Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Строение и развитие зуба 14
1.2. Возрастные особенности пульпы 20
1.3. Развитие зубов и возникновение одонтобластоподобных клеток 21
1.4. Стволовые клетки в стоматологии
1.4.1 Стволовые клетки, полученные из зачатков на стадии зубных фолликулов 23
1.4.2 Стволовые клетки, полученные из молочных зубов 23
1.4.3 Стволовые клетки, полученные из тканей периодонта 24
1.4.4 Стволовые клетки, полученные из эпителиальных стволовых клеток 25
1.4.5 Фибробласты слизистой оболочки щёк 26
1.4.6 Стволовые клетки сверхкомплектных зубов 26
1.4.7 Стволовые клетки, полученные из апикальной части зубного сосочка 26
1.4.8 Стволовые клетки боковой популяции клеток пульпы 27
1.4.9 Стволовые клетки, полученные из пульпы сформированного зуба 28
1.4.10 Сравнение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека с мезенхимальными стволовыми клетками зубов 31
1.4.11 Перспектива применения стволовых клеток зубов в регенеративной медицине з
1.5. Общие принципы препарирования опорных зубов 33
1.6. Реакция пульпы зуба на препарирование опорных зубов 34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 44
2.1. Общая характеристика клинического материала 45
2.2. Прямой метод изготовления временных коронок 46
2.3. Метод электроодонтометрического исследования зубов
2.4. Статистический метод исследов 56
2.5. Общая характеристика экспериментального материала и морфологического блока исследований 58
2.6. Методика извлечения пульпы из твердых тканей зуба в эксперименте 2.7. Методика иммуногистохимического окрашивания 63
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 65
3.1. Анализ медицинских карт стоматологических пациентов (с изготовлением временных коронок из «Акрилоксида») и клиническим наблюдением (с изготовлением временных коронок 65
из «Protemp 3 Garant»
3.2. Экспрессия маркеров эпителиальных, мезенхимальных и стволовых клеток в клеточных популяциях пульпы зуба у человека 68
3.2.1 Экспрессия а-гладкомышечного актина 70
3.2.2 Экспрессия CD 31 и CD 34 73
3.2.3 Экспрессия c4cit (рецептор к фактору стволовых клеток,СО 117) 76
3.2.4 Экспрессия эпителиальных маркеров 79
3.3. Реакция клеточных элементов пульпы зубов кролика на препарирование твёрдых тканей зуба 83
3.3.1 Экспрессия эпителиального мембранного антигена 83
3.3.2 Экспрессия а-гладкомышечного актина 89
3.4. Реакция клеточных элементов пульпы зубов собак на препарирование твёрдых тканей зуба и различные временные коронки из материалов («Акрилоксид» и «Protemp 3 Garant»), изготовленные после препарирования 93
Заключение 100
Выводы 109
Практические рекомендации 111
Библиографический список использованной литературы
- Стволовые клетки, полученные из молочных зубов
- Сравнение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека с мезенхимальными стволовыми клетками зубов
- Общая характеристика экспериментального материала и морфологического блока исследований
- Реакция клеточных элементов пульпы зубов кролика на препарирование твёрдых тканей зуба
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема сохранения и восстановления целостности зубов и зубных рядов ставит перед стоматологами сложную задачу обеспечения эффективности лечения и восстановления жевательной функции пациентов. Нарушения целостности зубов и зубных рядов могут привести к изменениям в лицевом скелете, височно-нижнечелюстном суставе, в мягких тканях, что не может не отразиться на качестве жизни человека. Лечение дефектов зубных рядов проводится путем замещения несъемными и съемными конструкциями из различных материалов (Х.А. Каламкаров, 1988), а также путем протезирования с использованием дентальных имплантатов (М.З. Миргазизов, В.Н. Олесова и др., 1985). Лечение дефектов твердых тканей зубов предполагает препарирование и последующее закрытие выбранного участка поврежденного зуба пломбировочным материалом (Л. А. Дмитриева, 2003) или ортопедической конструкцией (X. А. Каламкаров, 1977). Высокая потребность в стоматологическом лечении дефектов твердых тканей зубов и зубных рядов обусловливает актуальность изучения и внедрения альтернативных методов лечения.
