![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/b/3376/373472.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/d/3909/373472/450/1.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/d/3909/373472/450/2.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/d/3909/373472/450/3.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/d/3909/373472/450/4.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].](/i/d/3909/373472/450/5.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.].")
Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований лимонника китайского (обзор литературы) 14
1.1. Ботанико-фармакогностическая характеристика лимонника китайского и микроскопия его плодов и семян. 14
1.2. Географическое распространение и сырьевая база лимонника китайского 17
1.2.1. Размножение и агротехника 17
1.2.2. Заготовка и хранение сырья 18
1.3. Химический состав различных органов лимонника китайского 19
1.4. Современное состояние вопросов стандартизации плодов и семян и лекарственных средств на их основе 29
1.5. Фармакологические свойства и применение лекарственных препаратов лимонника китайского 32
Глава 2. Объекты и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования 38
2.2.1.1. Методы микроскопического исследования 38
2.2.1.2. Гистохимический анализ растительного сырья 39
2.2.2. Химические и хроматографические методы 39
2.2.2.1. Метод колоночной хроматографии 40
2.2.2.2. Тонкослойная хроматография 41
2.2.2.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография 42
2.2.3. Физико-химические методы 42
2.2.4. Исследование нейротропной и антиоксидантной активности 43
2.2.5. Методы получения и анализа лекарственных средств 45
2.2.6. Статистические методы 47
Глава 3. Морфолого-анатомическое исследование плодов и семян лимонника китайского 48
3.1. Морфолого-анатомическое исследование цельных плодов и семян лимонника китайского 48
3.2. Морфолого-анатомическое исследование порошка плодов и семян лимонника китайского 59
Глава 4. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья и субстанций лимонника китайского 62
4.1. Получение суммы биологически активных веществ из СОг -экстракта плодов лимонника китайского PI ИХ хроматографическое разделение 63
4.2. Физико-химическая характеристика выделенных соединений 64
4.3. Обоснование способа выделения у-схизандрина 71
Глава 5. Совершенствование методов стандартизации плодов и семян лимонника китайского 75
5.1. Качественный анализ сырья лимонника китайского 76
5.2. Количественный анализ сырья лимонника китайского 91
5.2.1. Методика количественного определения суммы лигнанов в плодах и семенах лимонника китайского (метод 1) 109
5.2.2. Методика количественного определения суммы двух доминирующих лигнанов в плодах и семенах лимонника китайского (метод 2) 111
Глава 6. Исследования по разработке, стандартизации новых лекарственных препаратов и обоснованию целесообразности их использования в медицинской практике 116
6.1. Качественный анализ лекарственных средств «Лимонника семян настойка» и «Лимонника сироп» 117
6.2. Количественный анализ лекарственных препаратов лимонника 126
6.2.1. Методика количественного определения суммы лигнанов в лекарственных препаратах лимонника 136
6.2.2. Методика количественного определения суммы схизандрина и у-схизандрина в настойке лимонника 138
6.3. Разработка числовых показателей и срока годности «Лимонника семян настойки» 141
6.4. Разработка числовых показателей и срока годности «Лимонника сиропа» 142
6.5. Исследование по разработке лекарственных средств на основе сырья лимонника китайского 143
6.5.1. Технология получения «Лимонника семян настойки» 146
6.5.2. Разработка способа получения «Лимонника сиропа» 151
6.6. Обоснование целесообразности использования разработанных лекарственных препаратов в медицинской практике 154
- Географическое распространение и сырьевая база лимонника китайского
- Исследование нейротропной и антиоксидантной активности
- Морфолого-анатомическое исследование порошка плодов и семян лимонника китайского
- Физико-химическая характеристика выделенных соединений
Географическое распространение и сырьевая база лимонника китайского
Размножается лимонник преимущественно вегетативным путем корневищными отпрысками, рост которых происходит с мая до половины октября, в результате чего образуются клоны с числом лиан в каждом клоне от 1 до 15-17. Наиболее часто встречаются клоны, состоящие из 67 генеративных лиан (Гутникова З.И., 1951) [17, 32]. Типичными местами обитания лимонника на Дальнем Востоке являются долинные кедрово-широколиственные леса, долинные широколиственные изреженные леса, горные хвойно-широколиственные и горные широколиственные леса, причем нарушенные лесные группировки максимально отвечают требованиям лимонника. Также поднимается в горы на 600-700 м над уровнем моря [17, 32]. Площадь плодоносящих зарослей лимонника на Дальнем Востоке составляет около 5800 га. Валовый (биологический) урожай в наиболее благоприятные годы составляет около 4000 т. Однако из-за трудодоступности зарослей фактическая ежегодная заготовка не превышает 250 т (лишь 6% возможного сбора). Урожайность резко колеблется по годам — 300-1600 кг плодов с 1 га. Периодичность урожайности можно условно принять за 2 года. Одна лиана в среднем дает 4-5 кг плодов [32].
