Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Герпесвирусные инфекции, их клиническое проявление, лечение и профилактика . 8
1.2. Противовирусные лекарственные препараты. 18
1.3. Алпизарин и его использование в медицине. 20
1.4. Преимущества мягких лекарственных форм (МЛФ) на гидрофильных основах. 24
Заключение к главе 1. 29
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования. 30
2.1.1. Лекарственное вещество. 30
2.1.2. Вспомогательные вещества. 32
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Методы качественного и количественного анализа алпизарина. 36
2.2.2. Методы определения физико-химических и структурно-механических свойств геля и линимента алпизарина. 45
2.2.3. Изучение высвобождения действующего вещества. 48
2.2.4. Определение стабильности лекарственных форм. 49
2.2.5. Микробиологические исследования мягких лекарственных форм алпизарина. 50
2.2.6. Биологические исследования изучаемых мягких лекарственных форм . 51
Заключение к главе 2. 57
Глава 3. Разработка состава и технологии геля и линимента алпизарина
3.1. Экспериментально-теоретическое обоснование состава и технологии геля и линимента алпизарина. 59
3.1.1. Изучение растворимости алпизарина. 60
3.1.2. Разработка основы. 62
3.1.3. Зависимость влияния количества полимера на реологические показатели и структурную стабильность гелевой основы. 65
3.1.4. Влияние типа нейтрализующего агента на вязкость гелей Ареспола. 69
3.1.5. Изучение осмотической активности гелевых систем на основе Ареспола. 72
3.1.6. Изучение влияния количества масляной фазы на реологические показатели и структурную стабильность гелевой основы. 75
3.1.7. Изучение влияния эмульгатора на структурно-механические свойства эмульсионной основы Ареспола. 78
3.2. Разработка оптимального состава геля и линимента алпизарина 2 %. 79
3.3.Разработка технологии геля и линимента с алпизарином. 83
Заключение к главе 3. 87
Глава 4. Изучение полноты высвобождения, микробиологической чистоты, стабильности и общетоксического действия разработанных мягких лекарственных форм алпизарина
4.1. Изучение высвобождения алпизарина из МЛФ. 88
4.2.Микробиологическое исследование геля и линимента алпизарина 2 %. 91
4.3. Изучение стабильности геля и линимента алпизарина 2 % в процессе хранения. 93
4.4. Изучение общетоксического и противогерпетического действия МЛФ алпизарина . 102
Заключение к главе 4. 112
Заключение 114
Общие выводы 116
Список литературы 118
Приложение 134
- Герпесвирусные инфекции, их клиническое проявление, лечение и профилактика
- Биологические исследования изучаемых мягких лекарственных форм
- Разработка оптимального состава геля и линимента алпизарина 2 %.
- Изучение общетоксического и противогерпетического действия МЛФ алпизарина
Герпесвирусные инфекции, их клиническое проявление, лечение и профилактика
События последних десятилетий показывают, что в мире повсеместно и резко активизировались давно известные болезни, среди которых значительное место занимают заболевания вирусной этиологии. Угроза их настолько велика, что введен термин «Вновь возникающие старые инфекции».
Такое положение не ново. Еще в 1990 г. на сессии АМН прозвучало: «...сегодня всем следует преодолеть одно из заблуждений конца XX века — в том, что инфекционные болезни отошли на второй план, не играют значительной роли в патологии человека и не являются актуальной проблемой здравоохранения» [97,136].
Одной из самых распространенных вирусных инфекций человека является простой герпес (ВПГ) (синоним: простой пузырьковый лишай). По данным ВОЗ, около 90 % общей популяции населения земного шара инфицируются одним или несколькими штаммами герпесвирусов. В большинстве случаев первичное и повторное инфицирование происходит воздушно-капельным путем при прямом контакте или через предметы обихода и гигиены (общие полотенца, носовые платки и т.п.). Доказаны также оральный, генитальный, орогенитальный, трансфузионный, трансплантационный и трансплацентарный пути передачи инфекции [18,27,148].
