Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. ВМС как компоненты лекарственных препаратов. Их функции, ассортимент 16
1.1.1. Физико-химические свойства полимеров, определяющие возможности их использования в технологии готовых лекарственных средств 16
1.1.2. Биологическая активность высокомолекулярных соединений 18
1.1.3. ВМС как вспомогательные компоненты лекарственных форм 25
1.2. Лекарственные формы на основе высокомолекулярных соединений. Современные средства доставки лекарств 26
1.3. Механизмы высвобождения лекарственных средств из лекарственных форм, созданных на основе высокомолекулярных носителей 37
1.4. Направленный синтез ВМС, предназначенных для создания лекарственных препаратов с улучшенными биофармацевтическими характеристиками 46
Экспериментальные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования (исходные материалы) и реактивы 54
2.1.1. Характеристика высокомолекулярных лекарственных средств объектов исследования 54
2.1.2. Характеристика низкомолекулярных лекарственных средств - объектов исследования 56
2.1.3. Характеристика высокомолекулярных носителей лекарственных веществ 56
2.1.4. Материалы, использованные в работе 58
2.2. Методы исследования
2.2.1 Физико-химические методы исследования 59
2.2.2. Микробиологические методы исследования 62
2.2.3. Определение технологических характеристик микросфер, порошков, гранулятов 63
2.2.4. Определение показателей качества таблеток, капсул 63
2.2.5. Определение ферментативных активностей 63
2.2.6. Определение содержания лекарственных веществ 74
2.2.7. Определение показателей качества офтальмологических препаратов 78
Глава 3. Методологические аспекты и структура создания лекарственных препаратов с использованием ВМС 80
3.1. Методологическая схема создания готовых лекарственных препаратов с использованием ВМС 80
3.2. Лекарственные формы как системы доставки лекарственных веществ 87
3.2.1. Установление иерархии лекарственных форм нового поколения и продуктов, используемых для их получения 87
3.2.2. Исследование терминологических аспектов микроносителей лекарственных средств 90
3.2.3. Методологические аспекты создания микроносителей 92
3.2.3.1. Методологическая структура создания микроносителей методами образования двойных эмульсий 94
Глава 4. Создание жидких лекарственных препаратов с использованием ВМС 101
4.1. Разработка состава и технологии глазных капель пентоксифиллина на основе ВМС 101
4.1.1. Разработка состава глазных капель пентоксифиллина 101
4.1.2. Технология получения глазных капель пентоксифиллина на основе ВМС 111
4.1.3. Показатели качества 113
4.2. Разработка комплекса систем на основе ВМС, предназначенных для улучшения контактной коррекции зрения 116
4.2.1.Система для первичной очистки. Обоснование состава и концентраций компонентов 121
4.2.2. Многофункциональные системы: для первичной, вторичной очистки, для хранения и профилактики загрязнений КЛ 130
4.2.3. Изучение эффективности разработанных средств 137
4.2.4. Разработка технологии получения систем для очистки КЛ 149
Заключение 155
Глава 5. Создание и оптимизация лекарственных препаратов на основе полимерных носителей в форме таблеток 159
5.1. Разработка состава и технологии гасторезистентных таблетированных препаратов с пищеварительными ферментами на основе полимерных носителей 159
5.1.1. Обоснование лекарственной формы, полимерного носителя, ферментных препаратов и параметров оценки лекарственных препаратов в процессе разработки 160
5.1.2. Изучение состава, физико-химических и кинетических свойств ферментных препаратов 166
5.1.3. Моделирование лекарственной формы. Разработка составов и технологии таблеток, содержащих панкреатин и «пектинлиазу» 188
5.1.4. Сравнительная оценка разработанных ферментных препаратов с известными аналогами 198
5.2. Создание лекарственного препарата этмозина в форме таблеток с пролонгированным высвобождением на основе полимерного носителя 200
Заключение 209
Глава 6. Создание и оптимизация лекарственных препаратов на основе полимерных микросфер 212
6.2. Разработка полимерных микроносителей лекарственных средств пролонгированного действия.
