Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. История открытия рода Malassezia 8
2.2. Таксономия 10
2.3. Эпизоотологические данные 13
2.3.1. Распространенность видов Malassezia 13
2.3.2. Видовая, породная, возрастная, половая восприимчивость 21
2.3.3. Сезонность 24
2.4. Этиология 25
2.5. Факторы патогенности 27
2.6. Симптомокомплекс 29
2.7. Морфологические, физиологические особенности 32
2.8. Иммунологические свойства возбудителя 35
2.9. Видовая идентификация дрожжей рода Malassezia 37
3. Собственные исследования 41
3.1. Материалы и методы исследований 41
3.2. Разработка диагностики малассезиозов животных 45
3.2.1. Вопросы эпизоотологии малассезиоза животных 45
3.2.2. Изучение видового состава грибов Malassezia у животных 70
3.2.3. Изучение патогенности выделенных штаммов на лабораторных животных 79
3.2.4. Симптомокомплекс 84
3.2.5. Лабораторная диагностика 97
3.2.5.1. Отбор материала для исследования 97
3.2.5.2. Цитологическое исследование 98
3.2.5.3. Культуральное исследование 106
3.2.5.4. Изучение физиологических свойств 108
3.2.5.5. Оценка степени чувствительности к антимикотикам 114
4. Обсуждение результатов исследований 115
5. Выводы 124
6. Практические предложения 126
7. Список использованной литературы 127
8. Приложение 150
- Распространенность видов Malassezia
- Вопросы эпизоотологии малассезиоза животных
- Симптомокомплекс
- Изучение физиологических свойств
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время наблюдается тенденция к увеличению заболеваемости оппортунистическими микозами не только людей, но и животных. На смену дерматомикозам (микроспории, трихофитии) приходят болезни, вызываемые условно-патогенными грибами.
Одними из самых распространенных условно-патогенных грибов являются дрожжи рода Malassezia. В нашей стране ветеринарные врачи главным образом узнали об этих грибах и их роли в кожной патологии после выхода статьи Росса Бонда «Malassezia pachydermatis и кожное заболевание у собак», опубликованной в журнале WALTHAM FOCUS в 1997 году. Несмотря на то, что М. pachydermatis был выделен впервые в 1925 (Weidman) от индийского носорога, а в 1955 году (Gustafson) от собаки, широкое распространение малассезиоза у животных отмечается только в последние 2-3 десятилетия (Е.Я Головня, 2009; Л.И. Смирнова и др., 2008; А.П. Золоторубов и др., 2005). Безусловно, качество жизни - кормление, экология, разведение новых пород, с фенотипическими признаками, которые изначально предрасполагают к заболеванию, а также пород животных с нарушенной функцией иммунной системы, оказывают влияние на рост заболеваемости оппортунистическими инфекциями. При этом спектр подверженных заболеванию животных расширяется - помимо собак и кошек эта проблема становится актуальной для других видов домашних животных (коров, коз, лошадей) [D.W. Scott et al., 2003; L.H. Akucewich et al., 2007; F.А. Uzal et al., 2007; A. Hirai et al., 2004].
Таким образом, в последние годы встречаемость малассезиоза у животных продолжает нарастать, в то время как информированность специалистов остается на низком уровне (Р.С. Овчинников и др., 2007; Л.И. Смирнова и др., 2008).
Дрожжи Мalassezia - одна из самых распространенных причин отитов у собак. Немаловажную роль эти грибы играют как секундарная инфекция в развитии кожной патологии. Эти дрожжи были выделены и со слизистых оболочек органов (конъюнктивы, ротовой полости, вагины), но способны ли они вызывать патологический процесс или являются только лишь комменсалами пока неизвестно (М. Hajsig et al., 1985).
В своем клиническом проявлении малассезиоз мало отличается от схожих болезней иной этиологии и часто не диагностируется ветеринарными специалистами. При этом назначенное лечение при неправильном диагнозе будет не эффективно.
Основную трудность при выделении малассезий от животных представляет ряд физиологических особенностей этих грибов, предполагающих особые условия культивирования, что требует соответствующих знаний у ветеринарных специалистов.
Цель работы. Разработка диагностики малассезиоза животных, базирующейся на совокупности результатов эпизоотологических, клинических и лабораторных исследований.
