ липосом БХНМ 97
3.2.1.Определение размера липосом БХНМ 97
3.2.2.Количественное определение БХНМ в липосомах спектрофотометриче ским методом 98
3.2.3. Тонкослойная хромотография БХНМ в липосомах 99
3.2.4.0пределение степени окисления липидов липосом с БХНМ 103
3.3. Биологические исследования противоопухолевой активности липосо мальных форм БХНМ 105
3.3.1.Противоопухолевая активность липосомальных форм БХНМ на лейкозе L-1210 105
Заключение 109
ГЛАВА 4 Обоснование и разработка липосомальной формы лизомустина и изучение ее биофармацевтических характеристик
4.1. Разработка состава и технологии получения многослойных стерически стабилизированных липосом лизомустина 111
4.1.1. Получение малых однослойных липосом лизомустина 111
4.2. Химико-фармацевтический анализ липосом лизомустина 112
4.2.1. Определение размера липосом лизомустина 112
4.2.2.Определение количественного содержания лизомустина в липосомаль
ных формах 113
4.2.3. Определение эффективности включения лизомустина в липосомы...114
4.2.4. Определение количества не включенного в липосомы лизомустина..115
4.2.5. Тонкослойная хромотография липосомального лизомустина 118
4.2.6. Определение степени окисления липидов липосом с лизомустином..124
4.3. Биологические исследования противоопухолевой активности липосомальных форм лизомустина
4.3.1. Противоопухолевая активность липосомальных лекарственных форм лизомустина на лейкозе L-1210 130
4.3.2. Противоопухолевая активность липосом лизомустина на карциноме легкого Льюис 130
Заключение 132
ГЛАВА 5. Разработка технологии лиофилизации липосомальной дисперсии лизомустина 134
5.1. Выбор состава подлежащего высушиванию 135
5.2. Выбор режима замораживания и процесса сушки 136
5.3. Стандартизация липосом лизомустина после лиофилизации 138
5.4. Определение количественного содержания лизомустина в липосомах после лиофилизации 140
5.5.Определение эффективности включения лизомустина в липосомы после лиофилизации 141
5.6.Тонкослойная хроматография лиофильно-высушенных липосом лизомустина 142
5.7.Определение степени окисления липидов лиофильно-высушенных липосом с лизомустином 145
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 147
Общие выводы 149
L Список литературы
- Распределение липосомальных препаратов в организме
- Методика получения многослойных стерически стабилизированных ли посом лизомустина
- Биологические методы изучения противоопухолевой активности, ис пользуемые при разработке липосомальных лекарственных форм БХНМ и лизомустина
- Биологические исследования противоопухолевой активности липосомальных форм лизомустина
Распределение липосомальных препаратов в организме
Самый простой способ получения МСЛ - гидратация тонкой липидной пленки, полученной упариванием под вакуумом в роторном испарителе спиртовых (или других органических летучих растворителей) растворов ли-пидов. Эту операцию следует проводить при температуре выше температуры фазового перехода используемого липида. Если приготавливается смесь ли-пидов, температура гидратации должна превышать температуру фазового перехода наиболее высокоплавкого компонента смеси. В результате получают молочно-белые суспензии, содержащие МСЛ с большим разбросом размерности липосом, который зависит от интенсивности и продолжительности встряхивания пленки с водным раствором, его составом, ионной силой, величиной рН и т.п. Полученные липосомы выдерживают несколько часов до установления равновесия [82,98].
Получение малых однослойных липосом Известные методы приготовления МОЛ сводятся, в основном, к разрушению МСЛ с помощью: ультразвуковой обработки (озвучивание), мето 22 дов экструзии (через пресс Френча или ядерные фильтры) и гомогенизации, а также инъекцией эфирных или спиртовых растворов липидов в водную среду с последующим упариванием растворителя, диализом мицеллярных дисперсий, состоящих из липидов и детергента и т.п. Практически все новые методы производства липосом запатентованы, как, например, метод обращения фаз, получение стабилизированных плюриламеллярных везикул, метод сдвига рН, приготовление предшественников липосом и наконец получение сте-рических липосом, обладающих длительной циркуляцией в кровеносной системе [30,48, 77].