Накоплен определенный опыт культивирования данного растения. Наиболее эффективно семенное размножение лимонника в питомнике с последующей пересадкой саженцев в грунт на постоянное место. Его можно возделывать почти во всех освоенных земледелием районах страны, обеспеченных влагой в летние месяцы. Но, несмотря на это, в промышленных масштабах лимонник в РФ не культивируется [4, 32].
Для заготовки плодов и семян лимонника полностью созревшие кисти плодов собирают в сентябре-октябре, до наступления осенних заморозков, подвяливают в течение 2-3 дней под навесом, затем обрывают и сушат 4-5 ч в сушилках при температуре 35-40 С, постепенно повышая ее до 60 С [4, 40].
Для получения семян свежие плоды подвергают прессованию. Сок используют в пищевой промышленности для изготовления напитков, а отжимы, содержащие семена, слегка увлажняют, помещают в бочки и тщательно перемешивают (заливание мезги водой не допускается). Затем бочки с разрыхленной мезгой накрывают марлей или мешковиной и оставляют в теплом месте на 3-5 дней до брожения, после чего семена отделяют от околоплодника при помощи струй воды на решетах, имеющих отверстия диаметром 4-5 мм. Семена сушат в отапливаемых помещениях, расстилая их тонким слоем и периодически перемешивая, или в калориферных сушилках с вентиляцией при температуре 50 С, рассыпая их на листах фанеры или подстилках из плотной ткани. Высушенные плоды и очищенные семена, упаковывая в тканевые мешки, хранят в сухих, хорошо проветриваемых помещениях на стеллажах или подтоварниках [4].
Первые исследования по химическому составу лимонника были проведены в 30-40-х гг. В плодах были найдены лимонная, виннокаменная и яблочная кислоты, эфирное масло и сахаристые вещества (Бранке Ю.В., 1935; Бранке Ю.В., Парышев И.И., 1937 и др.), в семенах - до 50,44% масла, в т.ч. 5,75% эфирных, и сопутствующих веществ [32]. Позднее, в 1951 году, Д.А. Баландин описал метод получения из семян чистого индивидуального вещества, применение которого в эквивалентных по исходному сырью дозах позволяло полностью воспроизвести стимулирующий и другие эффекты, вызываемые лекарственными препаратами лимонника, - схизандрина, одного из доминирующих лигнанов (БАС лимонника). Лигнаны - димерные фенольные соединения, состоящие из двух фенилпропановых фрагментов (Сб-Сз), связанных между собой b-углеродными атомами боковых цепей. Термин «лигнан» был впервые введен Хеурзсом в 1936 году. На данный момент в лимоннике китайском идентифицировано около 30 лигнанов, накапливаемых во всех его органах [26, 87, 118].