Задачи исследований:
- изучить эпизоотологию болезни;
- изучить этиологию, течение и симптомы малассезиоза животных;
- разработать диагностику малассезиоза животных.
Научная новизна. Впервые в условиях г. Москвы получены статистические данные по распространению малассезиоза среди плотоядных животных (собак и кошек), определены эпизоотологические данные болезни, такие как сезонность, породная и видовая предрасположенность, возрастная восприимчивость. Изучен видовой состав грибов рода Malassezia у больных животных.
В процессе изучения болезни был установлен новый клинический симптом, а именно поражение волоса с изменением его окраски.
Разработана схема для культуральной диагностики малассезиоза у животных.
Практическая значимость. Получен обширный научный материал, предоставляющий возможность объективно оценить роль малассезий в возникновении и развитии болезни у животных.
Выявлен новый клинический симптом болезни, позволяющий предположить малассезиоз и своевременно провести лабораторную диагностику с последующей постановкой точного диагноза и назначением более эффективных методов лечения.
Разработаны и утверждены в установленном порядке «Методические наставления по лабораторной диагностике малассезиозов животных», которые, применимы и в специализированных ветеринарных лабораториях, и в условиях обычных ветеринарных клиник.
«Методические наставления по лабораторной диагностике малассезиозов животных» апробированы и уже используются в практической работе специалистами ветеринарных клиник - «Ветеринарный Центр Видное» (г. Видное), «Тровет» (г. Троицк); ветеринарных лабораторий – «Пастер» (г. Москва), Ленинская ветеринарная лаборатория (г. Видное).
Апробация работы. Основные результаты научно-исследовательских работ доложены: на Ученых советах и методических комиссиях ВИЭВ (2007 - 2010 гг.); на межрайонной научно – практической конференции по проблемам лабораторной диагностики болезней животных (Ленинская районная СББЖ, г. Видное, Московская область 2008 г.); на межлабораторном совещании (Московская областная ветеринарная лаборатория, г. Воскресенск, Московская область, 2010 г.); на курсах повышения квалификации директоров ветеринарных лабораторий (ФГУ «Российская академия кадрового обеспечения агропромышленного комплекса (Косино, 2009 - 2010 гг.).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения и результаты работы, выносимые на защиту:
- некоторые аспекты эпизоотологии, этиологии и симптомокомплекса малассезиоза животных;
- лабораторная диагностика малассезиоза животных.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, включает 13 таблиц, 55 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 230 источников и приложения.
Распространенность видов Malassezia
Грибы рода Malassezia являются комменсалом кожи у животных и человека. Поражения кожи у человека связаны, как правило, с липидозависимыми видами Malassezia. К ним относят такие болезни, как разноцветный (отрубевидный) лишай, Malassezia-фолликулит, неонатальный пустулез, отиты, себорейный дерматит, перхоть, а также некоторые хронические дерматозы, при которых Malassezia служит одним из факторов в развитии - это псориаз, атопический дерматит. Грибы рода Malassezia могут вызывать также блефаро-конъюктивит (М.А. Мокроносова, 1998; В.В. Горбунцов, 2001; А.Г. Гаджигороева, 2007; А.К. Gupta et al., 2004; H.R. Ashbee et al, 2002; M. Marcon et al., 1992; E. Gueho et al., 1998; M. Kieffer et al.,1990; V. Bernier et al., 2002; P. Niamba et al., 1998; E.B. Брагуца, 2007).
У иммуносупрессированных больных при парентеральном питании с применением липидосодержащих препаратов возможен занос грибов Malassezia через катетер с последующим развитием системного малассезиоза, при котором, как правило, поражаются легкие (Р.А. Аравийский и др., 2004; HJ. Chang et al., 1998; P. Mayser et al., 2008; E. Gueho et al., 1987; D.A. Powell et al., 1987,1987; P.H. Azimi et al., 1988; J.L. Aschner et al., 1987).
