Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современная характеристика инфузионных препаратов 13
1.1 Кровь и система кровообращения человека 13
1.1.1 Функции и свойства крови 12
1.1.2 Кровообращение при кровопотере 14
1.2 Плазмозамещающие растворы 16
1.2.1 Характеристика плазмозамещающих растворов и особенности терминологии 16
1.2.2 Требования к плазмозамещающим растворам 17
1.2.3 Современная классификация плазмозамещающих растворов 20
1.3 Обзор компонентов для создания полифункционального препарата, обладающего гемодинамическими и антиоксидантными свойствами 26
1.3.1 Гемодинамические компоненты препарата 26
1.3.1.1 Желатин 26
1.3.1.2 Декстран 29
1.3.1.3 Оксиэтилированный крахмал 31
1.3.1.4 Полиэтиленгликоль З 3
1.3.2 Фармакологически активный компонент препарата 34
1.4 Факторы, влияющие на качество инфузионного препарата 39
1.4.1 Свойства вещества и условия хранения 39
1.4.2 Первичная упаковка 40
1.4.3 Метод стерилизации 41
1.5 Стандартизация многокомпонентных инфузионных лекарст венных препаратов 42
ГЛАВА 2 Объекты и методы 43
2.1 Объекты исследования 43
2.1.1 Желатин 43
2.1.2 Полиэтиленгликоль - 20 000 43
2.1.3 Янтарная кислота 43 2 Л .4 N-метилглюкамин 44
2.1.5 Натрия гидроксид 44
2.1.6 Натрия хлорид 45
2.1.7 Калия хлорид 45
2.1.8 Магния хлорид 6-водный 45
2.1.9 Натрий углекислый 45
2.2 Методы исследования 46
2.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 46
2.2.2 Потенциометрия 47
2.2.2.1 Потенциометрическое титрование 47
2.2.3 Осмометрия 47
2.2.4 Определение молекулярной массы 48
2.2.4.1 Гельпроникающая (эксклюзионная) хроматография 49
2.2.4.2 Вискозиметрия 52
2.2.5 Атомно - эмиссионная спектрометрия 55
2.2.6 Молекулярная спектроскопия 56
2.2.7 Титриметрия 56
2.2.8 Статистическая обработка результатов анализа 56
2.2.9 Валидация аналитических методик 56
2.2.10 Биологическое исследование длительности волемического действия 57
ГЛАВА 3 Разработка состава и технологии препарата 58
3.1 Разработка состава препарата 58
3.1.1 Выбор гемодинамического компонента 5 8
3.1.1.1 Выбор концентрации желатина 60
3.1.1.2 Выбор концентрации полиэтиленгликоля-20 000 62
3.1.2 Определение содержания ионов в препарате 64
3.2 Изучение свойств компонентов, влияющих на показатели качества препарата Реоплазмин 66
3.2.1 Изучение свойств желатина 66
3.2.2 Изучение влияния осмолярности солей янтарной кислоты на величину осмолярности препарата
3.3 Разработка технологии препарата 72
3.3.1 Технология состава содержащего желатин 72
3.3.1.1 Технология модификации желатина. Выбор гидроли-зующего агента 73
3.3.1.2 Выбор агента осаждающего ионы кальция и магния из раствора желатина 80
3.3.1.3 Вывод формул для расчета количества загружаемых компонентов при приготовлении раствора препарата 83
3.3.1.4 Порядок загрузки компонентов при приготовлении раствора препарата Реоплазмин-G 84
3.3.1.5 Выбор метода стерилизации 85
3.2.1.1 Технологическая схема производства состава Реоплазмин-G 88
3.3.2 Технология состава содержащего ПЭГ-20 000 89
3.3.2.1 Порядок загрузки компонентов 89
3.3.2.2 Выбор метода и режима стерилизации, рекомендации по просмотру на механические включения 90
3.3.2.3 Технологическая схема производства состава Реоплаз-мин-PEG 92
Выводы по главе 3 94
ГЛАВА 4 Разработка методик стандартизации изучаемых составов препарата
4.1. Определение молекулярной массы желатина 97
4.1.1 Определение коэффициентов уравнения Марка - Куна - Хау-винка 97
4.1.1.1 Определение коэффициентов уравнения Марка - Куна -Хаувинка для расчета средневесовой молекулярной массы 103
4.1.1.2 Определение коэффициентов уравнения Марка - Куна -Хаувинка для расчета среднечисловой молекулярной массы 103
4.1.2 Вывод формул для расчета средних молекулярных масс 104
4.1.2.1 Расчет средневесовой молекулярной массы 104
4.1.2.2 Расчет среднечисловой молекулярной массы 106
4.1.3 Расчет степени полидисперсности желатина 107
4.1.4 Результаты валидации методики определения молекулярной массы желатина 108