Метод озвучивания липосом
Для экспериментальных целей широко применяется метод получения МОЛ с помощью ультразвука (УЗ) погружением (металлического наконечника) источника УЗ непосредственно в суспензию МСЛ, хотя для фармацевтических технологий гораздо интереснее метод "наружного" озвучивания с помощью соникатора "банного" типа. Последний метод имеет ряд преимуществ, так как менее разрушает липиды, не приводит к образованию аэрозолей, загрязняющих атмосферу в рабочих помещениях, что особенно важно при работе с цитостатиками.
Озвученные МОЛ неоднородны по размерам поэтому целесообразно для увеличения гомогенности суспензии использовать фильтрацию через мембраны заданного размера. Озвучиванием невозможно заключить в липо-сомы вещества, изменяющиеся под действием ультразвука, например, белки [77,78].
Экструзионный метод
Метод заключается в продавливании дисперсии МСЛ через прибор с узким отверстием (пресс Френча) или поликарбонатные ядерные фильтры при повышенном давлении. После двух экструзий через пресс Френча выход МОЛ составляет 95 %. Для фильтрации через ядерные мембраны наиболее простое оборудование LiposoFast выпускается канадской фирмой Avestin, Inc. После 19 про-давливаний получаются МОЛ с довольно узким распределением по размерам. [79, 80, 82, 123].
Метод инжекции
Разрушения липидов удается избежать приготовлением липосом методом впрыскивания в водную среду раствора фосфолипидов в летучем органическом растворителе с последующим его упариванием. В данном случае размер липосом сильно зависит от концентрации используемых фосфолипидов и соотношения органической и водной фаз. Для образования МОЛ необходимо, чтобы концентрация липида не превышала 40 мМ, а конечная концентрация, например, 95 % этилового спирта должна быть не более 7,5% [99].
Для стандартизации методик можно до некоторой степени варьировать скоростью впрыскивания и перемешивания, а также концентрацией липидов в органическом растворителе.
Основной недостаток метода в том, что липосомы могут содержать остаток растворителя, и при использовании этой технологии получаются разбавленные липосомальные дисперсии [108, 112].
Детергентный диализ
Для получения МОЛ особый интерес представляет стандартизованный метод "детергентного диализа", который использован фирмой "Dianorm-Gerate" в приборах Lipoprep и Liposomal МОЛ образуются спонтанно при удалении детергента из водной смеси детергента и фосфолипидов. Диаметр полученных липосом колеблется от 15 до 300 нм, в зависимости от природы детергента и используемых липидов. Разработанная аппаратура позволяет получать от нескольких миллилитров до сотни литров липосомальной суспензии в день. Для освобождения от детергента используется диализ, хотя в результате часть детергента всегда удерживается и при анализе лекарствен 24 ных препаратов следует вводить специальный контрольный тест для характеристики этого нежелательного остатка [53, 54]. Гомогенизация под давлением
В этом варианте диспергируемые компоненты продавливаются через микрощель из области высокого в область нормального атмосферного давления. Процессы диспергирования, гомогенизации или дезинтеграции осуществляются за счет резкого падения давления и действия гидродинамических сил турбулентного потока, возникающих в области микрощели [53, 54]. Обращения фаз Одним из технологических приемов получения липосом считается так называемый метод "обращения фаз". При этом с помощью УЗ получают эмульсию типа вода/масло, используя раствор липидов в органическом растворителе и водный раствор препарата. После удаления под вакуумом растворителя образуются БОЛ с размером 0,2 -0,8 мкм и с объемом водной фазы 10-12 мкл на 1 мкмоль липидов. Способ достаточно прост, пригоден для осуществления в укрупненных масштабах и в стерильном исполнении, хотя воздействие УЗ может привести к химической деградации липидов и препаратов [79, 80].