6.1.1. Микросферы на основе солей альгиновой кислоты и хитозана 213
6.1.2. Микросферы на основе полимерных эфиров целлюлозы 222
6.2. Разработка полимерных микросфер с пищеварительными ферментами.
6.2.1. Разработка состава АФЦ - микросфер с пищеварительными ферментами 232
6.2.2. Исследование технологических факторов получения микросфер 246
6.2.3. Оценка разработанных препаратов в условиях in vitro и in vivo. Сравнение с известным аналогом 252
Заключение 257
Общие выводы 260
Библиография 264
- Биологическая активность высокомолекулярных соединений
- Методологическая схема создания готовых лекарственных препаратов с использованием ВМС
- Обоснование лекарственной формы, полимерного носителя, ферментных препаратов и параметров оценки лекарственных препаратов в процессе разработки
- Оценка разработанных препаратов в условиях in vitro и in vivo. Сравнение с известным аналогом
Биологическая активность высокомолекулярных соединений
Многочисленность функциональных групп, вариабельность пространственной конфигурации, природа макромолекулярной структуры обосновывают разнообразие свойств ВМС, в том числе их биологические свойства. При этом можно дать обобщенную характеристику полианионов, поликатионов и нейтральных полимеров (9, 68, 102, 104). Полианионы как правило водорастворимы. Они стимулируют фагоцитоз, обладают противоопухолевой, интерфероногенной и иммуномодулирующей активностью и т.д. Их биологическая активность связана со способностью к конкурентному взаимодействию с биополимерами - белками плазмы крови, антигенами или другими веществами крови.
Поликатионы способны к электростатическому взаимодействию с биомембранами, биополимерами и полианионами. Например, для нейтрализации природного аниона - гепарина -предложено (101) использование гетероцеп-ных полимеров, содержащих четвертичные аммониевые группы в основной цепи. К поликатионам относятся известные, главным образом азотсодержащие полимеры, обладающие антимикробной активностью - это полимерные соединения четвертичного аммония, являющиеся эффективными консервантами. Эти соединения, обладая высокой антимикробной активностью, имеют широкий спектр антимикробного действия и применяются в небольших концентрациях (0,001%) (58, 108). Их действие объясняют наличием значительного положительного заряда, числом ионогенных групп, природой основной цепи и строения алкильных заместителей у атома азота.
Нейтральные полимеры - поливиниловый спирт, поливинилпирроли-дон, полиэтиленгликоль, полиакриламид и его производные, декстран и т.д. Низкотоксичны, высокогидрофильны и являются хорошей базой для создания лекарственных препаратов.
Вследствие высокой биологической активности некоторые ВМС могут являться основным действующим веществом лекарственного препарата.
Из синтетических полимеров - лекарственных субстанций - наиболее широко известен поливинилпирролидон (ПВП). Его использование в медицине основано главным образом, на способности к комплексообразованию с различными соединениями. Помимо этого он гидрофилен и легко растворим во многих растворителях. Наибольшее распространение получили препараты, в которых действующим началом является ПВП с ММ 7000-15000 (Гемо-дез, Перистон). Эти препараты представляют собой 6% растворы полимера. Фармакологическое действие препарата «Гемодез» направлено на улучшение микроциркуляции, ликвидации стаза эритроцитов в капиллярах и прока-пиллярной сети, что в свою очередь ведет к улучшению почечного кровотока и резкому увеличению диуреза (90, 142). Препарат Гемовинил, являющийся 3,5 - 4,0% солевым раствором ПВП с ММ 30000-40000, известен как противошоковый кровезаменитель.
Синтез сополимерных соединений ПВП позволил получить лекарственные препараты с качественно новыми свойствами. В первую очередь они обусловлены строением сополимера, которое в ряде случаев и определяет проявление физиологической активности. Так, сополимеры N-винилпирролидона с винилпиридинами являются активными компонентами препаратов: Совидон (иммуномодулирующего действия), Совирин (для лечения дегенеративных заболеваний глаз), Викон (лечение пневмомикозов и некоторых общесоматических заболеваний легких) (68).