Традиционные методы лечения, устраняя дефект в зубе, полностью блокируют его возможность к самовосстановлению или регенерации. Однако зуб, как любой орган в организме млекопитающих, способен к регенерации, одним из примеров которой является образование третичного дентина. Следовательно, изучение клеточных источников и механизмов регенерации зуба позволит разработать новые методы лечения, которые будут основаны на принципах регенеративной медицины. Они также направлены на активацию восстановительных механизмов органов и тканей за счет стимулирования пролиферации стволовых клеток, из которых образуются дифференцированные клетки, способные выполнять определенные функции, в том числе и синтез дентина. Конечная же цель регенеративной медицины, в том числе и стоматологии, - получение методами биоинженерии функционально полноценных органов, которые можно использовать для замещения утраченных в результате болезни или с возрастом зубов (A. Atala, 2005; L.G. Griffith, G. Naughton, 2002; E. Ikedaa, T. Tsuji, 2008; B. Purnell, 2008). Изучение развития зубов позволили установить взаимодействие эпителиальных и мезенхимальных (эктомезенхимальных) клеток (S. Shi, S. Gronthos, 2003), из которых соответственно образуются амелобласты и эктомезенхимальные клетки, дающие начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам периодонтальной связки. Именно эти знания позволили японским исследователям получить из 14-ти дневного эмбриона мыши клетки методом тканевой инженерии зачаток зуба, успешно трансплантированный в последующем в челюсть взрослого животного (Ikedaa Е. et all., 2009). В то же время следует подчеркнуть, что наиболее перспективным является разработка методов восстановления целостности зубов или их
выращивания, основанных на использовании стволовых или прогениторных клеток самого пациента. Именно поэтому в последние два десятилетия одной из актуальных проблем является поиск стволовой клетки зуба или пульпы во взрослом организме (Alliot-Licht В. et all., 2005). Основным подходом для идентификации этих клеток является метод выделения клеток из пульпы с последующим культивированием их in vitro на различных подложках и с добавлением различных ростовых факторов (Gronthos et all., 2000). Попытки описать фенотип свежевыделенных клеток не позволили четко идентифицировать фенотипические признаки как предшественников, так и стволовых клеток пульпы, а главное - установить их локализацию в пределах пульпы. Именно поэтому до сих пор остается не известной реакция стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонтопрепарирование и различные виды временных коронок, изготовление которых является неотъемлемой частью протокола ведения пациентов с несъемными ортопедическими конструкциями. Все вышеизложенное явилось основанием для проведения настоящего исследования.
Объект и предмет исследования
Объектом исследования являлись 102 пациента с дефектами твердых тканей зубов и зубных рядов (с временными коронками). Экспериментальная часть вьшолнялась на кроликах (14) и собаках (4). Предметом исследования явилась пульпа зуба человека и млекопитающих.
Цель работы: исследовать клеточный состав пульпы зуба с позиции поиска прогениторных (стволовых) клеток и проанализировать клеточные реакции пульпы на ортопедические вмешательства.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести анализ отдаленных результатов состояния пульпы
отпрепарированных зубов в зависимости от материала, из которого были
изготовлены временные коронки, на основании изучения медицинских
карт стоматологических больных и клинических наблюдений.
Изучить экспрессию эпителиальных и мезенхимальных маркеров, а также маркеров прогениторных и стволовых клеток, в различных клеточных популяциях пульпы человека и лабораторных животных (кролик, собака).
Проанализировать реакцию стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонтопрепарирование.
Сравнить реакцию и состояние стволового компартмента пульпы зуба на различные материалы прямых временных конструкций после одонтопрепарирования.
Методы исследования
В работе использовались современные методы исследования в области стоматологии и гистологии: электроодонтометрический, рентгенологический, иммуногистохимический, статистический.
Достоверность полученных данных н их научная новизна
Для получения достоверных результатов проведено достаточное количество экспериментов. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью пакетов прикладных программ SPSS 10,0 и Statistica 6,0. При этом определяли среднее арифметическое значение (М), среднее квадратичное отклонение (s), ошибку средней арифметической (т).