В отделениях интенсивной детской терапии у младенцев были отмечены вспышки таких инфекционных болезней, как фунгемия, менингит, уроцистит и др., вызванных Malassezia pachydermatis, которая не является, как липофильные виды, комменсалом кожи человека. В ходе проведенных исследований был установлен фактор передачи возбудителя инфекции, которым оказались обсемененные руки персонала - владельцев собак. Была также выявлена возможность передачи-Malassezia pachydermatis от человека к человеку (D.O. Morris et al.,.2005; H.J: Chang et aU, 1998; M. Larocco et al., 1988; D: Kaufman et al., 2004).
M. pachydermatis была выделена из слезного канала у человека с каналикулитом и из урины пациента с хронической гранулематозной болезнью (Y.M. Fan et al., 2006);
Выдвинута гипотеза о том, что собаки, больные атопическим дерматитом, осложненным малассезия-инфекцией, могут послужить источником возбудителя инфекции для человека - хозяина такого животного (D.O. Morris et al., 2005).
В медицинской практике уже известны случаи, позволяющие предположить факт передачи М. pachydermatis от животного к человеку. Так, например, у 46 летней женщины М. pachydermatis послужила причиной лицевой гранулемы, и в то же время такой же гриб был выделен с кожи и ушной серы ее собаки (Y.M. Fan et al., 2006).
Грибы рода Malassezia могут существовать в окружающей среде, но только короткий период времени (A.R. Khosravi et al., 2008).
На основании этих данных можно сделать вывод о том, что Malassezia pachydermatis для владельцев собак, относящихся к группе риска (иммунокомпрометированных больных, маленьких детей) может предоставлять серьезную опасность. Однако, судя по последним научным сведениям, и у здоровых лиц развитие кожной болезни, вызванной М. pachydermatis, передающийся владельцу от его собаки, больной малассезиозом, исключить нельзя.
Кожные болезни и наружные отиты, связанные с Malassezia pachydermatis, наиболее хорошо изучены у собак. У кошек, по сравнению с собаками, такие болезни встречаются гораздо реже (M.R. Prado et al., 2008). Липидозависимые виды грибов рода Malassezia, которые считаются обитателями кожи человека, могут колонизировать и- кожный покров животных.
У собак М. pachydermatis выделяют в 59,73% случаев по сравнению с 4,03% липидозависимымых видов, в то время как у котов эта разница не столь заметна - 9,23% и 4,61% соответственно (R. Galuppi et al., 2008).
При изучении видового состава Malassezia на кожных покровах сельскохозяйственных животных, таких как лошади, коровы, козы и овцы, было установлено, что основными их обитателями являются липидозависимые виды (42%) по сравнению с 3% Malassezia pachydermatis (М. J. Crespo et al, 2002a).
Патогенность Malassezia pachydermatis и связанные с ней кожные болезни у собак, уже не вызывают сомнений. В то же время роль липидозависимых видов Malassezia у животных находится в процессе изучения.
Носительство грибов рода Malassezia описано у разных видов животных. Их выделяют с кожи различных млекопитающих и птиц, а иногда - из окружающей среды. Относят эти грибы к комменсалам кожи собак (G. Midley, 1989; J. Guillot, 1999; M.J. Crespo et al., 2000, 2000a; D.O. Morris, 1999; A. P. Patterson et al., 2002).
M. pachydermatis обнаружили у отряда диких и домашних хищных, включая собак, кошек, медведей, хорьков, лис. Также выделили от носорогов, свиней, приматов, ластоногих, лошадей, птиц, летучих мышей (J. Guillot et al., 1999; R. Gandra et al., 2007; LF. Salkin et al.,1978; L. Pinter et al., 2002). От грызунов и лагоморфов (отряд зайцеобразные) указанный гриб выделить не удалось (J. Guillot et al., 1999). Не удалось его выделить и от 147 лабораторных крыс (R. Galuppi et al., 2008). Носительство, а также причины увеличения популяции дрожжевых колоний на поверхности кожи собак, широко изучали и продолжают изучать многие исследователи из-за важности очевидного участия этих грибов в развитии кожных болезней (J. Guillot et al., 1999; J. Akerstedt et al:, 1996).
Атопический дерматит у собак, как и у человека, является предрасполагающим фактором для развития малассезиозного дерматита (D.O. Morris, 1999; J. Akerstedt et al, 1996).
С M. pachydermatis в основном связывают отиты и дерматиты у собак и, в меньшей степени, у котов, хотя у последних тоже описаны случаи локальных и генерализованных форм дерматита, наружного отита (M.J. Crespo et al., 2000, 2000а; J. Guillot, 1999; R. Galuppi et al., 2008).