Методика получения многослойных стерически стабилизированных ли посом лизомустина
Данный препарат недостаточно хорошо изучен как в предклинических, так и в клинических исследованиях. БХНМ-лио проявляет высокий противоопухолевый эффект в отношении ряда солидных опухолей, и лейкозов. БХНМ в дозе 35-40 мг/кг /48х однократно вызывает 100% излечение животных с L-1210 и Р-388, а так же имеет выраженный высокий показатель торможения роста опухоли, который при Са-755 составил 89-54 %, LLC - 85-89 %, В-16 - 93-66 %. В экспериментальных исследованиях препарат высокоэффективен при опухолях мозга. По эффектам БХНМ ничем не хуже, а в некоторых случаях даже превосходит зарубежные аналоги (BiCNU) и таким образом, является интересным противоопухолевым препаратом [68,69,70].
В ГУ РОНЦ РАМН синтезировали серию углеводсодержащих 1-метил-1-нитрозо-мочевин, изучили их распад под действием щелочных агентов и сравнили их противоопухолевую активность в эксперименте на животных. Среди всех изученных гликозил-АНМ араноза является наиболее активной и она одна среди аналогичных соединений нашла клиническое применение. Араноза представляет собой 3-( -арабинопиранозил-1)-1 -метил-1- нитрозо-мочевину [51]. НО ОН NH О -N NO СН3 Эмпирическая формула: C7Hi3N306. Молекулярная масса: 235,20 Другие З-гликозил-1-метил (или 2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины (содержащие остаток D-глюкопиранозы, D-рибофуранозы и др.) обладают значительно более низкой противоопухолевой активностью в эксперименте и более выраженной токсичностью [61,35].
Физико-химические свойства
Аранозу получают конденсацией N-метилмочевины с L-арабинозой, образующаяся 3-а-Ь-арабинопиранозил-1-метилмочевина при последующем нитрозировании образует 3-а-Ь-арабинопиранозил-1-мочевину (аранозу) с хорошим выходом.
В слабощелочных условиях или при нагревании араноза претерпевает внутримолекулярное карбамоилирование с образованием N О -карбонил-ос-L-арабинопиранозиламина, газообразного азота, и метанола. Важно отметить, что в отличие от распада МНМ, опасный диазометан (CH2N2) в этих условиях при распаде аранозы не образуется, что подтверждено методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Этот важный фактор в значительной степени определил возможность наработки аранозы для клинических испытаний и организации ее производства [35,43].
Алкилирующая активность аранозы и 1-метил-1-нитрозомочевины в эксперименте in vitro практически одинаковы, карбамоилирующая активность по сравнению с МНМ резко снижена. Это демонстрирует отсутствие корреляции между карбамоилирующей и противоопухолевой активностью АНМ и хорошо согласуется с образованием продукта внутримолкулярного карбамоилирования в условиях in vitro и in vivo. Т.е араноза обладает сни 40 женной карбомоилирующей активностью, сохраняя при этом высокий уровень алкилирования биомакромолекул, коррелирующий с высоким уровнем противоопухолевой активности при умеренной токсичности [16,17,61].
По механизму действия араноза является активным индуктором одиночных разрывов ДНК в клетках лейкоза L1210. Она ингибирует ДНК-полимеразу-а и индуцирует образование большого числа Об-метилгуаниновых аддуктов. Механизм резистентности связан с повышением 06-метилгуанин-трансферазной активности, что является одним из факторов, приводящих к снижению цитотоксического эффекта препарата в клинике [16,17,51,60].
Разработка лекарственной формы аранозы
При создании лекарственной формы аранозы разработаны подходы, на основе которых создана методология разработки лиофильно-высушенных лекарственных форм химически нестойких соединений [34,41,66].
Зависимость терапевтического эффекта аранозы от способа введения определена биологическим методом на перевиваемых опухолях мышей (L1210, Р388, Са755, АКАТОЛ). Установлено, что наибольший противоопухолевый эффект аранозы проявляется при инъекционном пути введения. При подкожном и внутримышечном введениях наблюдается местно-раздражающее действие (отёк, некрозы). В связи с этим для разработки лекарственной формы рекомендован в/в способ введения препарата [59,60,61].