Научная новизна полученных результатов, по мнению автора, заключается в том, что впервые было установлено два типа стволовых клеток в пульпе зуба человека - эктомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные для клеток соединительной ткани пульпы, которые имеют разную локализацию в пределах пульпы и экспрессируют различные маркеры. Впервые был найден маркер, позволяющий выявлять одонтобласты и их предшественников, которым является эпителиальный мембранный антиген, экспрессирующийся на большинстве эпителиальных клеток млекопитающих.
В эксперименте на основании анализа иммуногистохимических реакций установлено, что при препарировании твердых тканей под литые ортопедические конструкции, а также в результате различных лечебных мероприятий на зубах активизируются клетки как эктомезенхимального, так и мезенхимального стволовых компартментов пульпы зуба.
Экспериментально впервые установлено, что не только воспалительная реакция пульпы, но и активация, а также гибель клеток в ее стволовых компартментах после одонтопрепарирования зависят от материалов, из которых изготовлены временные защитные коронки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты, основные положения и выводы, представленные в работе, имеют теоретическое значение при дальнейшем изучении проблемы развития патологических процессов в пульпе зуба, а также регенерации и активации прогениторных клеток пульпы. Они позволяют по-новому оценить и понять закономерность развития изменений, происходящих в зубе человека, при различных травмирующих факторах, таких как препарирование зуба под литую ортопедическую конструкцию, изготовление временных коронок из акриловой самотвердеющей пластмассы и специального композитного материала. Обнаруженные изменения в клеточном составе пульпы зуба могут способствовать раскрытию причин таких нарушений, как пульпит и его осложнения, а полученные в ходе экспериментального исследования результаты могут повысить эффективность стоматологического лечения за счет подбора материалов для изготовления ортопедических конструкций, обладающих наименьшей цитотоксичностью.
Особую практическую ценность представляет установление факта экспрессии клетками-предшественницами одонтобластов эпителиального мембранного антигена. Поскольку это трансмембранный гликопротеин, то с его помощью можно выделять чистую популяцию клеток
предшественниц одонтобластов и изучать не только возможности и условия их дифференцировки, но и продолжить исследования по созданию тканевых инженерных конструкций для замещения дефектов дентина.
Полученные в работе результаты целесообразно использовать деятельности ортопедических отделений стоматологических медицинских организаций, лекционном материале по ортопедической стоматологии и гистологии для студентов стоматологических факультетов и факультетов последипломного образования, а также при разработке новых методов регенеративной медицины и тканевой инженерии в области стоматологии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В пульпе зуба имеются 2 типа стволовых клеток -
эктомезенхимальные для одонтобластов и мезенхимальные - для клеток
соединительной ткани пульпы.
2. Активация мезенхимальных клеток в центральных зонах пульпы и
развитие воспалительной реакции зависят от химических свойств
материала, из которого изготовлена временная ортопедическая
конструкция.
Личный вклад соискателя
Автором выбрана тема, составлена программа, поставлены задачи, определены этапы и методы исследования. Автор принимал непосредственное личное участие в клиническом обследовании и лечении больных, организации и проведении различных лабораторных, инструментальных и иммуногистохимических исследований, разработал новые способы извлечения пульпарной ткани из твердых тканей зубов. Статистическая обработка, сопоставление полученных результатов с данными литературы, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций принадлежат лично автору.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (2006, 2007, 2008, 2009гг.), международной научно-практической конференции «Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты)» (Пермь, 2008г.).
Публикации по теме диссертации Основные результаты диссертационного исследования достаточно полно отражены в 10 научных работах, в том числе двух статьях, опубликованных в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций -1,25 у.п.л., в том числе авторский вклад - 0,75 у.п.л.
Реализация результатов работы
Результаты работы используются: в учебном процессе на кафедре нормальной анатомии; на практических занятиях со студентами, слушателями курсов повышения квалификации стоматологов-ортопедов, с клиническими ординаторами и интернами на кафедре ортопедической стоматологии Казанского государственного медицинского университета;
кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий Чувашского государственного университета; кафедре пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний Башкирского государственного медицинского университета. Алгоритм стоматологического ортопедического лечения больных с временным этапом протезирования используется в лечебной деятельности ортопедического отделения стоматологической поликлиники КГМУ, в ООО «Стоматологическая поликлиника» №5, в ОАО «Стоматологическая поликлиника» №9, 000 «Стоматологическая поликлиника Рокада-мед» г. Казани, стоматологической поликлинике МУЗ №1 и №3 г. Набережные Челны.