К числу природных биологически активных ВМС относятся: аминокислоты, полипептиды, полисахариды и др. Они используются не только в качестве лекарственных средств, но и для получения лечебно-косметических средств и биологически активных добавок к пище. Как правило, эти соединения являются структурными компонентами живых тканей и обладают хорошей биосовместимостью.
Аминокислоты и полипептиды животного происхождения - в основе ноотропных препаратов: Церебрамин (Лонгви-Фарм, Россия), Церебролизин (Ebewe, Австрия). Для лечения тромбозов используется тканевой активатор плазминогена, представляющий собой человеческий двухцепочечный белок, - Альтеплаза (Актилизе, Boehringer Ingelheim Pharma, Австрия) (90, 142).
Особое место среди полипептидов, обладающих биологическим действием занимают ферменты. Исключительно важная роль ферментов заключается в ускорении и регуляции метаболических процессов, а следовательно, любое изменение их активности может повлечь серьезные последствия для организма. Поэтому часто в основе патогенеза большинства заболеваний лежат изменения ферментативного спектра.
Являясь природными биокатализаторами, ферментные препараты нашли применение при лечении заболеваний сердца и сосудов, желудочно-кишечного тракта, воспалительных процессов и др. (19, 20, 21, 32, 55). Например, широко известны тромболитические ферментные препараты стрептокиназа и урокиназа. Стрептокиназа активирует фибринолиз и используется при острых инфарктах миокарда, а также тромбозах различной этиологии. Урокиназа активирует плазминогены, способствуя ферментативному разрушению фибрина. Гидролитические ферменты животного и растительного происхождения Вобензим, Вобэ-Муго и Флогензим фирмы Mucos Pharma (Германия) используются для лечения острых воспалительных состояний, посттравматических и лимфатических отеков. Активный комплекс препаратов: папаин, бромелаин, панкреатин, рутозид активирует противовирусный иммунитет, расщепляет иммунные комплексы и способствует их элиминации. На основании этого, данные препараты используются также как имму-номодулирующие, фибринолитические, противовоспалительные и антиагре-гационные (90,125, 143).
L - Аспарагиназа препятствует включению аспарагина в белки мембран, в первую очередь лейкозных клеток и вследствие этого является цитостатиком с противоопухолевым действием.
Цитохром С, обладая антиоксидантным действием, применяется при ишемической болезни сердца, вирусном гепатите, в офтальмологии.
Значительно количество ферментных препаратов, предназначенных для коррекции пищеварения. К их числу относятся: Дигестал, Зимоплекс, Креон, Ликреаза, Мезим-форте, Ораза, Панзинорм-форте, Панкреатин, Фес-тал и др (см. табл. 1.1) (90, 125, 143).
Большинство этих препаратов содержат комплекс ферментов поджелудочной железы. Дефицит экзогенных панкреатических ферментов в организме часто является причиной серьезных нарушений расщепления и всасывания пищи, что в свою очередь приводит к диспептическим расстройствам и потере в массе. Поэтому панкреатин, выделенный из животного сырья, уже в течение нескольких десятков лет занимает лидирующие позиции в качестве субстанции лекарственных препаратов, предназначенных для заместительной терапии ферментативной недостаточности пищеварения. Наряду с панкреа тином в состав таких препаратов включают протеазы растительного происхождения, продукты животного происхождения - желчь и ее компоненты способствуют гидролизу и ассимиляции липидов), гемицеллюлазу, пепсин, антибактериальные и др. компоненты (19, 26, 83, 143, 145).
Ферментные препараты для недостаточности пищеварения выпускают в форме таблеток, капсул и «драже» (табл. 1.1.). Причем следует отметить, что зачастую зарубежные фирмы при регистрации препарата в результате несоответствия профессиональных фармацевтических терминов в России и стране производителе присваивают не верное название лекарственной форме, называя таблетки, покрытые оболочкой методом наращивания - «Драже». Около 80% препаратов выпускаются в таблетках, покрытых кишечно-растворимой оболочкой, и небольшая часть - в кишечнорастворимых капсулах. В научных публикациях вопросы, посвященные технологии лекарственных форм с подобными ЛВ практически не освещены и не систематизированы, хотя важность результатов таких исследований очевидна. Обладая уникальными биологическими свойствами, полипептиды характеризуются как высоко лабильные соединения. Они способны менять структуру, а значит и активность, под влиянием факторов окружающей среды: значения рН, температуры, присутствия в среде других компонентов, а также различных воздействий, например, механических (23, 30, 51, 52, 54). Для контроля их активности в комплексных лекарственных препаратах сложного состава требуются специальные методы, желательно - основанные на специфических реакциях. Методики оценки эффективности готовой лекарственной формы, по нашему мнению, также должны учитывать специфику их свойств. Поэтому лекарственные вещества - полипептиды требуют особого внимания исследователей и специальных подходов к разработке технологии лекарственных препаратов.