Для получения стабилизированного, стерильного раствора аранозы, пригодного для лиофилизации, рекомендован следующий состав: араноза - 0,5 г; поливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский (М.м. 12600 ± 2700) - 0,5 г; кислота сорбиновая - 0,004 г [35,36,43,44].
Биологические методы изучения противоопухолевой активности, ис пользуемые при разработке липосомальных лекарственных форм БХНМ и лизомустина
Для хроматографии применили стеклянные камеры размером 205x145x145 мм с притертой крышкой, систему растворителей спирт н-бутиловый : кислота уксусная : вода (12:3:5). Хроматографию проводили на пластинах "Silufol UV-254" размером 15 х 15 см. Наиболее четкое разделение компонентов без диффузии пятен наблюдалось при длине пробега 11-12 см. С целью предотвращения краевого эффекта по всей длине камеры укладывали полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченную системой растворителей. В качестве детекторов использовали УФ-свет с длиной волны 254 нм, пары йода и раствор нингидрина.
Приготовление раствора нингидрина. 0,3 г нингидрина растворяют в 100 мл спирта н-бутилового и добавляют 3 мл кислоты уксусной. Приготовление йодной камеры. 3 г йода погружают на дно камеры, смачивают спиртом этиловым 95 %. Приготовление стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС): 1.СОВС-1 - 1 % раствор рабочего стандартного образца (РСО) субстанции лизомустина: в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,100 г (точная навеска) субстанции лизомустина и доводят объем водой для инъекций до метки, тщательно перемешивают (раствор А). Раствор используют свежеприготовленный. 2.СОВС-2 - липосомы, не нагруженные препаратом, получают по методике, описанной в главе 2, разделе 2.2.2.4 в "Приготовление раствора сравнения". Раствор используют свежеприготовленный. З.СОВС-3 - 3 % спиртовой раствор лецитина: в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,300 г (точная навеска) лецитина и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовл енный. 4.СОВС-4 - 0,28 % спиртовой раствор холестерина: в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,028 г (точная навеска) холестерина и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный. 5.СОВС-5 - 0,9 % спиртовой раствор кардиолипина: в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,8 мл 0,5 % спиртового раствора кардиолипина (0,009 г) и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный. 6.СОВС-6 - 0,7 % спиртовой раствор PEG 5000 DSPE: в мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,0074 г PEG 5000 DSPE и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный. 7.СОВС-7 - 0,01 % раствор лизомустина: 1 мл раствора А РСО лизому-стина (СОВС-1) переносят количественно в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки. Раствор используют свежеприготовленный. 8.СОВС-8 - 0,03 % раствор лизомустина: 3 мл раствора А РСО лизомустина переносят количественно в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки. Раствор используют свежеприготовленный. Приготовление модельных смесей: Модельная смесь №1 (лизомустин с кардиолипином): 0,100 г (точная навеска) лизомустина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл водой для инъекций, туда же добавляют 1,8 мл (0,009 г) кардиолипина и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный.
Модельная смесь № 2 (лизомустин с холестерином): 0,100 г (точная навеска) лизомустина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл водой для инъекций, туда же добавляют 0,0028 г (точная навеска) холестерина и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный. Модельная смесь №3 (лизомустин с лецитином): О Л 00 г (точная навеска) лизомустина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл водой для инъекций, туда же добавляют 0,300 г (точная навеска) лецитина и доводят объем спиртом этиловым 95 % до метки, тщательно перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный.
Приготовление образцов проб для хроматографического анализа:
Проба свежеприготовленных липосом лизомустина. К 1 мл свежеприготовленных липосом лизомустина (с концентрацией лизомустина в липосомах 1 %) прибавляют 1 мл 95 % этилового спирта, перемешивают.
Проба лиофильно-высушенных липосом лизомустина. Содержимое одного флакона лиофильно-высушенных липосом лизомустина растворяют в 2 мл воды для инъекций и интенсивно встряхивают. К 1 мл раствора лиофильно-высушенных липосом лизомустина (с концентрацией лизомустина в липосомах 1 %) прибавляют 1 мл 95 % этилового спирта, перемешивают.