4.1.4.1 Сходимость 108
4.1.5 Методика определения молекулярной массы модифицированного желатина 109
4.2 Разработка методики количественного определения желатина 110
4.2.1 Результаты валидации методики количественного определения модифицированного желатина 116
4.2.1.1 Избирательность 116
4.2.1.2 Правильность 116
4.2.1.3 Сходимость 117
4.2.2 Методика количественного определения желатина в составеРеоплазмин - G 117
4.3 Разработка методики количественного определения янтарной кислоты и N-метилглюкамина в составах Реоплазмин-G и Рео-плазмин-PEG 118
4.3.1 Результаты валидации методики количественного определения янтарной кислоты и N - метилглюкамина 124
4.3.1.1 Избирательность 124
4.3.1.2 Правильность 125
4.3.1.3 Сходимость 126
4.3.2 Методика количественного определения янтарной кислоты и 6 N-метилглюкамина
4.4 Изучение стабильности препарата Реоплазмин при хранении 130
4.5 Выбор состава препарата Реоплазмин, раствор для инфузий 139 Выводы по главе 4 141
Выводы 143
Список литературы 145
Приложения
- Обзор компонентов для создания полифункционального препарата, обладающего гемодинамическими и антиоксидантными свойствами
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
- Изучение свойств компонентов, влияющих на показатели качества препарата Реоплазмин
- Результаты валидации методики количественного определения модифицированного желатина
Введение к работе
Актуальность темы
Спасение пациента в условиях острой массивной кровопотери является важнейшей задачей инфузионно-трансфузионной терапии. Тяжесть состояния организма при кровопотере связана с накоплением продуктов жизнедеятельности тканей, развитием гипоксии и нарушением метаболизма. Основой современных методов коррекции этих изменений является восстановление объема жидкости внеклеточного пространства, показателей гемодинамики и восстановление системы клеточного дыхания. С этой целью, наряду с введением гемодинамических коллоидных плазмозаменителей (на основе декстрана, оксиэтилированного крахмала, желатина или полиэтиленгликоля), в программу инфузионной терапии включают солевые растворы, обладающие антигипоксическим эффектом.
В качестве антигипоксантов в инфузионно-трансфузионной терапии используют соли янтарной и фумаровой кислот. И сукцинат, и фумарат являются субстратами цикла Кребса, но в условиях гипоксии только сукцинат позволяет сохранить энергосинтезирующую функцию митохондрий и снижает концентрацию в крови других интермедиатов цикла (В.Н. Лузиков, 1980). Натриевая соль меглу-мина сукцината применяется в составе препарата Реамберин. Антигипоксическое действие данной соли доказано при проведении клинических исследований (А.Л. Коваленко и др. 1999; М.Г. Романцов и др., 2000).
Включение солевых растворов в программу лечения шоков увеличивает объем вливаемой жидкости и может привести к развитию отека легких. Поэтому современным направлением инфузионно-трансфузионной терапии является использование препаратов, сочетающих свойства и коллоидных и солевых растворов, что делает актуальным их разработку.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является выбор состава, разработка технологии производства и методик стандартизации инфузионного лекарственного пре-парата Реоплазмин.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Осуществить выбор гемодинамического компонента лекарственного препарата;
Обосновать количественный состав компонентов препарата;
Изучить свойства выбранных компонентов с точки зрения влияния на показатели качества препарата;
Разработать и экспериментально обосновать технологию производства инфузионного препарата;
Разработать и валидировать методики стандартизации препарата;
Определить срок годности инфузионного препарата;
На основании полученных результатов разработать нормативную документацию на данный лекарственный препарат (проект фармакопейной статьи предприятия и лабораторный регламент производства).