Наибольшую угрозу для здоровья представляют герпетические нейроинфекции, летальность которых достигает 20%, а частота инвалидизации -50 %, офтальмогерпес (почти у половины больных приводит к развитию катаракты или глаукомы). Реальное число больных этими формами острых герпесвирусных инфекций в России не известно; полагают, что в стране ежегодно не менее 3 тыс. человек переносят герпетические нейроинфекции, 250-300 тыс. человек больны офтальмогерпесом, около 8 млн. - генитальным герпесом и 10- 12 млн. - герпесом іуб и кожи [85]. Слово «герпес» (от греч. "2PZT" - ползти) использовалось в медицине в течение 20 веков. Лихорадочный герпес («простуда») был описан римским врачом Геродотом в 100 г. до н.э.
Этиологическую роль ВПГ впервые установил W.Grutter (1912), обнаруживший вирус в жидкости герпетических пузырьков. В начале 20 века заболеванием успешно заражали кроликов [19].
Возбудитель заболевания - ВПГ (herpes simplex virus), представитель семейства Herpesviridae, является ДНК-геномным внутриклеточным паразитом.
Различают две основные антигенные группы ВПГ: I и II типа (ВПГ-І, ВПГ-И). Штаммы ВПГ-І чаще удается выделить при поражении кожи лица, верхних конечностей, штаммы ВПГ-П — при генитальной локализации очагов, хотя прямой связи междуантигенной специфичностью и локализацией клинических проявлений герпеса не обнаруживается [22,153,163].
Типичные герпесвирусы (вирионы, вирусные частицы) состоят из трех основных компонентов: нуклеоида, капсиды и белково-липидной оболочки. Нуклеоид (геном вируса) - это двунитчатая ДНК, располагающаяся в центральной части, заключающая в себе всю генетическую информацию, определяющую наследственность вируса [22]. Внутренняя плотная белковая оболочка с заключённой в ней нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК) называется капсидой. Капсиды состоят из белковых субъединиц - капсомеров, которые подобно своеобразному белковому "частоколу" окружает полость (сердцевину или ядро), в которой расположена нуклеиновая кислота. Капсомеры у вируса герпеса представляют собой полые шести- или пятигранные белковые призмы. Нуклеиновая кислота вирусов может находиться внутри капсида как в свободном виде, так и в соединении с белком, образуя так называемый нуклеоид, или нуклеокапсид.
Размножается ВПГ в ядре и цитоплазме инфицированных клеток и имеет 10 - 14-часовой цикл репродукции. При этом нуклеокапсид формируется в ядре, а оболочки вирионов — преимущественно в цитоплазме с участием мембранных структур (аппарата Гольджи, цитоплазматического ретикулума) инфицированных клеток [18,121].
Клонирование герпесвирусов происходит по следующей схеме: спонтанная случайная адсорбция исходного «материнского» вируса на поверхность клетки-мишени; «раздевание вириона» - расщепление оболочки и капсида; инфильтрация вирусной ДНК в ядро клетки-мишени; формирование и созревание «дочерних» вирионов путем почкования на ядерной мембране. В процессе создания «дочерних» вирионов, их оболочки, капсиды и ДНК формируются из имеющихся внутри инфицированной клетки аминокислот, белков, липопротеидов и нуклеозидов.
Эти молекулы поступают Б инфицированную клетку из межтканевых пространств по мере истощения внутриклеточных резервов. В этом отношении вирусы зависят от интенсивности внутриклеточного обмена, который, в свою очередь, определяется природой клетки-мишени [148].
Полностью сформированные и готовые к последующей активной репродукции «дочерние» инфекционные вирионы появляются внутри инфицированной клетки через 10 ч., а их число становится максимальным примерно через 15 ч. Вновь сформированные вирионы покидают клетку, разрушая ее оболочки, и частично адсорбируются на клетках окружающих тканей.