Методологическая схема создания готовых лекарственных препаратов с использованием ВМС
Предлагаемая структурная схема теоретических и экспериментальных исследований представляется отдельными блоками, направленными на решение одной научно-практической задачи. Каждый из этапов включает фрагменты ее решения.
Общая фармацевтическая технология. Первым этапом создания препарата можно считать изучение общих закономерностей технологии лекарственных форм. Они служат отправной точкой при разработке частной технологии. Определение задачи - создание лекарственного препарата с заданными свойствами. На основании назначений и ожидаемой эффективности формулируется система медико-технических требований, основными ориентирами которой являются задаваемые биофармацевтические (фармако-кинетические) характеристики. Схема проведения информационного анализа (рис. 3.2.) позволяет выбрать направление исследований: предпочтительный путь введения разрабатываемого лекарственного препарата и возможный вид лекарственной формы. На основании изучения основных физиологических условий выбранного пути введения, с учетом физико-химических свойств лекарственного вещества (растворимость, стабильность и др.) определяют возможные проблемы, устанавливают требования безопасности. Результатом является система требований и, соответственно, основных показателей лекарственного препарата.
Требования к ЛФ устанавливаются с учетом общих нормирующих документов, а в случае отсутствия информации, формулируются впервые исследователем на основании назначений, ожидаемой эффективности, возможных способов использования.
Предварительные исследования. Первый уровень предварительных исследований включает изучение физико-химических свойств лекарственного вещества и скрининг вспомогательных веществ, в том числе ВМС-корректора.
Лекарственное вещество. В случае, если объектом является высокомолекулярное лекарственное вещество эти исследования обязательны и служат детерминантой дальнейших этапов. Изучаются физико-химические свойства (состав поликомпонентных препаратов, растворимость, стабильность и др.), условия, обеспечивающие оптимальную биологическую активность (рН, температура и др.). Например, для перорального приема необходимо знать значение рН среды, в которой лекарственное средство имеет активную форму. С этой целью целесообразно изучить влияния рН. Для предотвращения модификации (инактивации) ЛВ в процессе получения лекарственной формы требуется исследовать влияние всех технологических факторов. Например, при разработке таблетированной формы - установить роль температуры, влаги, механического воздействия и т.д. Для корректного проведения данного этапа необходимо наличие достоверных и чувствительных методик количественного анализа БАС. Поэтому на данном этапе устанавливаются методы и приборы для анализа.
ВМС. Выбор ВМС производят с учетом его поведения в физиологических условиях выбранного пути введения лекарственной формы и задаваемых биофармацевтических характеристик создаваемого препарата. С позиций регуляции процессов высвобождения для скрининга ВМС важно рассмотрение и учет путей введения и соответствующих взаимодействий полимера с биожидкостями и тканями in vivo. Например, для получения парентеральных препаратов длительного пролонгирования, обладающих приемлемой безопасностью для организма, следует использовать биодеградируемые синтетические полимеры, такие, как полимолочная кислота и ее сополимеры, и наоборот, нецелесообразно применение таких носителей для наружных лекарственных форм.
При разработке пероральных пролонгированных препаратов ожидаемый эффект можно получить в результате использования кишечнораствори-мого, нерастворимого, или двухкомпонентного носителя в зависимости от растворимости самого лекарственного средства. Именно эти характеристики определяют механизм, а следовательно и скорость высвобождения (при растворении, диффузионный, за счет биодеградации), а следовательно и всасывания.