Структура диссертации, её объем Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников, содержащего 189 работ, в том числе 107 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 49 рисунками.
Стволовые клетки, полученные из молочных зубов
Эмаль — самая твёрдая ткань организма, в поверхностном слое которой постоянно происходят процессы реминерализации за счёт поступления минеральных компонентов из ротовой жидкости. В образовании эмали участвуют амелобласты, отсутствующие в зрелой эмали и прорезавшемся зубе, поэтому регенерация эмали по завершении её формирования невозможна. В то же время это не статичная ткань, она может меняться — толщина эмали достигает 2,5 мм по режущему краю, 1,5-1,7 мм - на жевательной поверхности коренных зубов, уменьшаясь по мере приближения к шейке зуба [10, 13, 17, 31, 51].
Эмаль состоит из структурных единиц - эмалевых призм диаметром около 5 мкм [10, 13]. Каждая призма расположена в промежутке между дентино-эмалевым соединением и наружной поверхностью эмали и ориентирована по отношению к этим структурам под углом от 90 до 60
Эмалевые призмы варьируют по длине, в зависимости от их конкретной локализации в области коронки. Там, где эмаль имеет наибольшую толщину (режущий край, поверхность смыкания), эмалевые призмы более длинные, чем те, которые расположены в области эмалево-цементного соединения [13, 17,26].
Эмаль образуют органические и неорганические вещества, а также вода. Их относительное содержание в весовых процентах составляет 1:96:3, в объёме - 2 %, до 90 %, 9 %, соответственно. Фосфат кальция, входящий в состав кристаллов гидроксиапатита, составляет 3Л всех неорганических веществ [10]. В состав органических веществ матрикса входят белки амелогенин, амелин (амслобластин), энамелины и тафтелин, ферменты и белки плазмы. Поляризующиеся амелобласты вырабатывают амелогенин и сиалофосфопротеин дентина. Предполагается, что большинство этих белков имеет отношение к процессам минерализации. [17]
Дентин - разновидность минерализованной ткани, составляющей основную массу зуба, с плотностью 2,1 г/см. Проницаемость дентина значительно больше, чем эмали, что связано как с физико-химическими свойствами самого вещества дентина, так и с наличием в дентине канальцев. В весовом соотношении он содержит 18 % органических, 70 % неорганических веществ и 12 % воды. По объёму органические вещества составляют 30 %, неорганические - 45 %, вода - 25 % [17, 84]. Из органических веществ главным компонентом является коллаген 1 типа.
В неминерализованном предентине преимущественно присутствует остеонектин, тогда как среди органических веществ матрикса — дентина-хондроитинсульфат и фосфолипиды, взаимодействующие с протеогликанами. Вырабатываемый и секретируемый одонтобластами сиалопротеин дентина служит центром образования кристаллов гидроксиаппатита (нуклеатором). В ходе дентиногенеза одонтобласты вырабатывают и выделяют в матрикс дентина ферменты из семейства (ММР), которые расщепляют белки матрикса [14, 17].
По мере созревания дентина в нём формируются дентинные канальцы, длина и величина просвета которых варьирует. Они заполнены жидкостью и содержат отростки одонтобластов и, возможно, афферентные нервные волокна. На ранних стадиях одонтогенеза отростки одонтобластов проходят по всей длине дентинных канальцев от пульпы до дентино-эмалевого или дентино-цементного соединения. А в зрелом дентине отростки одонтобластов могут отсутствовать в наружных отделах канальцев и не достигать этих соединений.
Дентин не содержит кровеносных сосудов, и его питание происходит через сосуды пульпы, далее питательные вещества поступают в тканевую жидкость и доставляются к одонтобластам. Соседство дентина с пульпой, а также особенности развития этих внутренних частей зуба и их тесная функциональная связь позволяют говорить о дентино-пульпарном комплексе [10,13,25].