Научная новизна Изучен качественный и количественный состав ионов, присутствующих в желатине. Разработана оригинальная меіЩИКЦ М^ІИШ^&Угі&ЗЙР1 и У008" лены оптимальные параметры процесса.
"Я&СІ
БИБЛИОТЕКА С. Пете «Э
Установлены коэффициенты уравнения Марка-Куна-Хаувинка, определяющего эмпирическое соотношение между характеристической вязкостью и средней молекулярной массой желатина. Полученные значения коэффициентов используются при расчете средних молекулярных масс.
Разработана оригинальная методика количественного определения N- ме-тилглюкамина и янтарной кислоты в препарате.
Разработаны, теоретически и экспериментально обоснованы состав и технология оригинального инфузионного препарата комплексного действия Реоплазмин на основе ПЭГ-20 000.
Практическая значимость работы
Обоснован состав препарата Реоплазмин и разработана технология его производства.
Разработанные методики количественного определения компонентов использованы в проекте ФСП на препарат.
Разработан и утвержден лабораторный регламент производства препарата Реоплазмин, раствор для инфузий.
На защиту выносятся:
1. Результаты исследований по разработке состава и технологии инфузионньгх
препаратов комплексного действия:
на основе желатина (Реоплазмин-G);
на основе полиэтиленгликоля-20 000 (Реоплазмин - PEG);
-
Результаты изучения физико-химических свойств желатина и разработки технологии его модификации;
-
Результаты изучения влияния осмолярности солей янтарной кислоты на величину осмолярности препарата;
-
Разработанная методика определения молекулярной массы модифицированного желатина в препарате;
-
Разработанные методики количественного определения компонентов препарата;
-
Экспериментальные данные по изучению стабильности и установлению сроков годности препарата Реоплазмин, обоих составов.
Апробация материалов диссертации
Результаты диссертационной работы доложены на 3-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2002), X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003), 4-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2003), Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2004), 5-й Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2004), 5-й научной конференции "Аспирантские чтения-2004" (Самара, 2004).
Публикация результатов исследования.
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно - исследовательских работ Научно - технологической фармацевтической фирмы "Полисан" (г. Санкт-Петербург).
Объем и структура диссертации
Обзор компонентов для создания полифункционального препарата, обладающего гемодинамическими и антиоксидантными свойствами
Раствор желатина был первым плазмозамещающим раствором, предложенным для лечения шока и кровопотерь [62]. Первые сообщения о применении на людях растворов желатина появились в 1915 году [107, 171].
По своей природе желатин является денатурированным белком, полученным из коллагенсодержащих тканей скота в результате ступенчатой тепловой и химической обработок [107]. Кислотная обработка применяется для получения желатина из кожи свиньи, щелочная для обработки любого другого коллаген-содержащего сырья [16]. В России применяется желатин, полученный щелочной обработкой.
Типичный аминокислотный состав желатина, приведенный Т. Lepold, представлен в таблице 1.4 [157].
Желатин не содержит незаменимую аминокислоту триптофан.