Кроме того, наружные отиты с участием М. pachydermatis описаны и у хорька, свиньи, одногорбого верблюда, африканской лисы (J. Guillot, 1999; J.R. Dinsdale, 1995; E.S. Kuttin, 1985).
У калифорнийского морского льва (Zalophus californianus) был отмечен локальный дерматит с участием М. pachydermatis в области груди (J. Guillot etal., 1998а).
Описан случай малассезиозного дерматита у белого носорога (L. Bauwens, 1996).
У лошадей возникают малассезиозные дерматиты на тех участках кожи, где она образует естественные складки - подмышечная область, область вымени у кобыл, пах, наружная часть препуциального мешка (D.W. Scott et al., 2003).
Частота выделения М. pachydermatis, как от здоровых собак, так и от собак с кожными болезнями, почти одинакова (J. Guillot, R. Bond, 1999; R. Dufait, 1983).
С. Cafarchia et al., (2005b) отмечают, что плотность дрожжевых клеток малассезий на кожных покровах у собак с различными кожными болезнями значительно выше, чем у здоровых животных. У собак М. pachydermatis. чаще всего выделяли из следующих органов: ануса, прямой кишки, паранальных мешков, вагины (R. Bond et al., 1995, 2000; М. Hajsig et al., 1985), реже - из ротовой полости, носовых ходов (М. Hajsigetal., 1985).
При исследовании носительства М. pachydermatis на коже у собак, установлена следующая частота встречаемости гриба: на межпальцевых складках кожи - 60%, в области.губ - у 75%, в наружном слуховом проходе -32,5%. Наименьший процент встречаемости малассезий оказался в подмышечной впадине и в паховой области (J. Guillot et al., 1999; R. Bond et al., 1995, 2000; A. P. Patterson et al., 2002).
У здоровых собак перианальная область является наиболее часто колонизируемой грибами М. pachydermatis (60,6%), а паховая реже, всего 3% (С. Cafarchia et al., 2005b; R. Bond et al., 1995).
Наибольшее присутствие колоний дрожжей отмечена в ушах, анусе, межпальцевом пространстве, паранальных железах, паху (S. Nardoni et al., 2007; С. Cafarchia et al., 2005).
Самая высокая колонизация гриба - в перианальной области и наружном слуховом проходе (С. Cafarchia et al., 2005b; R. Bond et al., 1995).
Эти дрожжи можно обнаружить и в фекальных массах, очевидно, они попадают туда, пройдя неизмененными через пищеварительный тракт, после того, как животное их слизало с кожи (P. Raabe et al., 1998).
Вопросы эпизоотологии малассезиоза животных
К малассезиозу восприимчивы большинство видов теплокровных животных. Болезнь широко известна ветеринарным врачам специализирующихся на лечение мелких домашних животных. Особенно малассезиоз распространен у собак (A.M. Литвинови др., 2008).
В период с 2007 по 2009 гг. с целью изучения эпизоотологического процесса малассезиоза у мелких домашних животных в условиях города Москвы изучали ряд факторов: видовой, породный, половой, возрастной состав больных животных, сезонность проявления болезни.
Объектами нашего исследования послужили домашние собаки и кошки, поступившие на обследование в ветеринарную лабораторию «Пастер» г. Москвы.
Было отобрано из ушей: 608 образцов патологических материалов от собак, 124 - от кошек; с кожи: 1038 образцов от собак, 324 - от кошек; с конъюнктивы: 76 от собак, 52 - от кошек; со слизистой носовых ходов: 15 образцов от кошек; из влагалища: 203 от собак, 28 - от кошек; из препуциального мешка: ПО от кобелей, 9 - от котов; содержимое-параанальных желез: 3 от собак.
У животных с видимыми изменениями кожного и волосяного покровов нами были взяты образцы патологических материалов в форме соскобов и выщипов. От животных с наружным отитом брали мазки из слухового прохода. При конъюнктивитах, ринитах, вульвовагинитах, акропоститах, поститах, баланопоститах наряду с бактериологическими и вирусологическими исследованиями проводили и микологическую диагностику. При подозрении на бесплодие, а также у животных часто участвующих в разведении брали мазки из влагалища (у самок) и препуциального мешка (у самцов).