Предентин - новообразованный и неминерализованный дентин, расположенный между слоем одонтобластов и дентином. После образования предентина и его минерализации тела одонтобластов остаются в периферической части пульпы, где образуют компактный слой. Таким образом, между предентином и околопульпарным дентином располагается фронт обызвествления — тонкая пластинка минерализующегося предентина (промежуточный дентин) [24, 25, 26, 51].
Разновидность дентина и неоднородность минерализации. Дентин - неоднородная структура, его морфологическая организация различна в зависимости от локализации и близости к конкретным структурам. Так просвет канальцев дентина охвачен концентрической манжетой с плотной периферией — перитубулярный дентином (оболочка Нейманна), который ближе к предентину практически отсутствует и не имеет фибрилл коллагена.
Самые наружные и самые внутренние части перитубулярного дентина минерализованы слабее срединной части, окружающей каналец манжетки. Перитубулярный дентин образуется постоянно, поэтому у взрослых перитубулярного дентина существенно больше, чем у детей.
Между канальцами расположен межканальцевый дентин, который менее минерализован, чем перитубулярный, и имеет относительно высокое содержание минеральных солей. В перитубулярном и межканальцевом дентине кристаллы гидроксиапатита организованы различно [10, 13, 17]
Дентин классифицируется по времени формирования. Первичный и вторичный дентин разделены темной линией, которая возникает по завершении образования дентина на стадии оппозиции [10, 17].
Первичный дентин формируется в процессе развития зуба (до образования анатомической верхушки) в ходе массового дентиногенеза и характеризуется регулярным расположением дентинных канальцев [17, 31]. Вторичный дентин, или дентин раздражения, откладывается между основной массой дентина (первичный дентин) и предентином. Он формируется после прорезывания зуба (после образования анатомической верхушки), постоянно образуется в течение всей жизни, характеризуется неупорядоченным расположением дентинных канальцев и коллагеновых волокон, образуется медленнее и менее минерализован, чем первичный [17, 31].
Сравнение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека с мезенхимальными стволовыми клетками зубов
Метод проверки электровозбудимости нервных рецепторов пульпы нашел в последние десятилетия широкое применение в стоматологической практике и получил название электроодонтодиагностики [33].
Электроодонтодиагностика основана на определении порогового возбуждения болевых и тактильных рецепторов пульпы зуба при раздражении электрическим током.
Электрический ток позволяет воздействовать на пульпу через минеральную оболочку зуба, легко и точно дозируется, не повреждает тканей пульпы зуба, что позволяет применять ток многократно. Многочисленными исследованиями установлено, что пульпа интактных здоровых зубов реагирует на ток в пределах от 2 до 6 мкА [32, 33, 59, 61, 70].
При патологических процессах в зубах и околозубных тканях, в чувствительных и двигательных нервах (тройничном и лицевом) происходит изменение порога возбудимости нервных рецепторов пульпы зуба вследствие или их прямого поражения, или вторичных атрофических процессов в пульпе.
В настоящее время электроодонтодиагностика является единственным методом, позволяющим судить о качественных и количественных нарушениях в пульпе зуба и используется при диагностике, дифференциальной диагностике и контроле за эффективностью проводимого лечения при различных стоматологических заболеваниях.
Чаще всего при патологии зубов и околозубных тканей снижается порог возбудимости нервных рецепторов пульпы. Снижение возбудимости в пределах 7-60 мкА свидетельствует о преимущественном поражении коронковой пульпы, 60-100 мкА - корневой пульпы. Снижение возбудимости до 101-200 мкА происходит при гибели пульпы и реагировании тактильных рецепторов периодонта.
Электровозбудимость пульпы широко варьирует при разных заболеваниях, поэтому цифровые показатели электроодонтодиагностики надо всегда рассматривать не изолированно, а в сочетании с результатами других клинических и аппаратурных методов исследования.
Определение электровозбудимости проводили аппаратом «ЭОТ 01 Аверон» (рис. 2.12.) - электроодонтотестер состояния пульпы зуба со звуковой и цифровой индикацией, модель ОСП 2.0» до препарирования, через 7-10 суток и месяц после препарирования зубов и изготовления временных коронок из специального композитного бис-акрилового материала для временных коронок «Protemp 3 Garant» (фирмы «ЗМ ESPE»).