Водные растворы желатина имеют большую вязкость и при температуре ниже 40 С превращаются в гель, что делает их непригодными для непосредственного внутривенного вливания [46]. Из-за этого недостатка проводят модификацию желатина перед его введением в состав плазмозамещающего препарата для уменьшения молекулярной массы и тем самым, понижения точки геле-образования. При гидролизе желатина молекулярная масса молекул уменьшается и достигается более низкая температура гелеобразования. Но что бы получить раствор желатина с концентрацией 5 %, не образующий гель при температуре 0 С необходимо достичь средней молекулярной массы желатина ниже 18 000. Такой желатин очень быстро выводится из кровяного русла и не оказывает гемодинамического эффекта. По этой причине были предприняты попытки модифицировать молекулу желатина таким образом, чтобы она сохранила высокую молекулярную массу, позволяющую оказывать стабильный осмотический эффект, и в то же время имела низкую температуру гелеобразования [168]. Современная классификация модифицированных желатинов, используемых для производства инфузионных растворов, выделяет три типа: тиожелатин, оксипо-лижелатин, сукцинированный желатин. Желатин сшитый мочевиной (тиожелатин) получают межцепочным связыванием полипептидов из желатина, каждый из которых имеет среднюю молекулярную массу 12 000 - 15 000, с применением в качестве катализатора гек-саметилдиизоцианата.
Полученный тиожелатин имеет среднюю молекулярную массу 24 500. Разветвленные пептидные цепи значительно понижают точку гелеобразования растворов желатина до 3 С, но сохраняют осмотический эффект [46, 171].
Оксиполижелатин - окисленный продукт полимеризации желатина с гли-оксалем, имеет точку гелеобразования растворов в пределах 10 С - 13 С [46].
Сукцинированный желатин получают из желатина с относительной молекулярной массой цепочек от 15 000 до 36 000. Желатин модифицируют проведением реакции с ангидридом янтарной кислоты.
При этой модификации не происходит поперечной сшивки, и молекулярная масса молекул остается неизменной. Вследствие того, что основная (-NH2) группа замещается кислотной группой, достигается более низкая изоэлектриче-ская точка при соответствующем увеличении свободного отрицательного заряда. Заряд изменяет конформацию цепочек желатиновых молекул, закручивая в спирали те из них, которые были раскрыты. Это значительно увеличивает их время удерживания в системе кровообращения. Точка гелеобразования данного желатина (0 - 4) С [46, 171, 173].
Препараты на основе сукцинированного желатина увеличивают объем циркулирующей крови, что приводит к увеличению венозного возврата и сердечного выброса, повышению артериального давления и улучшению перфузии периферических тканей; вызывают осмотический диурез и этим обеспечивают поддержание функции почек при шоке; снижают вязкость крови, улучшают микроциркуляцию. Благодаря своим коллоидно-осмотическим свойствам они предотвращают или снижают вероятность развития отека межклеточного пространства. Эффект замещения объема сохраняется в течение 5 часов [102].
Согласно фармакокинетическим исследованиям препаратов на основе модифицированного желатина, после введения желатин не накапливается в организме. Его основная часть выделяется через почки, около 10 - 15 % выводится через кишечник, а оставшийся желатин расщепляется тканевыми протеина-зами и метаболизируется в организме благодаря протеолитическим ферментам [46, 128].
Препараты на основе желатина не обладают большой длительностью объемозамещающего эффекта, так как оказывают его не за счет связывания воды, а за счет высокого коллоидно-осмотического давления [107]. Существуют противоречивые данные по влиянию растворов желатина на систему свертывания крови. По одним данным эти препараты безопасны в отношении влияния на гемостаз [128], другие исследователи сообщают, что они влияют на агрегацию тромбоцитов [11, 146].
С начала применения декстрана как гемодинамической основы для плаз-мозамещающих растворов в мировой медицинской практике прошло более 60 лет. В России первые работы по созданию препарата на основе декстрана были проведены в Ленинградском НИИ гематологии и переливания крови в 1952 году [62, 107].
Декстран - водорастворимый высокомолекулярный полимер глюкозы, являющийся продуктом жизнедеятельности бактерий Leuconostoc mesenteroides. Декстран имеет большую линейную молекулу с ветвлениями, в которой глюкозные единицы соединены главным образом а-1,6, а так же а-1,4, а-1,3 (незначительное число) и а-1,2 связями. Для получения плазмозамещаю-щих растворов гемодинамического действия используют декстран, содержащий не менее 90 % а-1,6 связей, т.е. имеющий разветвленную структуру [62].