К числу важных свойств ВМС, определяющих их использование в составе ЛФ, следует отнести их химическое строение (поликислота, полиоснование, амфотерное; наличие тех или иных функциональных групп). Эти характеристики позволяют предположить возможное взаимодействие ВМС с другими компонентами ЛФ и в первую очередь с ЛВ, что в свою очередь может служить основанием проведения дополнительных исследований. Наличие определенных реакционно-способных функциональных групп могут способствовать улучшению биоадгезивных свойств, что создает благоприятные условия для получения ЛФ с улучшенными показателями биодоступности.
Физико-химические свойства: растворимость, температура плаг .ения, поверхностно-активные, молекулярная масса, степень разветвленное .и молекул и др. могут служить основанием для прогноза возможных вз имодейст-вий с ЛВ, поведения in vivo, а также для обоснования технологических условий получения ЛФ.
Результатом проведенного скрининга должен быть обоснованный выбор перспективных ВМС.
Изучение взаимодействия ЛВ и ВМС является вторым уровнем предварительных исследований и проводится в случае необходимости. К числу биофармацевтических характеристик, определяемых на этом этапе следует отнести в первую очередь возможную несовместимость, как это было показано нами на примере АФЦ-микросфер с новокаинамидом. Возможно ком-плексообразование - как в случае с АПФТ и КПН-1. В этом случае для оценки возможного влияния представляют интерес количественные характеристики протекающей реакции.
Моделирование ЛФ. На основании предварительных испытаний получают модельные образцы ЛФ, являющихся продуктом взаимодействия лекарственного вещества и полимера и изучают in vitro их показатели качества. Результаты этих исследований позволяют сделать предварительный прогноз перспективности принятых технологических решений и служат основанием для проведения последующего конструирования лекарственной формы.
Технологические исследования. На этом этапе устанавливают состав вспомогательных веществ, выполняющих роль технологических компонентов, учитывая основные параметры безопасности, установленные ранее. Проводится конструирование и установление структуры лекарственной формы, а также разработка способа получения лекарственного препарата. Значимой составляющей технологических исследований является изучение роли и определение основных технологических факторов (в первую очередь их влияния на биофармацевтические характеристики), и определение их параметров. Полученные результаты служат инструментом оптимизации технологии.
При этом следует учитывать, что при получении традиционных лекарственных форм, факторы варьирования их структуры и свойств ограничены (например, таблетки матричные или покрытые). При получении лекарственных форм с использованием средств доставки выявлен достаточно большой ассортимент факторов, позволяющих модулировать биофармацевтические характеристики лекарственного препарата: начиная с количественных соотношений лекарственное вещество/полимер, введения дополнительных регуляторов стабильности и высвобождения, получения средств доставки различной структуры и размеров (микрокапсулы или микросферы и т.д.). В конечном итоге возможно достижение необходимых биофармацевтических профилей путем включения в одну лекарственную форму различных по составу и структуре полимерных средств доставки.
Изучение всех свойств in vitro и in vivo.
Верификация. Этот этап предусматривает проведение сравнительной оценки теоретических моделей препарата, разработанных ранее и фактических результатов, определение коэффициентов корреляции между экспериментами in vitro и in vivo, сравнительные исследования с известными аналогами. В случае, если полученные результаты не соответствуют ожидаемым, возможно принятие альтернативных решений и изменение характеристик созданного лекарственного средства в заданном направлении с помощью проведения соответствующих изменений в технологии и конструкции лекарственной формы с помощью решений, определенных на этапе разработки технологии. Заключением верификации являются клинические испытания.
Обоснование лекарственной формы, полимерного носителя, ферментных препаратов и параметров оценки лекарственных препаратов в процессе разработки
Основным действующим компонентом, обусловленным физиологически, остается панкреатин, содержащий протеазы, липазу, амилазу. В настоящее время в результате бурного развития биотехнологии, стала возможной замена панкреатина, получаемого из животного сырья его микробными аналогами. Использование новых ферментных субстанций позволит добиться также расширения спектра действия лекарственного препарата. Так, в научно-техническом центре «Лекбиотех» разработана ферментная субстанция пектолитического действия «пектичлиаза», которую можно считать перспективной в качестве лекарственного средства для улучшения усвоения растительной пищи (70-72).