Известно, что количество вирионов в определенной мере влияет на темп распространения инфекции и площадь поражения. Через 24 часа вирусы методом почкования покидают клетку. Из - за повреждений клетка наполняется жидкостью и вскоре вирус гибнет. Одна клетка дает несколько миллионов вирусов. Из эпителиальной клетки на месте проникновения вирусы попадают в кровяное русло, приклеиваясь к эритроцитам и с кровью разносятся по всему организму. Второй путь распространения вирусов - по нервным волокнам. По чувствительным веточкам вирус попадает в нерв, где с током аксоплазматической жидкости проникает в чувствительные нейроны ганглиев крестцового сплетения. В нервных клетках вирус сбрасывает себя капсид и суперкапсид и «живет» в клетках в виде двуспиральнои молекулы ДНК. В таком состоянии иммунная система не в состоянии обнаружить вирус и удалить его из организма. В случае действия внешних факторов: алкоголь, стресс, травма, заболевание, приводящее к снижению иммунитета, вирус начинает размножаться в крестцовых ганглиях и с током аксоплазматической жидкости дрейфует в сторону половых органов. Где уже в эпителиальных клетках происходит рецидив инфекции [38,153].
ВПГ-инфекция может быть причиной спонтанных абортов, гибели плода и врожденных уродств [59,73]. С вирусом герпеса связывают возможность развития рака шейки матки и некоторых сердечно-сосудистых заболеваний. Источником инфекции могут быть не только больные герпесом, но и вирусоносители, не имеющие симптомов герпеса.
Биологические исследования изучаемых мягких лекарственных форм
Доклиническое изучение МЛФ алпизарина проводилось в лаборатории токсикологии ВИЛАРа.
Целью доклинических токсикологических исследований фармакологического средства является установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценка его безопасности.
Общепринятым является разделение токсикологических исследований на изучение общетоксического действия и исследование специфических видов токсичности (канцерогенность, мутагенность, аллергенность, эмбриотоксическое и тератогенное действие, влияние на иммунореактивность) [119,134,139].
Изучение общетоксического действия позволяет решить следующие задачи:
1. Определить переносимые и токсические дозы фармакологического средства.
2. Выявить наиболее чувствительные к изучаемому фармакологическому средству органы и системы организма, характер и степень патологических изменений в них, а также исследовать обратимость вызываемых повреждении.
3. Изучить зависимость токсических эффектов от дозы и длительности применения фармакологического средства.
Доклинические исследования включали изучение общетоксического действия геля и линимента алпизарина 2% и противогерпетической активности линимента алпизарина 2% в модельных опытах in vivo.
Изучение субхронической токсичности.
1. Методы исследования.
Исследования проводились на 15 кроликах породы Шиншилла исходной массой тела от 1,0 -2,5 кг. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. Для кормления использовали стандартный брикетированный корм и воду. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария естественное. Температура воздуха постоянная. Животные были разбиты на 3 группы по 5 особей в каждой. Первые 2 группы получали аппликации лекарственных форм алпизарина, 3-я группа служила контролем.
МЛФ алпизарина и его основу наносили животным ежедневно один раз в сутки в течение 3 месяцев на депилированный участок кожи кроликов, площадью 5x5 см в объеме 2 г на животное. Что соответствовало дозе 13 мг/кг (по основному действующему веществу). Кролики контрольной группы получали аппликации основы гидрогеля Ареспола. На протяжении хронического эксперимента у кроликов отмечали общее состояние, двигательную активность, аппетит, динамику роста массы тела, состояние шерстяного покрова кожи на месте нанесения МЛФ алпизарина.
Изучали физиологические функции.
1. Дыхание
- учащенное или замедленное, неспокойное, свистящее, хрипящее, затрудненное.
2. Слюновыделение
- водянистая или липкая слюна, недостаточное или избыточное слюновыделение.
3. Мочеиспускание
- количество, цвет мочи.
4. Экскрет
- цвет, качество.
II. Клинические исследования
1. Гематологические исследования
- определение содержания гемоглобина,
- определение количества эритроцитов и лейкоцитов,
- определение гематокрита,
- подсчет тромбоцитов,
- подсчет лейкоцитарной формулы.
2. Биохимические исследования
- определение активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансферез,
- определение активности щелочной фосфазы,
- определение общего белка,
- определение количества холестерина,
- определение количества сахара в сыворотке крови,
- определение содержания альбумина,
- определение мочевины.