Растворы нативного декстрана непригодны для использования в качестве плазмозамещающего компонента, так как они создают недостаточное осмотическое давление, слишком вязки, обладают токсичностью и изменяют иммуно-реактивные свойства организма. Молекулярная масса нативного декстрана составляет (1-30)" 10 . Для возможности внутривенного введения и для уменьшения негативного влияния нативного декстрана на организм, его частично гид-ролизуют, выделяют среднемолекулярную фракцию, которую очищают и используют для приготовления препаратов.
Одним из способов модификации нативного декстрана является его частичный гидролиз у-радиацией с последующим фракционированием.
Для производства инфузионных препаратов используются среднемолеку-лярный декстран с молекулярной массой 50000-70000 и низкомолекулярный декстран с молекулярной массой 30000-40000, описанные в европейской и американской фармакопеях [145, 171].
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Качественное и количественное определение N-метилглюкамина и янтарной кислоты было проведено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Выбран оптимальный вариант данного метода - ион-парная обращенно-фазовая ВЭЖХ. Ион-парная хроматография - это жидкостная хроматография, в которой подвижная фаза содержит сорбируемое ионогенное вещество (ион-парный реагент) и разделение смеси веществ происходит за счет различия способности веществ к образованию ионных пар и (или) коэффициентов распределения ионных пар между подвижной и неподвижной фазами [104].
Суть метода заключается в динамическом модифицировании обращенно-фазового сорбента группами, обладающими ионообменными свойствами. Для этих целей в типичные подвижные фазы для обращенно-фазовой хроматографии добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами. Для разделения оснований используют алкилсульфаты или алкилсульфона-ты натрия (алкил от С4 до Сіг) в количестве 0,001 - 0,01 моль/л, создавая буферным раствором рН 2 - 5. В ион-парном режиме селективность разделения неионогенных компонентов анализируемой пробы ограничивается обращенно-фазовым механизмом удерживания, а удерживание оснований заметно возрастает, улучшается форма их хроматографических пиков [105, 106, 115, 153].
Удерживание в ион-парном режиме обусловлено достаточно сложными равновесными процессами, конкурирующими между собой. С одной стороны, поверхность сорбента может приобретать ионообменные свойства и в этом случае удерживание подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. С другой стороны, возможно образование ионной пары непосредственно в объеме элюента, затем эта пара сорбируется на неполярной поверхности по об-ращенно-фазовому механизму [134].
Количественное определение N-метилглюкамина и янтарной кислоты проводили на приборе SCL-10A vp с рефрактометрическим детектором RID-10А (Shimadzu, Япония). В основе потенциометрического метода лежит зависимость потенциала электрода от концентрации определяемого иона [ПО]. Различают прямую и косвенную потенциометрию или потенциометрическое титрование [47, 95].
Метод прямой потенциометрии был использован для определения рН. Определение проводили на приборе Acidimetr 333 (Druoma Praha, Чехословакия) в соответствии с требованиями ГФ XI.
Зависимость равновесного потенциала индикаторного электрода от состава раствора можно использовать для нахождения конечной точки титрования. Потенциометрическим титрованием определяли количественное содержание полиэтиленгликоля - 20 000 в разрабатываемом препарате.
Для проведения потенциометрического титрования использовался автоматический титратор 785 DMT Titrino (Metrohm AG, Швейцария).
Осмолярность, как показатель качества инфузионного раствора, приводится в фармакопее США и Европейской фармакопее [145, 172]. В настоящее время введение осмолярности как показателя качества в фармакопейную статью предприятия для инфузионного препарата является требованием Фармакопейного комитета МЗиСР РФ.
Европейская фармакопея рассматривает только экспериментальную осмолярность, фармакопея США 24 издания [172] требует производить расчет теоретической осмолярности и при многокомпонентном составе инфузионного препарата определение экспериментальной.