В плодах содержатся лигнаны (0,73-5,7%) [60, 62], при этом наиболее высокое содержание их найдено в кожице околоплодника [47]. Эфирное масло (60%) представлено следующими компонентами: сесквитерпены; 13,5% -моноциклические терпены; 4% — алифатические; более 3% — бициклические терпены ряда пинана; 4,6% - ряда камфана. В составе эфирного масла присутствуют: сесквикарен, (+)а-иланген, а- и 3-хамигрен, хамигренал, борнилацетат (9,2%) и метоксицимол (около 2%), придающие эфирному маслу лимонника исключительно приятный аромат и своеобразный горький вкус [56, 105]. В плодах лимонника китайского содержится жирное масло (33,8%), представленное следующими кислотами: олеиновая (28,5-34,1%)), линолевая (55,9-59,8%), смоляные (8,7%). Кроме того, в сочном околоплоднике плодов обнаружены органические кислоты - лимонная (11%), яблочная (10%), винная (2%); щавелевая, янтарная, пектиновые вещества, витамины С (до 500 мг%), Р, Е;дубильные вещества(0;11-0,33%), углеводы (до 9,5%) [29]. , ,
Исследование нейротропной и антиоксидантной активности
Фармакологические исследования проведены под руководством профессора А.В. Дубищева и профессора О.Л. Кулагина.
Нейротропные свойства настоек лимонника китайского изучали на модели тиопенталового сна [6] у белых беспородных крыс обоего пола массой 170-300 г. Гипногенное вещество вводили в дозе, вызывающей тестирующий сон в боковом положении у 100 % животных. Продолжительность снотворного действия тиопентала-натрия (50 мг/кг внутрибрюшинно) оценивали по времени нахождения животных в боковом положении.
Фитопрепараты вводили внутрижелудочно через зонд, предварительно разбавив очищенной водой, в различных дозировках: 10, 25, 50, 100, 200, 500 мг/кг один раз в сутки, от одного до 10 дней, за 30 мин до тестирования. Каждую дозу изучали на группах из 10 животных.
Для каждой дозы препаратов были взяты контрольные группы животных, получавшие спирт в эквивалентных количествах, равных по массе дозе лекарственного средства.
Дозы ЛП для данной методики были выбраны с учетом имеющихся литературных данных, согласно задаче определения широты терапевтического действия изучаемых объектов [19, 64].
Для изучения антиоксидантной активности субстанций и препарата лимонника проведено исследование на белых половозрелых крысах обоего пола. Для воспроизведения токсического повреждения печени нами был выбран четыреххлористый углерод, наиболее часто применяемый в эксперименте с целью моделирования токсического гепатита [51].
Нами было применено многократное введение четыреххлористого углерода лабораторным животным в дозе 2,0 г/кг веса животного. Контрольной группе крыс 50% масляный раствор четыреххлористого углерода вводили ежедневно в течение 6-ти дней. На седьмой день животных забивали, удаляли их печень, которая была значительно увеличена в объеме и макроскопически изменена, ткань печени на разрезе приобретала серый оттенок. Опытная группа крыс получала внутрь фитопрепарат в дозе из расчета 150 мг/кг действующего вещества на 1 кг массы тела животного в виде 40% спиртового раствора в 10 раз разбавленного водой ежедневно в течение 6-ти дней одновременно с введением четыреххлористого углерода. Была задействована интактная группа лабораторных животных, а также группа животных, получавшая наряду с четыреххлористым углеродом 40%) спирт, разбавленный водой в 10 раз, в соответствующей дозе. В эксперименте участвовало 16 групп крыс по 6 штук в каждой. Лабораторные животные находились на обычном рационе вивария и были вовлечены в эксперимент одновременно, что исключает влияния внешних температурных, климатических и иных факторов на разницу активности ферментов у опытных и контрольных групп животных. Животных забивали в соответствии с этическими нормами под эфирным наркозом методом декапитации. Печень крыс извлекали, промывали физиологическим раствором и сразу замораживали в сосуде с твердой углекислотой («сухим льдом») при температуре -70 -ь -80 С.
Затем из ткани печени готовили гомогенат для проведения анализа на содержание малонового диальдегида (МДА), а также определения активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы [54]. Гомогенат готовили механическим измельчением ткани печени массой 1 грамм с 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками постоянно охлаждаемого проточной водой.
Проводили определение конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида.
Определение активности каталазы основано на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [27].