Подготовка хроматографической пластины №1
На линию старта хроматографической пластинки "Silufol UV-254" размером 15x15 см, на расстоянии 1,5 см от края и 2 см друг от друга, микропипеткой наносят пробы: свежеприготовленной липосомальной и раствора лиофильно-высушенной липосомальной лекарственной формы лизомустина в количестве 20 мкл (100 мкг лизомустина). Рядом микропипеткой наносят пробы СОВС-1 в количестве 10 мкл (100 мкг лизомустина), СОВС-2 -10 мкл (344 мкг, суммарное количество липидов), СОВС-3 - 10 мкл (300 мкг), СОВС-4 -10 мкл (28 мкг) и СОВС-5 - 10 мкл (9 мкг).
Подготовка хроматографической пластины №2
На линию старта хроматографической пластинки "Silufol UV-254" размером 15x15 см микропипеткой наносят последовательно следующие пробы: СОВС-1 - 10 мкл (100 мкг лизомустина); СОВС-2 - 10 мкл (344 мкг, суммарное количество липидов); 20 мкл (100 мкг лизомустина) свежеприготовленной липосомальной лекарственной формы лизомустина и пробы модельных смесей с № 1 по № 3 - в количестве 10 мкл (100 мкг лизомустина). Подготовка хроматографической пластины №3 На линию старта хроматографической пластинки "Silufol UV-254" размером 15x15 см последовательно наносятся пробы: СОВС-3 - 10 мкл (300 мкг); СОВС-4 - 10 мкл (28 мкг); СОВС-5 - 10 мкл (9 мкг); СОВС-6 - 10 мкл (7,4 мкг) и СОВС-2 - 10 мкл (344 мкг, суммарное количество липидов).
Время между началом приготовления растворов лизомустина и началом хроматографирования не должно превышать 30 мин.
Хромотографические пластинки с нанесенными пробами подсушивают на воздухе в течение 10 мин, помещают в камеру со смесью растворителей спирт н-бутиловый : кислота уксусная : вода (12:3:5) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителя достигает 12 см, пластинки вынимают из камеры, подсушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителей.
Хроматографическую пластинку №1 первоначально просматривают в УФ-свете, а затем пластинку опрыскивают раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре от 105 до 110С в течение 5 мин. Хроматографическую пластинку №2 просматривают первоначально в УФ свете, а затем проявляют парами йода. Хроматографическую пластину №3 помещают в камеру, насыщенную парами йода, и выдерживают в течение 1-2 мин.
Проверка пригодности хроматографической системы:
На линию старта хроматографической пластинки "Silufol UV-254" размером 15x15 см последовательно наносятся пробы: свежеприготовленной липо-сомальной лекарственной формы лизомустина в количестве 20 мкл (100 мкг лизомустина); СОВС-1 - 10 мкл (100 мкг лизомустина); СОВС-7 - 5 мкл (0,5 мкг лизомустина); СОВС-8 - 5 мкл (1,5 мкг лизомустина). Хроматографическую пластинку опрыскивают раствором нингидрина и нагревают в сушильном шкафу при температуре от 105 до 110С в течение 5 мин. Результаты представлены в главе 4.
Биологические исследования противоопухолевой активности липосомальных форм лизомустина
Добавление криопротекторов таких как маннит, лактоза или сахароза в водную фазу липосомальной дисперсии (внутри и снаружи) перед замораживанием с последующей сублимацией позволяет предупредить фазовое разделение липиднои композиции и предохранить инкапсулируемое лекарство от вытекания и сохранить способность липосом к регидратиции [166]. Другие соединения, применяемые в качестве криопротекторов: глицерин, пролин, диметилсульфоксид и декстран не обнаружили достаточно значимых защитных свойств. При выборе криопротектора важно учитывать возможность влияния углеводного компонента на стабильность композиции липидов в бислое [136,173].