Единица осмотической концентрации обычно определяется как миллиос-моль растворенных веществ в одном литре раствора - осмолярность, в одном килограмме растворителя - осмоляльность [57]. Идеальная осмотическая концентрация (mOsM) в миллиосмоль на 1 л препарата определяется формулой 2.1 [172]: mOsM = ( С ІЛУп +„.+ СХгІяУщ
Мх{г Iммоль) М((г/ ммолъ) у где С — концентрация растворенного вещества, г/л;
М - молярная масса вещества, г/ммоль;
п - число ионов, на которое диссоциирует вещество в растворе.
При увеличении концентрации ионов в растворе увеличивается взаимодействие между частицами, поэтому значение осмотической концентрации уменьшается по сравнению с идеальной осмолярностью. Теоретическая осмо-лярность комплексной смеси не может быть рассчитана с достоверной точностью, поэтому используют определение экспериментальной осмолярности на приборе - осмометре.
Определение экспериментальной осмолярности проводили на миллиос-мометре МТ-2 (НПП "Буревестник", Россия).
Важными характеристиками качества плазмозамещающих растворов являются молекулярная масса высокомолекулярного вещества, входящего в состав препарата, и его молекулярно-массовое распределение. В химии высоко-молекулярных соединений используется понятие средней молекулярной массы. Величина средней молекулярной массы полимера не может однозначно характеризовать его свойства, так как при одинаковой средней молекулярной массе различные образцы полимера могут отличаться по соотношению низко- и высокомолекулярных фракций. Для описания количественного распределения фракций вводится понятие степень полидисперсности [16, 61, 133].
Изучение свойств компонентов, влияющих на показатели качества препарата Реоплазмин
При приготовлении и последующем анализе состава на основе желатина было определено, что число показателей качества, контролируемых по ГОСТ, недостаточно для характеристики качества желатина и получения стандартного инфузионного препарата. Поэтому была поставлена задача, ввести дополнительные методы для входного контроля качества желатина, в первую очередь на содержание в нем ионов, входящих в состав плазмы крови (таблица 1.1) [22]. Качественное определение ионов проводили в соответствии со статьей "Химические методы анализа. Общие реакции на подлинность" для трех серий желатина каждой марки [33]. Для анализа использовали 3 % раствор желатина в воде деионизированной. Полученные результаты представлены в таблице 3.6. Согласно данным таблицы 3.6 из выбранных для определения ионов в желатине отсутствуют (или присутствуют в следовых количествах) только фосфаты. На количественные характеристики, получаемого на основе желатина, инфузионного раствора может повлиять содержание ионов натрия, калия, магния, кальция и хлора, так как они вводятся в состав разрабатываемого препарата. Было проведено исследование количественного содержания этих ионов.
Для количественного определения ионов натрия и калия проводили гидролиз 5 г (точная навеска) желатина в 50 мл 0,1 М раствора соляной кислоты (рН= 1,25) в течение 3 часов. Полученный гидролизат, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем водой деионизи-рованной до метки и использовали для проведения анализов. Ионы магния, кальция и хлора определяли титрованием навески желатина, равной 1 г (точная навеска). Количественное определение ионов проводили для трех серий желатина каждой марки в пятикратной повторности. Методики анализа приведены в приложении А. Усредненные результаты анализов желатина марок К-13 и К-11 представлены в таблице 3.7.
В таблице 3.8 представлено сравнение количества ионов в плазме крови, растворе желатина с концентрацией 5 % и прописи препарата, представленной в таблице 3.5. Концентрация желатина равная 5 % выбрана в соответствии с результатами определения количества модифицированного желатина в препарате (п. 3.1.1.1). Приведенные в таблице значения показывают, что введение указанных ионов в состав препарата без учета их содержания в исходном желатине, может привести к их завышенному содержанию в растворе препарата. В соответствии с полученными данными превышение составляет: для ионов натрия 7 %, ионов калия от 1,5 до 6 %, ионов магния 870 %, ионов кальция 460 %, для ионов хлора до 20 %. Превышение концентрации кальция по сравнению с его физиологической концентрацией в плазме крови может негативно повлиять на систему гемостаза при введении препарата [10, 146]. А превышение концентрации ионов магния тормозит проведение нервного импульса в периферической и центральной нервной системе [31]. Следовательно, для снижения содержания этих ионов, желатин, перед использованием для производства парентеральных растворов, необходимо подвергать специальной подготовке.