Для изучения носительства грибов Malassezia у крупных домашних животных нами было отобрано: 24 образца материала из слухового прохода у коров без отита, образцы патматериала с кожи у 3-х лошадей с видимыми повреждениями кожных покровов1 и образцы со здоровой кожи в области паха и подмышек от 7 лошадей.
Собаки. Из-за актуальности проблемы малассезиоза у собак в основном изучали материал от этих животных. Исследования материала проводили от собак разных пород и возрастных групп. Образцы для исследований были отобраны только с мест поражений.
От всех собак, которые поступали на обследование в ветеринарную лабораторию Пастер в 2007-2009гг., тщательно собирался анамнез, записывались — возраст, порода и клинические признаки болезни.
Большое количество материала было отобрано от собак больных отитом. Так было обследовано в лаборатории «Пастер» за 3 года 608 собак. От 341 животных были выделены дрожжи Malassezia. Таким образом, в наших исследованиях грибы Malassezia являются причиной отитов у собак в 56% случаях (табл. 1).
Число обращений с кожными проблемами (1038 обследованных собак) значительно превышает (в 1,7 раза), чем с болезнями ушей. Однако грибы Malassezia были выделены только в 82 образцах, что составило всего 8% (табл. 1).
С воспаленной слизистой оболочки глаза для выявления грибов было взято материала от 76 животных и только у 6 (8%) помимо бактериальной флоры были выявлены дрожжи Malassezia (табл.1).
Из влагалища у собак было отобрано 203 мазка для микологического исследования. Мазки отбирались от животных с видимыми выделениями слизистого или гнойного характера, а также от животных без выделений, но с подозрением на бесплодие в анамнезе которых значилось неоднократные неудавшиеся вязки. Параллельно проводились бактериологические, в некоторых случаях вирусологические исследования. Дрожжи Malassezia были обнаружены у 16 животных, что составило 8% (табл.1).
Из препуциального мешка отбирали материал от животных с гнойными выделениями. Из ПО обследуемых животных данные дрожжи были выделены только у 2 кобелей (2%) [табл.1].
В нашем случае с воспалением параанальных желез для лабораторного исследования поступило всего 3 животных, у которых и были выделены данные дрожжи.
Отиты и дерматиты - это наиболее распространенная форма малассезиоза у собак (75% .и 18% соответсвенно), второстепенные - конъюнктивиты, риниты, стоматиты, вагиниты, акропоститы, поститы, баланопоститы, протекающие ассоциативно с бактериозами (О.В. Ивченко, 2007, 2008).
Породная предрасположенность. За период исследований 3 года было выделено из ушей от больных животных изолятов Malassezia: в 2007 году в 127 случаях, в 2008 г.- 121, в 2009 г.- 93 (табл.1, 2).
Результаты получены от разных пород животных и представлены в табл. 2 и рисунке 1.
Чаще всего малассезиозным отитом страдали собаки породы лабрадор -21%. В каждом из 3-х гг., проводимых нами исследований, от этой породы мы выделяли гр. Malassezia наиболее часто. В 2007 г. составило 30 заболевших малассезиозным отитом животных этой породы, в 2008г. - 24, в 2009 г.-17 (табл.2).
Гриб также обнаружили у собак пород - немецкая овчарка -в 8,5%, йоркширский терьер — в 7%, кокер-спаниель -в 7,3%, такса- в 6%.
Сопоставив результаты исследований за три года (рис. 1, табл. 2), кроме выше перечисленных, следующие породы - пудель (5% от всех положительных), стаффордширский терьер (3,5%), вест хайленд вайт терьер (3%), мопс (2%), шар-пей (2,3%), отнесли к породам, предрасположенным к малассезиозному отиту в московском регионе (О. В. Ивченко, 2010).
Если у Лабрадора и кокер - спаниеля ушная раковина висячего типа, то у немецкой овчарки и йоркширского терьера ушная раковина стоячего типа. Поэтому говорить строго о том, что породы с висячими, а, следовательно, плохо вентилируемыми ушами больше подвержены отитам, не верно. В наших исследованиях мы сталкивались часто и с малассезиозным отитом у беспородных собак (рис.1). В период исследований было выделено следующее количество изолятов грибов Malassezia с кожи животных с дерматитами: в 2007 году - у 12 собак, в 2008 г.- у 30 собак, в 2009 г.- у 31 (табл.1, 3).