В задачу нашего исследования входило изучение и разработка некоторых технологических параметров сублимационной сушки липосом лизому-стина состава ЛЛФ-5000, т.к. данный состав липосом оказался наиболее эффективным при изучении противоопухолевой активности на экспериментальных моделях опухолевого роста.
В связи с этим возникла необходимость определения оптимального состава, подлежащего высушиванию, проведение подбора криопротекторов, установки режима замораживания и сушки, а также изучение влияние всего технологического процесса на конечный продукт.
В качестве криопротекторов при проведении лиофильной сушки использовали лактозу, сахарозу и маннит в определенном весовом соотношении подобранным экспериментальным путем. Методика приготовления ли-посомальных дисперсии лизомустина (МСЛ) для лиофилизации описана в главе 2, разделе 2.1.3.
Первая стадия сублимационной сушки - замораживание является важной операцией. От того, насколько правильно она проведена, зависит внешний вид высушенного продукта, остаточная влажность, скорость и полнота растворения готового продукта. Для липосомальных препаратов стадия замораживания может изменить размер везикул, разрушить бислой и высвободить внутрилипосомальное содержимое.
Для выбора температуры замораживания обычно определяют эвтектическую или криогидратную температуру, характерную для каждого химического вещества, позволяющую обосновать уровень самых низких температур высушивания в период лиофилизации [44]. При эвтектической температуре весь раствор заморожен в ледяной блок, не должна оставаться не промороженная влага, так как при понижении давления произойдет вспенивание препарата. Однако для липосомальной дисперсии невозможно установить точку эвтектики, так как большое количество воды должно удерживаться в липид-ном слое, чтобы не разрушить мембрану.
Для изучения влияния замораживания на структуру лиофилизата липосомальную дисперсию разливали по 2 мл во флаконы емкостью 20 мл и замораживали на полке сублимационной сушки до -45 С в течение 3-х часов. После этого размораживали дисперсию при комнатной температуре и определяли средний диаметр липосом. Наиболее удобным параметром, определяющим изменения в дисперсионной системе, являлся размер липосом, который определяли до и после замораживания и лиофилизации. По изменению данного параметра делали вывод о том, как тот или иной криопротектор оказывал влияние на стабильность липосом. Полученные данные показали, что сахароза, лактоза и маннит защищают липосомальную мембрану от разрыва в процесе замораживания, размороженные липосомы практически не изменились в размере.
Далее проводили сублимацию на сублимационной установки Minifast D0.2 (Великобритания-Италия) в течение 24 часов. Высота слоя раствора со ставляла около 9 мм и позволяла охладить препарат с температуры +25 С до температуры полки -40С за 1 час.
Для определения полноты замораживания в сублимационной камере создавали небольшое разряжение до 60 Па, в случае появления изменений на поверхности ледяного блока давление в камере восстанавливали и продолжали замораживание на полке. Сублимационная сушка замороженного продукта состоит из двух стадий: 1 - основная сушка, возгонка или сублимация льда; 2 - досушивание или удаление связанной влаги при температуре выше 0С. Данные по эвтектической температуре или температуре промораживания слоя препарата в упаковке, сорбции или десорбции влаги препаратом, графика сушки и скорости изменения температур, конечной температуре досушивания и остаточной влажности в готовом продукте позволили разработать оптимальный экономичный процесс сушки. Так как путем прямых измерений получить всю необходимую информацию невозможно, применили метод наблюдения косвенных параметров, связанных определенной функциональной зависимостью с нужными величинами.
В первую очередь оценивали влияние температурного режима сушки на качество готового препарата: его внешний вид (цвет, пористость, однородность), физико-химические характеристики (скорость растворения или ресуспендирования, размер везикул и т.п.).
На основании проведенных исследований отработан оптимальный режим сушки 3,6 % липосомальной дисперсии лизомустина. Методика сублимационной сушки изложена в главе 2, разделе 2.1.5. График сублимационной сушки представлен на рис. 5.1. Далее определяли влияние технологического процесса на химико-фармацевтические характеристики лиофильно-высушенной липосомальной лекарственной формы лизомустина.
![Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс]](/i/i/4460/187655.png "Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс] Зверева Елена Юрьевна")