На основании этого, для научных исследований, направленных на создание препаратов пищеварительных ферментов, перспективными следует считать: использование ферментов микробного происхождения или их смесей с панкреатином, применение новых гастрорезистентных материалов, современных технологий.
В настоящей главе представлены экспериментальные результаты исследований, посвященных решению поставленных вопросов.
Создание лекарственных препаратов с ферментами требует особой тщательности проведения предварительных исследований, поскольку ферменты, являясь белками, имеют активную пространственную (конформаци-онную) структуру, высоко лабильны и обладают индивидуальными качественными характеристиками.
Физиологические факторы. При разработке лекарственной формы необходимо учитывать условия пути введения, являющиеся неотъемлемой частью физиологии, повлиять на которые не представляется возможным. При пероральном введении лекарственное средство подвергается различным воздействиям, характер которых меняется на разных участках желудочно-кишечного тракта. Меняются составы сред и значение рН, перистальтика определяет продвижение лекарственной формы. Высокая кислотность желудочного сока (рН 1,2) наличие в его составе протеазы пепсина приводит к быстрой и необратимой инактивации ферментного препарата, введенного перорально, что в работе подтверждено экспериментально. Эффективность лекарственной терапии зависит от рационального выбора высокомолекулярного компонента и лекарственной формы, которые должны защищать ферментные препараты от инактивации под действием агрессивной среды желудка, и обеспеччвать высвобождение активных компонентов в верхних отделах кишечника.
Технологические факторы. При получении лекарственной формы ферментные препараты подвергаются различным воздействиям (механической обработке, воздействию температур, растворителей и др.). В работе показано, что возможность использования тех или иных технологических приемов и режимов определяется для каждого ферментного препарата индивидуально. Технология лекарственной формы должна быть обоснована с позиций сохранения стабильности ферментов в процессе ее получения и при хранении. Создание лекарственных препаратов с ферментами предъявляет более жесткие требования к составу лекарственной формы (26).
Обоснование полимера. В качестве гастрорезистентного полимера использовали композиционный полимерный носитель КПН -1. Полимер не растворяется в кислых средах, в воде, но растворяется в буферных растворах с нейтральными и щелочными значениями рН.
Природа интерполимерных комплексов (ИПК), стабилизированных кооперативным взаимодействием полимерных компонентов, обусловливает их высокую чувствительность к изменяющимся факторам внешней среды, в частности, к изменению рН. Так, ИПК, стабилизированные водородными связями, переходят от слабо набухающего продукта (содержание воды около 40 %) к неограниченно набухающему в интервале рН 4,5-5,0 (положение рН перехода зависит от химической природы и молекулярной массы компонентов), причем переход происходит резко. Как было показано в нашей работе, введение КПН-1 в лекарственную форму, эффективно тормозит транспорт лекарственных веществ в раствор в условиях, моделирующих желудок, и обеспечивает высвобождение лекарственного вещества в условиях, моделирующих кишечник.
Кроме того, как отмечено в обзоре литературы (гл. 1), производные по-лиметакриловой кислоты, ПЭГи и полимеры, имеющие в своем составе остатки карбоновых кислот обладают хорошими биоадгезивными свойствами. Обоснование параметров оценки лекарственной формы в процессе разработки.
Обзор лекарственных препаратов с пищеварительными ферментами, представленных на рынке, а также изучение литературных источников показало, что наиболее часто лекарственными формами для таких препаратов являются таблетки и капсулы (90, 143). Регуляция высвобождения в этих лекарственных формах возможна путем введения полимера в состав, нанесения оболочек, или включением в капсулы гастрорезистентных микроносителей. В настоящей главе представлены результаты исследований, посвященных разработке таблетированных форм, в главе 5 - созданию лекарственных форм на основе полимерных средств доставки. Приведенные ниже обоснования параметров оценки разрабатываемых лекарственных препаратов имеют равное значение для постановки экспериментов, представленных в гл. 4, 5.