Для гематологических исследований кровь брали из вены уха. Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали на приборе Лаборскель PSL1 фирмы Медикор. Гемоглобин определяли с помощью гемометра Сали. Для подсчета количества тромбоцитов и лейкоцитарной формулы использовали мазки крови, окрашенные по Романовскому-Гимза. Гематокрит определяли с помощью центрифуги ТН-21.
Биохимические исследования проводили с использованием стандартных наборов для определения сахара крови, АЛТ, ACT, ЩФ, холестерина, общего белка, альбумина, мочевины. Для патоморфологических исследований кусочки органов фиксировали в 10% формалине и затем обрабатывали материал по общепринятой методике.
Один раз в месяц проводили исследование морфологического состава периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина, гемограммы), определяли общий белок, общий холестерин, мочевину, глюкозу и активность ряда ферментов сыворотки крови (щелочная фосфатаза, аланин- и аспартаттрансаминазы).
Активность сывороточных ферментов - аланин- и аспартаттрансаминаз, а также мочевины и глюкозы определяли с помощью биохимических наборов фирмы «Диаком-ВНЦ МДЛ» (Россия), общий белок сыворотки крови - рефрактометрически на приборе RL-2, общий холестерин - применяя биохимический набор фирмы «Новохол» (Россия), щелочную фосфатазу с помощью набора фирмы «Lachema» (Чехия).
В течение хронического эксперимента проводилась оценка местного раздражающего действия геля и линимента. Основные признаки раздражения: шелушение, гиперемия, отёк, изъязвления, некроз.
Изучение противогерпетической активности линимента алпизарина.
В работе было использовано 19 кроликов породы Шиншилла с массой тела 1,0-2,5 кг. Для пассирования вируса простого герпеса и титрования вируса в материалах соскоба с роговицы инфицированных глаз кроликов были использованы белые нелинейные мыши с массой тела 6-8 г в количестве 70 особей обоего пола.
Для инфицирования использовали вирус простого герпеса 1 типа штамм «Коптев», обладающий кератотропными свойствами. Вирус пассировали путем внутримозгового заражения белых нелинейных мышей с массой тела 6-8 г (титр вируса 4,5 lg LD5o) и через роговицу кроликов.
Заражение кроликов вирусом простого герпеса проводили на скарифицированную роговую оболочку глаза по общепринятой методике. Перед заражением глаза кроликов анестезировали путем введения 1 % раствора дикаина в конъюнктивальный мешок. Затем глазное яблоко выводили из орбиты с помощью пинцета и фиксировали. Инъекционной иглой делали поверхностные насечки в центре роговицы в виде решетки до 5 мм в диаметре. На роговицу наносили вирус содержащий материал (10 % суспензия из мозга мышей, зараженных интрацеребралъно вирусом простого герпеса) в объеме 0,05 мл. Титр вируса составлял 4,5 lg LD50. Веки соединяли и слегка втирали вируссодержащую жидкость в роговицу. Заражение осуществляли в оба глаза и кроликов распределяли в группы для проведения химиотерапевтического эксперимента.
Разработка оптимального состава геля и линимента алпизарина 2 %.
При разработке состава геля и линимента алпизарина руководствовались следующими принципами: основа должна хорошо наноситься на кожу, легко смываться водой, обладать стабильностью, способностью легко воспринимать и высвобождать лекарственное вещество, а также иметь приятный внешний вид и консистенцию.
Установлено, что введение алпизарина в количестве 2 % от общей массы геля и линимента не оказывало влияния на значения вязкости и процессы структурообразования, которые определяются путем оценки ряда реологических параметров: касательного напряжения сдвига, эффективной вязкости, структурной стабильности, коэффициента динамического разжижения. Измерение реологических параметров осуществляли на ротационном вискозиметре "Reotest-2" типа RV (BRD). Расчет эффективной вязкости проводили по формулам, описанным в главе 2 .
На основании проведенных исследований гидрогелевых систем с Аресполом, описанных в предыдущих разделах, были предложены следующие составы мягких лекарственных форм алпизарина с учетом медико-биологических требований, предъявляемых современной медициной (таб.3.4.).