Результаты получены от разных пород животных и приведены в табл. 3 и рисунке 2.
За весь период мы чаще всего выделяли гриб от собак — вест хайленд вайт-терьер и такса, что составило по 12 % от всех положительных случаев малассезиозного дерматита у всех обследуемых нами пород.
Чаще чем у других пород мы выделяли у Лабрадора (9,6%), кокер -спаниеля (9,6%), йоркширского терьера (8%), английского бульдога (5,5%), немецкой овчарки (5,5%), пекинеса (5,5%) [О.В. Ивченко, 2010].
У таксы, вест хайленд вайт терьера поражения локализовались, как правило, на вентральной части тела: пах, подмышечная часть. У английского бульдога - в местах образования складок на коже: на морде, шеи, а также на лапах. У собак породы овчарка мы выделяли гриб в основном с межпальцевого пространства. У йоркширских терьеров - с вентральной части морды, в районе подбородка.
Симптомокомплекс
Анализируя данные проводимых исследований в вышеуказанных лабораториях и ветеринарных клиниках, мы выявили основные формы клинического проявления малассезиоза у животных:
- отиты;
- дерматиты;
- поражение волоса, с изменением окраски на бурую;
- стоматиты, конъюнктивиты, вульвовагиниты, акропоститы, поститы, баланопоститы - ассоциативно с бактериозами.
Наружные отиты - наиболее распространенная форма проявления кожного малассезиоза. Клинические признаки были схожи с отитами паразитарной этиологии. Малассезиозные отиты у собак и кошек имели подобные симптомы. Кошки страдали малассезиозными отитами реже по сравнению с собаками.
У больных животных мы наблюдали выделения из ушей от скудных до обильных. Запах выделений напоминал дрожжевой. Они бывали жидкими, полужидкими мажущимися или сухими в форме корочек темного цвета, очень схожие с отделяемым при отите, вызванном ушным клещом p. Otodectes. Цвет экссудатов - от светло-желтого до темно-коричневого. Отиты у животных сопровождались зудом различной выраженности. Патологические процессы, протекающие с жидкими и полужидкими выделениями, были осложнены, как правило, бактериозами, в редких случаях кандидозами.
Мы наблюдали отит у Лабрадора, у которого после неудачного лечения малассезиозного отита развилась бактериальная микрофлора и гриб Candida spp. При этом выделения были коричневого цвета, мокнущие. Кожа наружного слухового прохода воспалена, отечна, болезненна, наблюдались расчесы в области ушной раковины. Болезнь сопровождалась изменениями в поведении — животное трясло головой, было возбужденным. Развитие малассезиозного отита часто происходло при наличии у животных аллергии на отдельные компоненты корма. В процессе наших исследований были отмечены подобные клинические случаи у йоркширских терьеров, часто страдающих кормовой аллергией. В начале болезни в ушной раковине регистрировали незначительное темно коричневое крупитчатое отделяемое. Зуд почти отсутствовал. При микроскопии мазка, взятого из ушного прохода, было установлено наличие грибов рода Malassezla. При отсутствии, какого-либо лечения, через несколько дней объем выделений увеличивался, что доставляло гораздо большее беспокойство животному.
Малассезиозные дерматиты у собак локализовались в паху, подмышечной области, межпальцевом пространстве, у кромки губ. У пород со складчатой кожей наблюдали поражения внутри складок. При этом отмечали сальность кожи в местах поражения. Для малассезиозного дерматита характерны: зуд, расчесы, гиперемия. Кожа чешуйчатая или сальная, серая или воспаленная, полностью или частично лишенная волосяного покрова. При хроническом течении болезни - утолщенная. Пораженные грибом участки межпальцевых пространств животное вылизывало, увеличивая мацерацию и площадь нарушения целостности эпидермиса, создавая тем самым благоприятные условия для развития как грибной, так и бактериальной микрофлоры. В очагах колонизации кожи малассезиями цвет волосяного покрова приобретал бурый оттенок.