Аппарат «ЭОТ 01 Аверон» (а) и момент проведения электроодонтометрического обследования (б) 2.4. Статистистический метод исследования По результатам исследования была сформирована база данных, статистический анализ которой производился с помощью прикладных программ Staftistica 6,0 и SPSS 10,0.
Для данных всех выборок определяли среднее арифметическое (М), среднее квадратическое отклонение (S) и ошибку средней арифметической (т) [65]. Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью критерия Стьюдента.
Оценивая показатели электровозбудимости пульпы витальных зубов (табл. 2.4) с показаниями электровозбудимостью пульпы в группе больных на 7—10 сутки после одонтопрепарирования и изготовления временных ортопедических коронок из специального композита выявили снижение электровозбудимости с достоверностью Р 0,001; - в группе больных через 1 месяц после одонтопрепарирования и изготовления временных ортопедических коронок из специального композита различия электровозбудимости пульпы по сравнению электровозбудимостью пульпы витальных зубов не выявлены с достоверностью Р 0,05; — при сравнении электровозбудимости пульпы в группе больных через 1 месяц после одонтопрепарирования и изготовления временных ортопедических коронок из специального композита с группой больных на 7-10 сутки после одонтопрепарирования и изготовления временных ортопедических коронок из специального композита выявили повышение электровозбудимости с достоверностью Р 0,001.
В группе с осложнениями у 6 больных электровозбудимость пульпы значительно возрастает по сравнению с показателями электровозбудимости пульпы витальных зубов с достоверностью Р 0,001, а сравнивая показатели данной группы с электровозбудимостью пульпы на 7-10 сутки после одонтопрепарирования и изготовления временных ортопедических коронок из специального композита, также достоверно с Р 0,001 значительное увеличение данного показателя.
Нами проведены морфологические исследования 85 пульп зубов человека (табл. 2.5). В контрольной группе, представленной 40 зубами, удаленными по плану ортодонтического лечения и предоставленными врачами г. Казани и районов РТ, выделены следующие подгруппы.
Опытная группа (45) - пульпа зубов, удаленная по клиническим показаниям после препарирования зубов под литые ортопедические конструкции (сюда вошли и 6 зубов из наблюдаемой нами клинической группы), пациентов, у которых в процессе ортопедического вмешательства произошло осложнение со стороны пульпы зуба, вследствие чего проводилось эндодонтическое вмешательство.
Общая характеристика экспериментального материала и морфологического блока исследований
Экспрессию а-гладкомышечного актина в нормальных интактных зубах у кролика наблюдали в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов и единичных клетках, которые располагались среди волокон соединительной ткани (рис. 3.23).
Через 7 дней наблюдали увеличение клеточности в центральных зонах пульпы, а также стаз и расширение мелких кровеносных сосудов, а-гладкомышечный актин экспрессировали гладкомышечные клетки стенки кровеносных сосудов (рис. 3.24) и уже не единичные, а многочисленные мелкие клетки (рис. 3.25), среди соединителыю-тканных элементов в центральной зоне пульпы.
Через 14 дней характер экспрессии а-гладкомышечного актина в стенках кровеносных сосудов не изменился (рис. 3.26). Однако количество а-гладкомышечно позитивных клеток уменьшалось по сравнению с концом первой недели (рис 3.27). Через 28 дней центральная зона пульпы незначительно отличалась по морфологии от таковых в здоровых, интактных, зубах (рис. 3.28).
Таким образом, мы обнаружили, что после препарирования зубов кроликов наблюдается ответная реакция со стороны клеток, прилежащих к слою одонтобластов, т.е. активация стволового компартмента в субодонтобластическом слое по экспрессии ЕМА и в центральных зонах пульпы по экспрессии а-гладкомышечного актина.
Но если в центральных зонах пульпы появление клеток, экспрессирующих а-гладкомышечный актин, наблюдали на 7-14 день, а к концу 4 недели морфология центрального слоя пульпы мало чем отличалась от интактных зубов, то полное восстановление субодонтобластического слоя и слоя одонтобластов не происходила и к 28 дню эксперимента.