О составе можно сказать следующее: алпизарин используется в качестве лекарственного вещества, ПЭО-400 как растворитель алпизарина и осмотически активный компонент, кроме того, он обладает, согласно литературным данным, незначительной антимикробной активностью. Ареспол является структурообразующим компонентом - основой, натрия гидроксид и триэтаноламин добавляются в качестве нейтрализующих агентов образующегося кислого геля, вода I очищенная входит в состав основы для набухания полимера и образования геля. Для предохранения геля и линимента от микробной контаминации в состав вводили коьсервант нипагин. Консерванты являются ингибиторами роста тех микроорганизмов, которые попадают в лекарственные препараты в процессе их многократного использования. Они позволяют снизить бактериальное обсеменение лекарственной формы и предельное число непатогенных микроорганизмов в ней.
В состав линимента входит также масляная фаза (масло касторовое) как ранозаживляющий агент, неионогенный эмульгатор и диспергатор - твин-80 в количестве, соответствующем рекомендациям по их использованию.
Учитывая, что неионогенные ПАВ незначительно влияют на скорость высвобождения лекарственного вещества, нами в качестве ПАВ был использован твин-80. Твин-80 повышает коллоидную и термическую устойчивость препарата. Введение твина-80 в концентрации 1-2 %, как показали исследования, приводит к заметному улучшению стабильности и внешнего вида разработанных эмульсионных систем. Введение в состав линимента касторового масла обеспечило более мягкую консистенцию по сравнению с гелем и усилило ранозаживляющий эффект алпизарина.
С целью разработки оптимальной технологии производства геля и линимента алпизарина были изучены их структурно-механические свойства, которые исследовались по основным показателям: касательное напряжение сдвига и эффективная вязкость. Затем строили графики функциональной зависимости вязкости от скорости сдвига в логарифмических координатах (рис.3.11).
Сравнительно пологий ход логарифмических кривых указывает на слабое межмолекулярное взаимодействие структурообразующих сил. Из рисунка видно, что с увеличением скорости сдвига эффективная вязкость падает и такая зависимость подтверждает вывод о наличии структуры геля и линимента.
Для изучения тиксотропных свойств строили реограммы течения в системе координат: скорость сдвига-напряжение сдвига, (рис. 3.12 и 3.13).
Были получены кривые кинетики деформации геля и линимента алпизарина с узкими «петлями гистерезиса», что свидетельствует о малом времени релаксации напряжений и о слабом межмолекулярном взаимодействии. Характер кривых указывает, что исследуемые системы относятся к классу неньютоновских систем.
Присутствие восходящих и нисходящих кривых "петли гистерезиса" говорит о том, что исследуемые образцы обладают слабыми тиксотропными свойствами, на основании которых можно предполагать хорошую намазываемость, способность к выдавливанию из туб и высокую стабильность.
При проведении реологических исследований особый интерес представляло изучить изменения структурно-механических свойств образцов в двух диапазонах скорости деформирования (Dr): 3,0-5,4 и 27,0-145,8 с"1, так как, первый в среднем, соответствует реальной скорости движения ладони пациента по поверхности кожи при нанесении мягкой лекарственной формы, а второй соответствует в среднем скоростям технологической обработки МЛФ. Расчет проводили по формулам, описанным в главе 2.
Рассчитанные коэффициенты динамического разжижения 2 %-ного геля и линимента алпизарина с концентрацией Ареспола 1 % составили для геля: K JI = 39,74 и К г = 68,52 ; линимента: К ц = 31,6 и К 2 = 60,3, что, обеспечит качественное нанесение его под действием механического растирания и лучшее разжижение в режиме перемешивания. Согласно литературным данным коэффициенты динамического разжижения должны отличаться один от другого в 1,5- 2 раза, что свидетельствует о прочности структуры и обеспечивает наилучшие потребительские и технологические параметры мягких лекарственных форм.
Таким образом, разработанные гель и линимент алпизарина 2 % обладают оптимальными реологическими параметрами, т.е. легко выдавливаются из туб и равномерно наносятся на поврежденную поверхность кожи и слизистой, не препятствуют газообмену и обладают осмотической активностью, что благоприятно сказывается при лечении мокнущих кожных и слизистых поверхностей.