Активность каталазы рассчитывали по формуле:
В гомогенате печени определяли активность супероксиддисмутазы -фермента, инактивирующего супероксидные радикалы и уменьшающего интенсивность перекисного окисления липидов. Супероксиддисмутаза относится к числу ферментов, входящих в состав антиоксидазной защитной системы организма [15].
Определение активности глутатионпероксидазы (ГП) осуществляют в соответствии с принятой в литературе методикой [33]. С учетом разведения биологического материала в данном методе и коэффициента молярной экстинкции ТНФА при 412 нм - 11400, рассчитывают активность ГП в микромолях, израсходованного в реакции субстрата по формуле: (Е контроля — Е опыта) 2147= мкМ/мин на 1 мг белка печени. (2)
Методы получения и анализа лекарственных средств Лекарственные формы (ЛФ) изготовляли в соответствии с общими правилами фармацевтической технологии: настойку в мацерационных баках и перколяторах. Для приготовления настойки использовали спирт этиловый 70% (ВФС 42-3382-99). Для изготовления сиропа лимонника использовали свежеприготовленный сахарный сироп. Полученные ЛФ контролировали на соответствие требованиям общих фармакопейных статей: «Настойки» - ГФ XI, вып. 2, стр. 148-149; «Сиропы» - ГФ XI, вып.2, стр. 150-151 [12].
Определение концентрации спирта проводили по температуре кипения в соответствии с ГФ XI, вып. 1, стр. 26-29. Определение тяжелых металлов проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, стр. 171-172 [11].
Сухой остаток определяли по фармакопейной методике ГФ XI, вып. 1, стр. 285-286 [11]. Испытания на микробиологическую чистоту проводили в установленном порядке: ГФ XI, вып. 2, стр. 193 [12] и Изменение № 3 к ГФ XI [42].
Срок годности лекарственных форм определяли в естественных условиях хранения, в прохладном, защищенном от света месте.
ЛП изготавливали в соответствии с общими правилами фармацевтической технологии: в перколяторах и в мацерационных баках.
Морфолого-анатомическое исследование порошка плодов и семян лимонника китайского
В- связи с тем, что при выделении и особенно при разделении лигнанов имеются определенные трудности [93], нашей целью явилось выделение индивидуальных БАС из субстанции «СОг-экстракт плодов лимонника китайского» с перспективой дальнейшей разработки ГСО, отсутствующего на данный момент в РФ. В условиях промышленного производства (ООО «Роджер-Медика», г. Новосибирск; ООО «Экспро», г. Железногорск) 250 г высушенных плодов лимонника китайского экстрагировали сжиженным диоксидом углерода при сверхкритическом давлении 135-140 бар, температуре 40-80 С, скорости подачи экстрагента около 250 мл/мин. Благодаря экстракции сжиженным газом получено масло плодов лимонника китайского с максимальным содержанием нативных БАС. Это масло (50,0 г) смешивали с 224,4 г алюминия оксида (II нейтральный по Брокману), высушивали. Полученный сухой порошок (СОг-экстракт + алюминия оксид) наносили на слой алюминия оксида, сформированного в гексане (высота колонки 20 см, диаметр — 5,5 см), и элюировали гексаном. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом тонкослойной хроматографии в нескольких системах с использованием различных способов детекции, а также методом ВЭЖХ. Из фракций (№ 12-21, элюент - гексан), обогащенных веществом I, путем кристаллизации из гексана получали технический целевой продукт, очистку которого осуществляли перекристаллизацией из гексана и хлороформа. Другой блок фракций (№ 25-29, элюент - хлороформ), содержащих также вещества лигнановой природы, растворяли в небольшом количестве элюента, переносили по отдельности в хроматографическую колонку (сорбент -силикагель-L 40/100, высота сорбента - 4,0 см, диаметр - 5,0 см). Колонку элюировали гексаном и смесью гексан-хлороформ в различных соотношениях (90:10; 80:20; 70:30; 60:40 50:50), хлороформом и спиртом. В результате было получено вещество II, имеющее лигнановую природу по своим спектральным характеристикам (максимумы поглощения при 220, 254 (пл.), 280 нм): Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялись с помощью гексана и хлороформа в соотношении 1:10 — 3:10. Контроль за разделением осуществлялся с помощью ТСХ-анализа. Схема выделения у-схизандрина и схизандрина представлена на рис. 20. Для установления структуры выделенных веществ использовались данные УФ-, Н-ЯМР- и масс-спектров, непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ (Sigma С 3878), а также результаты химических превращений. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции. Вещества сушили в вакуум-пистолете при температуре 60-78 С / 2 мм над оксидом фосфора (V) и затем определяли температуру плавления на блоке Кофлера. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Спектры !Н-ЯМР записывали на приборе Gemini-200 фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц. Величины химических сдвигов приведены в шкале 8. Внутренний стандарт - тетраметилсилан (5=0). Использованы общепринятые сокращения: с-синглет, д-дублет, т-триплет, дд-двойной дублет, кв-квартет, м мультиплет.