Основываясь на требованиях к разрабатываемым лекарственным формам, основными критериями качества были приняты: ферментативна», активность, стабильность ферментных препаратов в условиях желудочного сока (рН 1,2, 37 С) и быстрое высвобождение в условиях кишечника (рН 7,4). По нашему мнению, совокупность этих показателей позволила адекватно оценить результаты проведенных исследований.
Кроме того, в работе учитывали все требования ГФ XI, предъявляемые к таблеткам.
Активность. Для оценки активности ферментных препаратов использовали каталитические реакции конверсии специфического для каждого фермента субстрата. Методики представлены в гл. 2. Для проведения достоверной оценки результатов эксперимента на первом этапе исследования проведено определение условий ферментативных реакций: выяснены диапазоны концентраций субстрата и фермента, в которых скорость реакции является функцией только концентрации фермента и не зависит от концентрации субстрата. В этих условиях наблюдается типичная зависимость Михаэлиса -Ментен начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (см. гл. 4.1.2.).
Стабильность в кислой среде.
Фармакопеями разных стран (41, 227), а также ОФС 42-0003-00 «Растворение» для оценки качества гастрорезистентных лекарственных форм рекомендуется тест "Высвобождение", проводимый в 2 стадии. На первой стадии средой служит 0,1Н раствор хлористоводородной кислоты, в котором испытуемый образец инкубируют в течение 60 минут, по истечении этого времени допускается переход лекарственного вещества в среду в количестве не более 10%. На второй стадии в качестве среды используют буфер с нейтральным значением рН (6,8). Высвобождение лекарственного средства должно произойти в течение 45 минут в количестве не менее 70%.
Изучение поведения гастрорезистентной лекарственной формы на кислотной стадии крайне актуально, однако, заложенные в монографиях критерии: целостность лекарственной формы и количество высвободившегося в кислую среду ЛВ, не отражают в полной мере качества лекарственного препарата. В работе нами показано, что полная и необратимая инактивация ферментных препаратов - субстанций происходит в кислой среде за 5 -30 минут (см. рис.5.8, табл. 5.6). Поэтому оценка количества перешедшего в кислый раствор ферментного препарата через 60 минут от начала инкубации, как требуют Фармакопеи, не дает достоверной информации о происходящих процессах, поскольку при этом невозможно учесть действительное количество высвободившегося БАС-фермента.
Кроме того, в случае гастрорезистентной лекарственной формы, содержащей высокомолекулярное действующее вещество и высокомолекулярный полимерный носитель, низкий процент высвобождения на кислотной стадии теста "Высвобождение", допускаемый Фармакопеями, нельзя рассматривать как синоним высокой активности ЛВ. Очевидно, что низкие характеристики высвобождения ЛВ в кислой среде из нерастворимого в данных условиях полимера являются следствием диффузионных затруднений. При этом диффузия небольших молекул хлористоводородной кислоты внутрь лекарственной формы способна привести к инактивации лекарственного вещества, что было экспериментально показано в нашей работе.
Оценка разработанных препаратов в условиях in vitro и in vivo. Сравнение с известным аналогом
Исследование спансул. содержащих АФЦ-микросферы с пищеварительными ферментами.
Микросферы с пищеварительными ферментами дозировали в твердые желатиновые капсулы № 000. Показатели качества капсул соответствовали требованиям ГФ XI.
Изучение высвобождения ферментных препаратов из спансул.
Высвобождение ферментов изучали на приборе «корзинка» при скорости 100 об/мин используя в качестве среды 0,1М фосфатный буфер с рН 7,0.
Все исследованные образцы отвечали требованиям ОФС 42-0003-00 и полностью высвобождали активное начало в течение 60 минут, поскольку к этому времени АФЦ-ая матрица микросфер, полностью растворялась. Количество полимера оказывало свое влияние только iiz начальном этапе - в первые 30 минут. Так, увеличение количества полимера в 2 раза приводило к уменьшению высвободившегося химотрипсина от 95% до 65% в первые 20 минут, результаты практически выравнивались к 30-й минуте.
Изучение микросфер in vivo.