Изучение общетоксического и противогерпетического действия МЛФ алпизарина
Проведенные исследования показали, что нанесение на депилированный участок кожи кроликов МЛФ алпизарина не отражалось на общем состоянии и поведении животных. На месте нанесения геля и его основы на протяжении всего опыта не наблюдалось раздражения кожи. МЛФ алпизарина не влиял на динамику массы тела и ректальную температуру кроликов в течение всего хронического эксперимента.
Трехмесячное нанесение 2 % геля алпизарина на кожу не отражалось на морфологическом составе периферической крови кроликов. Количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и содержание гемоглобина у животных, получавших алпизарин было на уровне показателей в контроле и соответствовало физиологической норме для данного вида животных. При подсчете гемограмм количество различных форменных элементов крови - лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, как в опытной, так и контрольной группах существенно не различалось. В мазках крови не обнаружено каких-либо патологически измененных клеток по форме, величине, наличию патологических включений, восприятию краски (таб.4.12, 4.13).
Для изучения функционального состояния печени кроликов в условиях хронического эксперимента определяли биохимические показатели (общий белок, общий холестерин, мочевина, глюкоза) и активность ферментов сыворотки крови.
Как показали проведенные исследования, при накожном нанесении животным геля алпизарина не установлено влияния препарата на уровень общего белка, общего холестерина, мочевины, глюкозы, а также на активность щелочной фосфатазы, аланин- и аспартаттрансаминаз сыворотки крови, что может свидетельствовать об отсутствии у препарата общерезорбтивного действия.
При длительном применении исследуемого препарата существенно не изменялось состояние сердечно-сосудистой системы кроликов, о чем судили по записи электрокардиограмм во II стандартном отведении в конце хронического эксперимента.
При патогистологическом исследовании внутренних органов кроликов, проведенном в конце хронического эксперимента, и анализе их коэффициентов массы, не установлено каких-либо патологических изменений, связанных с побочным действием препарата.
Следует также отметить, что не зарегистрировано местно-раздражающее действие геля алпизарина при длительном нанесении на кожу экспериментальных животных.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что новая лекарственная форма алпизарина для наружного применения - гель хорошо переносится животными при длительном применении и не обладает обще-резорбтивным и местно-раздражающим действием.
Полученные результаты могут служить основанием для проведения клинических испытаний препарата в новых лекарственных формах.
В последние годы широко используется для лечения больных с герпетическими заболеваниями ацикловир (Зовиракс фирмы Glaxo Wellcome, Великобритания) в виде различных лекарственных форм (таблетки, кремы, мази, инъекционные формы).
Поэтому представляло интерес сравнить активность разработанного линимента алпизарина 2 % и препарата Зовиракса (крем ацикловира 5 % фирмы Glaxo Wellcome, Великобритания).
Для инфицирования использовали вирус простого герпеса 1 типа штамм "Коптев", обладающий кератотропными свойствами. Вирус пассировали путем внутримозгового заражения белых нелинейных мышей (титр вируса 4,5 lg LD5o).
В работе было использовано 19 кроликов породы шиншилла с массой тела 1,8-2,0 кг. Для пассирования вируса простого герпеса и титрования вируса в материалах соскоба с роговицы инфицированных глаз кроликов были использованы белые нелинейные мыши с массой тела 6-8 г в количестве 70 особей обоего пола.
Заражение кроликов вирусом простого герпеса производили на скарифицированную роговую оболочку глаза по общепринятой методике (глава 2). Перед заражением глаза кроликов анестезировали путем введения 1 % раствора дикаина в конъюнктивальный мешок. Затем глазное яблоко выводили из орбиты с помощью пинцета и фиксировали. Инъекционной иглой делали поверхностные насечки в центре роговицы в виде решетки до 5 мм в диаметре. На роговицу наносили вирус содержащий материал (10 % суспензия из мозга мышей, зараженных интрацеребрально вирусом простого герпеса) в объеме 0,05 мл. Титр вируса составлял 4,5 lg LD5o. Веки соединяли и слегка втирали вирусосодержащую жидкость в роговицу. Заражение осуществляли в оба глаза, а кроликов распределяли в группы для проведения химиотерапевтического эксперимента.