Содержание ионов натрия, калия и хлора в желатине необходимо учитывать при приготовлении раствора препарата и поэтому целесообразно вести их количественное определение при проведении входного контроля желатина.
Дополнительно для входного контроля желатина рекомендуется ввести анализ по показателям "тяжелые металлы" и "микробиологическая чистота".
При приготовлении раствора препарата с модифицированным желатином и его анализе по показателю "осмолярность" были получены отличия теоретического и экспериментального значения осмолярности для получаемых растворов. При расчете теоретической осмолярности суммируются осмотические вклады каждого компонента раствора в идеальных условиях растворения (принимается, что ионы диссоциируют нацело), но фактически вещества диссоциируют не полностью, и коэффициенты, используемые для расчета теоретической осмолярности, на практике имеют более низкое значение [146, 172]. Для каждого вещества это уменьшение коэффициента индивидуально и чаще всего незначительно. Было сделано предположение, что значительные различия в осмолярности растворов наблюдаются из-за присутствия в составе препарата мало-диссоциирующей янтарной кислоты (рКа = 4,21, 5,72 [41]), так как неорганические соли, входящие в состав препарата диссоциируют практически нацело.
Было проведено исследование отклонений экспериментальной осмолярности раствора соли янтарной кислоты от теоретической [24]. При приготовлении инфузионных растворов часто используют натриевые соли кислот. Исследуемые молярные соотношения были определены исходя из предположения, что различное количество натрия гидроксида по-разному влияет на диссоциацию янтарной кислоты в растворе. Первые три раствора, приведенные в таблице 3.9, не используют для приготовления инфузионных растворов, так как они имеют рН сильно отличающуюся от рН плазмы крови. Для приготовления растворов используют раствор 4, содержащий динатриевую соль янтарной кислоты. Приготовлены растворы, содержащие различные соотношения этих компонентов, для этих растворов рассчитаны теоретические осмолярности (Сосм/тсор) и определены экспериментальные (С0См/эксп)- Определение проводили на трех образцах каждого раствора в пятикратной повторности. В таблице 3.9 приведены результаты расчета теоретической и определения экспериментальной осмоляр-ности для одного образца, но они отражают динамику и порядок значений закономерный для всех образцов.
Наибольшие отклонения экспериментальной осмолярности от теоретической наблюдаются у динатриевой соли янтарной кислоты. Отличия, указывающие на уменьшение диссоциации янтарной кислоты, наблюдаются при увеличении содержания в растворе натрия гидроокиси от 25 до 100 % от количества, необходимого для образования ее полной соли. В приготовлении инфузионных растворов используют именно динатриевую соль янтарной кислоты.
Так как в составе разрабатываемого препарата янтарная кислота находится в виде натриевой соли меглумина сукцината, важно знать какое расхождение между теоретической и экспериментальной осмолярностью вносит именно данная соль.
Было проведено экспериментальное определение осмолярности натрий-глюкаминовой соли янтарной кислоты при содержании N - метилглюкамина и натрия гидроксида 90%, 100%, 110% от их содержания в прописи состава (таблица 3.5). Результаты определения представлены в таблице 3.10.
Результаты валидации методики количественного определения модифицированного желатина
Проводили анализ модельных смесей с содержанием и отсутствием иона желатина. Результаты анализа представлены в таблице 4.13.
Для оценки правильности методики готовили модельные смеси препарата с содержанием модифицированного желатина по отношению к содержанию их в прописи препарата равным 90, 100 и ПО %. Результаты представлены в таблице 4.14.
Методика обеспечивает наибольшую правильность при определении модифицированного желатина при 100 % от его содержания по прописи, но значение правильности в концентрациях желатина 90 % и ПО % от номинальной не превышает рекомендуемое для данного метода - 3 %.