Быстрое высвобождение ферментов в сочетании с большой поверхностью контакта микросфер с биожидкостями, обусловливают перспективность использования разработанного препарата, особенно в детской и гериатрической практике. Поэтому проведено исследование АФЦ-микросфер, содержащих пищеварительные ферменты, в условиях in vivo. Исследования проведены на базе института Питания РАН, при участии д.б.н. В.К. Мазо.
Подопытными животными служили собаки, которым предварительно путем операционного вмешательства в верхний отдел тонкого кишечника вживляли фистулу. Это позволило совершать отбор химуса именно из того отдела кишечника, где пищеварительные ферменты должны оказывать свое действие. Исследования проведено на собаках, фистулы у которых находились примерно на 10 см ниже связки Трейтца. Опыты ставили спустя 18 часов после последнего кормления, воду перед опытом животные получали ad libitum. После скармливания собаке навески препарата в течение 3-4 часов (с интервалами 30-60 минут) отбирали пробы химуса. Навески препаратов не менее чем в 3 раза превышали эндогенную ферментативную активность. При этом количество нативных ферментов составляло 1 г, микросфер - 3 г. Для стимуляции пищеварительных желез препараты давали с небольшим количеством пищи. При выборе пищевого раздражителя учитывали состав вырабатываемых соков. Кормление производили пищей, минимально влияющей на выработку исследуемого фермента (20 мл кефира или 50 г хлеба). В каждой порции химуса определяли активность исследуемого фермента, предварительно растворив всю пробу в необходимом количестве 0,01-0,05 М фосфатного буфера с рН 8,0. Во всех случаях учитывали ферментный фон, создаваемый собственной секрецией животного. Для этого определяли активность химуса, полученного в опытах со скармливанием того же пищевого раздражителя. В эксперименте исследовали 5 животных, на которых проведено 92 опыта.
В ходе исследования в пробах обнаружено некоторое количество не растворившихся микросфер. У трех собак микросферы присутствовали в 71% проб, у двух - в 20% проб. Такое различие объясняется по-видимому, физиологическими особенностями животного (рН соков, интенсивность перистальтики). Количество не высвободившейся амилазы составляло 25-32% от количества, миновавшего желудок, липазы - 35-41%, панкреатина - 10-15%. Показанные различия согласуются с результатами высвобождения в условиях in vivo и обусловлены природой использованного стабилизатора.
Результаты исследования ферментативных активностей химуса после введения нативных ферментов и ферментов в форме АФЦ-микросфер представлены на рисунках 6.20,6.21, 6.22,6.23.
Как видно из данных, представленных на рис. 6.20 в начальный период времени (1 час) количество активных ферментов для нативного панкреатина и АФЦ-микросфер равнозначно. Максимальная ферментативная активность в кишечнике наблюдается через час после приема нативного панкреатина и через 2 часа после приема АФЦ-микросфер. Причем, максимум первой кривой почти вдвое ниже максимума второй. Расчет количества химотрипсина, выделившегося с химусом за 4 часа, показал, что в случае АФЦ-микросфер оно составляет около 96% введенной дозы, а в случае нативного - около 40%. Преимущество АФЦ-микросфер показаны также для амилазы из Aspergillus orhyzae и липазы из Rhizopus microsporus (см. рис. 6.21,6.22,6.23).
Максимальные значения кривых амилолитической активности химуса после введения нативного фермента и в форме АФЦ-микросфер, различаются значительно, что свидетельствует о его высокой лабильности в условиях желудка. Эти данные согласуются с выводами, полученными на основе экспериментов, проведенных in vitro.
Характеристика высвобождения амилазы из микросфер иллюстрирует рис.6.22. Количество высвободившейся в течение первого часа амилазы превышает количество амилазы, оставшейся в микросферах примерно в 2 раза. Поскольку связка Трейтца, которой расположена фистула, находится в начале тонкого кишечника, мы предполагаем, что амилаза полностью высвободится из микрогранул в его дистальном отделе.
Результаты испытаний микросфер с липазой представлены на рис. 6.23. Через час после введения обнаруженное в химусе количество липазы в микросферах превышает количество высвободившейся липазы примерно в 2,5 раза. По истечении этого времени, липолитическая активность химуса возрастает и достигает максимального значения к 2-м часам. Количество липазы в микросферах к этому времени значительно снижается.