Изменение окраски волосяного покрова при малассезиозных поражениях мы отмечали неоднократно. Так владельцы серого миттелыннауцера обратились в клинику по поводу изменения цвета шерсти в областях части тела (живот, пах, конечности, подбородок). Волос приобрел некий бурый оттенок. Ранее аналогичные клинические признаки мы отмечали у собак белой или светлой масти и связывали это с недостаточной просушенностью волоса. Однако у обследуемого миттелыннауцера шерсть наощупь не была шелковистой, а приобрела нетипичную жесткость. При разминании пальцами пораженного волоса создавалось ощущение наличия мелкого порошка. Культуральное исследование шерсти на микологических средах позволило нам обнаружить большомколичествеМ; pachydermatis.
У- собаки» породы бриар наблюдалось изменение окраски1 волоса на красно-бурый цвет в районе межпальцевого пространства. Каких либо других; симптомов, причиняющих беспокойство животному, не было отмечено; Владельцы животного обратились.с жалобой на неприятный запах от собаки. Был проведен микологический анализ, и при посеве волоса были выделены; дрожжевые: грибы М. pachydermatis (А. М. Литвинов, И.О. Ивченко, 2010).
После этих случаев мы стали; обращать внимание на изменение цвета волоса у собак при дерматитах и брать для микологического исследования не только чешуйки с кожи, но и обрезать ножницами волосы в этих местах для посева на микологические среды.
У некоторых короткошерстных пород, таких как той - терьеры, карликовый пинчер, чихуа-хуа рыжей или белой масти, при малассезиозном дерматите мы- регистрировали только изменения окраски волосяного покрова и зуд.
У кошек малассезиозный дерматит встречался редко. Страдала в основном короткошерстные породы, а также сфинксы. Особенностью сфинксов; является образование обильной смазки, выделяемой сальными железами кожи. Причем у некоторых кошек при неправильном питании или наличии, каких либо сопутствующих болезней, происходит чрезмерное выделение этого секретах образованием сального налета на коже. Высокая температура тела животных (38,5-39,5) и липидные компоненты, содержащиеся в кожном секрете, служат благоприятной средой для развития грибов Malassezia. При этом у больных животных мы регистрировали коричневый налет на коже, в ушах, вокруг ногтевого валика. Зуда и беспокойства при этом не отмечали, наблюдался неприятный запах от животного (А. М. Литвинов, И.О. Ивченко, 2010). Единичные случаи наблюдали, у котов других пород - поражение околоногтевого пространства, проявляющиеся покраснением, небольшой степенью отечности и вылизыванием этой области.
Є конъюнктивы у собак нами была выделена Malassezia pachydermatis в трех случаях. При этом выделения из глаз были слизистого характера, также отмечено покраснение и отечность слизистой оболочки: У английского бульдога белой масти наблюдали грязно-розового цвета влажную дорожку, идущую из уголков глаз.
У группы кошек породы сфинкс выделения, были- коричневатые, обильные, слизистые, оставляющие грязно-коричневые дорожки на коже в области носовой складки. Слизистая конъюнктивы при этом была отечна, с признаками воспаления.
У кошек с хроническим ринитом, проявляющимся слизистыми истечениями коричневатого цвета из носовых ходов, отечностью слизистой, затрудненным дыханием, помимо бактериальной флоры был выделен гриб Malassezia pachydermatis.
Несколько клинических случаев стоматита мы наблюдали у собак, у которых из материала, взятого с ротовой полости, грибы М. pachydermatis были выделены в большом количестве. Стоматиты сопровождались гиперсаливацией, изъязвлением и отечностью слизистой оболочки, неприятным запахом.
Вулвовагиниты, акропоститы, поститы, баланопоститы с участием грибов рода Malassezia по клиническим признакам не отличались от таковых бактериальной этиологии. Как правило, подобные патологии протекали ассоциативно и не были самостоятельной инфекцией, а скорее служили показателем дисбактериоза в этих органах. При этом регистрировали выделения слизистого характера и постоянное вылизывание животным области наружных половых органов (А. М. Литвинов, И.О. Ивченко, 2010).