Для проверки сходимости методики проводили анализ одной серии препарата в десятикратной повторности. Рассчитывали статистические характеристики согласно ГФ XI, вып.1, стр. 199. Результаты статистической обработки полученных значений представлены в таблице 4.15.
Сходимость методики подтверждается значением относительной ошибки отдельного определения, которая не превышает 3 % - значения, рекомендуемого для данного метода. 10, 15 и 20 мл анализируемого препарата помещают в мерные колбы вместимостью 50 мл (растворы с концентрацией около 10, 15 и 20 г/л соответственно). По 5 мл каждого приготовленного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 мл, добавляют по 5 мл реактива А и по 5 мл реактива Б, доводят водой очищенной до метки, перемешивают и через 30 мин проводят измерение оптической плотности на спектрофотометре в диапазоне длин волн 520-600 нм относительно раствора, приготовленного без добавления анализируемого препарата. За результат измерения принимается максимум поглощения в указанном диапазоне длин волн.
Теоретические концентрации (10, 15 и 20 г/л) откладываются как значения X, а соответствующие измеренные величины оптической плотности откладываются как значения Y. По графику определяется линейная регрессия. Содержание желатина в препарате вычисляется с учетом отсекаемого отрезка вычисленной регрессии по формуле: С - количественное содержание модифицированного желатина в препарате, г/л; А2 - оптическая плотность раствора, содержащего ориентировочно 15 г/л желатина; А0 - отрезок, отсекаемый графиком, на оси оптических плотностей; 50, 15 - коэффициенты пересчета разведения препарата, мл. Содержание желатина в 1 л препарата должно быть от 45 до 55 г. Приготовление реактива А: 40 г лимонной кислоты моногидрата (ГОСТ 3652-69) и 4,0 г сульфата меди пентагидрата (ГОСТ 4165-78) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Раствор стабилен в течение 2 месяцев.
Приготовление реактива Б: 40 г натрия гидроокиси (ГОСТ 4328-77) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в 200 мл воды очищенной при охлаждении, доводят до метки водой очищенной и перемешивают. Раствор стабилен в течение 6 месяцев.
Разработка методики количественного определения янтарной кислоты и N-метилглюкамина в составах Реоплазмин-G и Реоплазмин-PEG
Методика количественного определения янтарной кислоты и N - метилг-лкжамина в инфузионном растворе Реоплазмин основана на разделении препарата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей регистрацией его рефрактометрическим детектором. Было предложено использовать метод внешнего стандарта (в качестве внешнего стандарта использовать раствор рабочего стандартного образца (РСО) янтарной кислоты (ФС 42-0009-00, ФСП 42-00350926-01, ФСП 42-0275-4517-03) и N - метилглюкамина (НД 42-10844-00, ФСП 42-0275-4518-03)).
Предложены следующие условия проведения анализа:
1. Колонка из нержавеющей стали размером 250 х 4,6 мм, заполненная сорбентом Hypersil BDS С is, размер частиц 5 мкм;
2. Подвижная фаза: фосфатный буфер с рН = 2,6;
3. Скорость подвижной фазы - 0,5 мл/мин;
4. Температура проведения анализа - 25 С;
6. Объём вводимой пробы - 20 мкл.
Для проверки пригодности хроматографической системы был приготовлен раствор: 0,0505 г янтарной кислоты (удовлетворяющего требованиям ФС 42-0009-00, ФСП 42-00350926-01, ФСП 42-0275-4517-0) и 0,0826 г N - метилглюкамина (удовлетворяющего требованиям НД 42-10844-00, ФСП 42-0275-4518-03) поместили в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворили в 80 мл воды очищенной, довели объём раствора до метки водой очищенной и перемешали (испытуемый раствор для проверки пригодности хроматографической системы). Время регистрации одной хроматограммы составило 20 минут. Опыт по хроматографированию проводили в пяти повторностях. В таблице 4.16 представлены результаты определения площади пика, необходимые для определения относительного стандартного отклонения полученных значений. В таблице 4.17 приведены результаты определения времени удерживания пика, необходимые для расчета относительного стандартного отклонения полученных результатов.