Для оценки экспериментальной инфекции учитывали типичную клиническую картину поражения глаз кроликов. После заражения, глаза животных систематически (раз в 2-3 дня) осматривали глаза с применением флюоресцеиновой пробы для выявления эрозии роговицы. В динамике оценивали основные признаки герпетического кератоконъюнктивита у инфицированных животных: величину инфильтрата и эрозии роговицы, развитие перикорнеальной инъекции сосудов глазного яблока, гиперемию конъюнктивы, отек и гиперемию век, васкуляризацию роговицы, а также признаки воспаления радужной оболочки. При оценке величины эрозии и инфильтрации роговой оболочки поражение до 25 % ее площади принимали за 1 балл, от 26 до 50 % - 2 балла, свыше 50 % - 3 балла. Далее вычисляли средний индекс клинического проявления кератита в каждой группе кроликов. Для этого суммировали баллы, характеризующие поражения всех зараженных глаз в группе, и делили на количество глаз. Сравнивая средние индексы клинического проявления кератита в группе леченых и контрольных животных, судили о действии изучаемого вещества на клиническое течение экспериментальной инфекции. Кроме того, вычисляли интегральный индекс клинического проявления кератита на каждый день наблюдения и делили на количество наблюдений. Различие величин интегрального индекса клинического проявления кератита в леченой группе животных и группе плацебо наглядно демонстрирует степень эффективности изучаемого соединения.
Помимо этого определяли длительность течения клинических симптомов заболевания у контрольных и леченых кроликов.
Активность препаратов оценивали по уменьшению тяжести клинических симптомов кератоконъюнктивита и укорочению сроков излечения экспериментального герпетического кератоконъюнктивита в группах леченых животных по сравнению с контрольными животными. Оценивали также влияние изучаемого препарата на репродукции вируса простого герпеса в клетках роговицы глаза леченых кроликов по сравнению с нелечеными. Для этого после предварительной анестезии 1 % раствором дикаина собирали материал с поверхности инфицированных глаз (4глаза) стерильными марлевыми тампонами. Тампоны погружали в стерильные пробирки с 1 мл физиологического раствора с добавлением пенициллина (5000ед.) и стрептомицина (1000 ед.). Из вирусосодержащей жидкости готовили серию последовательных десятикратных разведений. Полученным материалом заражали мышей в мозг (на каждое разведение не менее четырех мышей). Далее наблюдали за развитием герпетического энцефалита у мышей, который заканчивался гибелью животных. Титр вируса выражали в lg LD5o Лечение кроликов начинали при клинически выраженном кератите через 72 часа после инокуляции вируса на роговицу глаза кроликов. Аппликации проводили 2 раза в день (утром и вечером) до выздоровления животных. При изучении противогерпетической активности линимента алпизарина использовали три группы животных: в качестве контроля группа без лечения; группа, получавшая линимент; и группа, получавшая препарат сравнения - зовиракс. Группа контроля содержала по 6 инфицированных глаз, группа, получавшая линимент алпизарина -8 глаз.
В предварительных экспериментах на интактных кроликах была изучена переносимость линимента алпизарина, плацебо и зовиракса (по 4 глаза на препарат). Препарат наносили на роговицу 2 раза в день с интервалом в 7 часов в течение десяти дней. Ежедневно проводили визуальный осмотр с использованием флюоресцеиновой пробы.
Таким образом, исследования показали, что линимент алпизарина и зовиракс не оказывают местнораздражающего действия на интактных животных.
Терапевтическое действие МЛФ алпизарина в сравнении с плацебо и зовираксом было изучено на 26 глазах кроликов, инфицированных вирусом простого герпеса. Лечение начинали через 72 часа после инокуляции вируса на скарифицированную роговицу глаз, когда у кроликов развивались характерные клинические симптомы кератоконъюнктивита: инфильтрация и точечные эрозии роговицы, гиперемия конъюнктивы, слабая перикорнеальная инъекция сосудов глазного яблока. Аппликации изучаемых препаратов проводили два раза в день с интервалом в 7 часов в течение десяти дней.