Несколько животных с хроническим процессом воспаления параанальных желез, сопровождающегося абсцессом, были обследованы на предмет бактериального и грибного состава слизисто-гнойного отделяемого. Помимо бактериальной флоры (Escherichia coli, p. Proteus) были выделены грибы М. pachydermatis.
Распространенными формами проявления малассезиоза у собак и кошек являются отиты и дерматиты. В результате исследований мы установили новый клинический симптом болезни - поражение волоса, сопровождающееся изменением его окраски и приобретением нетипичной жесткости. В процессе нашей работы мы выделили также грибы p. Malassezia со слизистых оболочек разных органов при их воспалении.
Изучение физиологических свойств
Проверка уреазной активности. Принцип метода основан на способности микроорганизмов, обладающих ферментом уреазой, расщеплять мочевину до аммиака, за счет которого происходит изменение рН среды в щелочную сторону, что определяется по изменению цвета индикатора.
Засевали культуру на косяки с уреазным агаром по Кристенсену и на жидкую среду с мочевиной по Кристенсену. Инкубировали в термостате при Т 32С 1 сутки. Грибы Malassezia расщепляли мочевину с изменением цвета среды на розово красный.
Постановка каталазной реакции. Принцип метода основан на способности микроорганизмов, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.
На предметное стекло наносили каплю 10% перекиси водорода, в нее вносили микологической петлей культуру и растирали круговыми движениями. Возраст культуры был не менее 5 суток. Выделение пузырьков кислорода свидетельствовало о наличии каталазной активности.
Каталазную активность мы также тестировали непосредственно у выросших культур на среде Сабуро. Для этого на поверхность культуры на скошенном агаре, или на колонии,в чашке Петри наносили несколько капель перекиси водорода, также оценивая появление пузырьков газа. Каталазная реакция М. pachydermatis М. sympodialis, М. globosa была положительная, М. restricta - отрицательная.
Обнаружение р — гликозидазной активности — эскулин тест. Принцип метода основан на способности микроорганизмов расщеплять эскулин на эскулитин и глюкозу, и из-за взаимодействия, эскулитина, с солями железа образуется комплекс, дающийпотемнение среды.
С помощью микологической петли культуру дрожжей вносили глубоко в агар с эскулином (Merck, Германия). Инкубировали при Т 32С в течение 5 дней. При положительном тесте среда меняла цвет на черный. М. pachydermatis, М. sympodialis - расшепляли эскулин, М. globosa, М. restricta -нет.
Изучение температурной толерантности. Чашки Петри с засеянным материалом инкубировали при разных температурах- 28С, 32С, 37С.
Проведение теста на потребление липидных компонентов. Готовили грибную суспензию. Для этого с помощью бактериологической петли дрожжевые клетки с плотной среды переносили в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Конечная концентрация взвеси составляла от 2x105 до 3x105 клеток/мл. Возраст инокулята не превышал 4- 5 суток.
Определение густоты грибковой взвеси: а) Подсчет клеток проводили в камере Горяева - сосчитывали клетки в малых квадратах. Количество клеток (х) в 1 мл высчитывали по формуле
Полученную грибную суспензию заливали в чашку Петри, содержащую предварительно расплавленный и охлажденный до 45-50С агар Сабуро. Аккуратно перемешивали, покачивая чашку. После застывания агара горячей пастеровской пипеткой делали 5 неглубоких лунок диаметром 2мм (не до самого дна чашки), куда вносили по 5 мкл твинов 20, 40, 60, 80 и кремофора EL. Инкубировали при Т 31 С. В течение 2-5 суток проводили оценку утилизации липидных компонентов степенью роста дрожжей.
М. pachydermatis - отмечен рост в присутствии твинов 20, 40, 60, 80, кремофора EL.
М. sympodialis - не было роста только в присутствии твина 20.
М. globosa, М. restricta - не расщепляли ни один из твинов и кремофор EL.
Поскольку вид малассезий, кроме М. pachydermatis, по морфологии установить невозможно, для их идентификации мы использовали диагностический ключ по J. Guillot (1996), основанный на физиологических особенностях этих грибов. Однако для проведения рутинных лабораторных исследований указанный диагностический ключ трудоемок в исполнении, поэтому нами разработана упрощенная схема, позволяющая выделять не только М. pachydermatis, но и липидозависимые малассезий с идентификацией до вида (рис. 55).