Физико-химическая характеристика выделенных соединений
Выделение у-схизандрина в ранее проводимых исследованиях отечественных ученых (Кочетков Н.К., 1961) проводили с использованием громоздкой и продолжительной (более 1 месяца) технологии, с применением целого ряда органических растворителей (эфир, хлороформ, метанол).
Данная технология заключается в следующем: размолотые семяна лимонника китайского экстрагируют в течение 2 дней в аппарате Сокслета эфиром, упаривания до получения масла, обрабатываемого позднее двадцатикратно метанолом. Далее , упаренный метанольный экстракт обрабатывают 85 % водным метанолом, нагревают с 1 н едким натром в течение 6 часов, упаривают в вакууме. После отгонки метанола охлажденный остаток обрабатывают пятикратно хлороформом. Хлороформный раствор промывают 5 % раствором соды и водой и упаривают в вакууме. Полученную неомыляемую фракцию хроматографируют на оксиде алюминия, при этом выход целевого продукта составляет 0,1 % от воздушно-сухого сырья [28, 32].
Зарубежными исследователями (Ikeya Y., Taguchi Н., 1979, 1982) способ получения гамма-схизандрина осуществляется путем последовательной экстракции высушенных плодов лимонника китайского опасными растворителями: петролейным эфиром и метанолом. Полученные экстракты концентрируют, подвергают перегонке с водяным паром. Кубовый остаток вновь экстрагируют эфиром, упаривают и хроматографируют на силикагеле с использованием различных растворителей: смеси н-гексана и бензола, бензол, бензол-ацетон в различных соотношениях. В результате перекристаллизации получают у-схизандрин с выходом 0,012% от воздушно-сухого сырья [84, 118].
Сравнительная характеристика способов получения у-схизандрина представлена в таблице 6: Таким образом, в отличие от ранее известных способов получения у-схизандрина [28, 32, 84, 85, 118], данный способ менее громоздок и менее продолжителен. Выход целевого продукта — индивидуального у-схизандрина составляет 0,9 г - 85,71 % от существующего в плодах лимонника содержания у-схизандрина, что в 7 и 30 раз больше, чем в ранее проводимых исследованиях [28, 84, 118]. На способ получения у-схизандрина подана «авторская заявка» на изобретение и получена приоритетная справка № 2009103383 от 2.02.2009 г. (прил. 1). 1. Впервые в Российской Федерации в результате изучения химического состава субстанции «СОг-экстракт плодов лимонника китайского» выделено 2 индивидуальных вещества, относящихся к группе фенилпропаноидов - лигнанам. 2. Выделенные вещества с помощью УФ-, Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии были идентифицированы как у-схизандрин и схизандрин. 3. Разработанный способ получения у-схизандрина позволяет получать целевой продукт с выходом 85,7 % от существующего в плодах лимонника, что в 7 и 30 раз больше, чем в ранее проводимых исследованиях. 4. По своим физико-химическим и спектральным характеристикам у-схизандрин является перспективным в плане использования для стандартизации сырья и лекарственных препаратов лимонника китайского в качестве ГСО.