Иммуногистохимическое окрашивание на а-гладкомышечный актин. Продукт реакции красного цвета. В стенках сосудов пульпы кролика на сроке 28 дней после препарирования. Ув.х400 Вероятно, одним из самых интересных результатов данного исследования был факт выявления на 28-й день эксперимента ЕМА-позитивных клеток не только на границе, но и в толще соединительнотканной основы пульпы.
Факт, что слой ЕМА-позитивных клеток обнаружился на границе одонтобластов и соединительной ткани, позволил нам высказать предположение, что часть клеток соединительной ткани может восполнять «страдающую» популяцию и дифференцироваться непосредственно в одонтобласты.
Присутствие же ЕМА-позитивных клеток в толще соединительной ткани позволяет нам сделать ещё одно предположение: внутри соединительнотканных элементов пульпы находятся клетки, и это, видимо, стволовые клетки, которые, как и их потомки, могут дифференцироваться в одонтобласты.
На основании полученных фактов можно выдвинуть рабочую гипотезу, что клетки мезенхимального столового компартмента могут дифференцироваться в предшественников одонтобластов для восстановления популяции клеток, синтезирующих дентин.
Реакция клеточных элементов пульпы зубов собак на препарирование твёрдых тканей зуба и различные временные коронки из материалов («Акрилоксид» и «Protemp 3 Garant»), изготовленные после препарирования Третий блок морфологических исследований был проведен нами на собаках, поскольку в эксперименте на кроликах нам не удалось оценить влияние различных типов коронок на клеточные реакции пульпы.
В первую очередь, это было связано с техническими трудностями в установке коронок на жевательные зубы кроликов, а на резцах они плохо фиксировались в связи с малыми размерами зубов, и, учитывая, то, что центральные зубы являются основными зубами для питания и пережевывания пищи, данные временные коронки не фиксировались на временный цемент и не сохраняли свою прочность.
В отличие от кролика и человека, в нормальной пульпе собаки специфическое окрашивание антигенов наблюдали только с антителами против а-гладкомышечного актина. Как и в пульпе человека и кролика, в интактных зубах собаки а-гладкомышечный актин экспрессировали только гладкомышечные клетки кровеносных сосудов (рис. 3.29).
На 7 сутки эксперимента при использовании обоих типов коронок наблюдали увеличение клеточности пульпы, однако в случае использования коронки из материала «Акрилоксид», наряду с этим, появлялись клетки, экспрессирующие а-гладкомышечный актин (рис. 3.30), чего не наблюдали при использовании и ношения временных коронок из материала «Protemp 3 Garant»(pHc. 3.31).
Через 2 недели во всех случаях, когда зуб был покрыт временной" коронкой из материала «Акрилоксид», наблюдалась воспалительная реакция разной степени выраженности, а среди воспаленных клеток имелись клетки, экспрессирующие а-гладкомышечный актин (рис. 3.32; 3.33).
В случае использования временных коронок из материала «Protemp 3 Garant» было отмечено увеличение клеточности пульпы и образование новых мелких кровеносных сосудов (рис. 3.34).
Через 28 дней в случае использования коронки из специального композита для временных коронок из материала «Protemp 3 Garant» морфология пульпы мало отличалась от морфологии пульпы интактных зубов (рис. 3.36), а вот в пульпе зубов, где использовалась пластмассовая временная коронка из материала «Акрилоксид», несмотря на то, что явления воспаления уменьшались, все ещё сохранялась воспалительная реакция, однако а-гладкомышечный актин выявлялся лишь в а-гладкомышечных клетках кровеносных сосудов (рис. 3.35).
Реакция клеточных элементов пульпы зубов кролика на препарирование твёрдых тканей зуба
Основным подходом для идентификации этих клеток был метод выделения клеток из пульпы с последующим культивированием их in vitro на различных подложках и с добавлением различных ростовых факторов.
Попытки описать фенотип свежевыделенных клеток не позволили чётко идентифицировать фенотипические признаки как предшественников, так и стволовых клеток пульпы, а главное, установить их локализацию в пределах пульпы. Именно поэтому до сих пор оставались неизвестны реакция стволовых и прогениторных клеток пульпы на одонтопрепарирование и различные виды временных коронок, изготовление которых является неотъемлемой частью алгоритма ведения пациентов с несъёмными ортопедическими конструкциями, что тормозило разработку щадящих и более физиологичных методов обработки зуба и поиск новых материалов для изготовления коронок.
Поэтому основной целью нашей работы было исследование клеточного состав пульпы зуба с позиции поиска прогениторных (стволовых) клеток и анализ клеточных реакций пульпы на ортопедические вмешательства.
Для достижения поставленной цели нами решались конкретные задачи. Первой задачей был анализ отдаленных результатов состояния пульпы отпрепарированных зубов в зависимости от материала, из которого были изготовлены временные коронки. Было проанализировано 96 медицинских карт стоматологических больных, которым на интактные витальные 182 зуба были изготовлены литые конструкции с изготовлением прямых временных коронок из пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» (фирмы «Стома»).
На основании результатов анализа медицинских карт и данных собственных экспериментальных исследований была набрана группа пациентов из 102 человек, которым на 216 интактных витальных зубов изготовлены литые конструкции с временными коронками из бис-акрилового материала «Protemp Garant» (фирмы «ЗМ ESPE»).
Наблюдения за динамикой процессов, происходящих в пульпе, проводились с учётом рентгенологической оценки до лечения и после припасовки литых конструкций.
Анализ данных электродиагностики 210 опорных витальных зубов после препарирования составил 6,82 ± 2,21мкА. Наиболее выраженная ответная реакция пульпы на раздражение электротоком проявлялась на 7— 10 сутки после препарирования и изготовления временных коронок с тенденцией к повышению электровозбудимости до 5,11±1,82 мкА.
В шести клинических случаях (2,8 %), на этапах изготовления постоянных конструкций, развились необратимые воспалительные изменения в пульпе отпрепарированных зубов, что обусловило проведение соответствующего эндодонтического лечения.
При этом показатели электроодонтометрии составляли 53,7±9,3 мкА. Анализ причин воспаления пульпы показал, что осложнения были связаны с аномалиями расположения препарируемых зубов и зубочелюстными деформациями.
Исследования зубов через 1 месяц после препарирования и с временными коронками из бис-акрилового материала (композита) «Protemp 3 Garant» позволили отметить тенденцию к снижению показателей электровозбудимости (6,9±2,4 мкА).
Таким образом, анализ медицинских карт стоматологических больных позволил установить, что использование пластмассы холодной полимеризации «Акрилоксид» и аналогов для изготовления временных коронок после препарирования витальных зубов в 70,8 % случаев ведёт к осложнениям со стороны пульпы.
Клиническое наблюдение с изготовлением временных ортопедических конструкций из специального бис-акрилового материала «Protemp 3 Garant» привело к эндодонтическому лечению в 2,8 % случаев, а в 87,2 % — к нормализации электровозбудимости пульпы опорных зубов.
Вторая задача нашего исследования была поисковая - необходимо было in situ изучить экспрессию эпителиальных и мезенхимальных маркеров, а также маркеров прогениторных и стволовых клеток в пульпе человека, кролика и собаки.
Наиболее значимым результатом этой части работы было установление факта экспрессии эпителиального маркера - эпителиального мембранного антигена в одонтобластах и их предшественниках в пульпе зубов человека и кролика.
Согласно нашим знаниям, обнаруженное нами наличие в одонтобластах эпителиального мембранного антигена — это первое описание факта экспрессии эпителиального маркера одонтобластами в мировой литературе.
Значение этого феномена достаточно важно не только для гистологии и цитологии, но для эмбриологии и регенеративной медицины, в первую очередь, потому, что обнаружен облигатный маркер одонтобластов и их предшественников, который можно использовать при изучении дифференцировки различных прогениторных клеток в одонтогенном направлении.
Таким образом, одонтобласты как клетки эктомезенхимы экспрессируют эпителиальный мембранный антиген.
Второе немаловажное значение имеет то, что этот антиген экспрессируется на поверхности клеток, и, следовательно, с помощью антител против этого антигена можно получать чистую популяцию одонтобластов и их предшественников как для анализа и изучения in vitro, так и для нужд тканевой инженерии.
