Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Патогенез заболеваний пародонта 11
1.1.1. Паро донтопатогенная микрофлора 12
1.1.2. Факторы вирулентности пародонтопатогенной микрофлоры 22
1.1.3. Иммунопатогенезпародонтита 29
1.2. Подходы к иммунотерапии воспалительных заболеваний 36
1.3. Тамерит: этапы создания, иммунотропная активность, перспективы клинического использования в стоматологии 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Методика экспериментальных исследований 50
2.2. Материалы и методы клинических исследований 56
2.3. Статистическая обработка результатов 61
Глава 3. Результаты собственных исследований 62
3.1. Экспериментальный поиск эффективных модуляторов цитокин-продуцирующей функции макрофагов как потенциальных средств патогенетической терапии заболеваний пародонта 60
3.2. Результаты клинических исследований целесообразности использования тамерита в комплексной терапии пародонтита 72
3.2.1. Клинико-иммунологическая характеристика обследованных лиц 72
3.2.2. Клиническая эффективность тамерита у больных с хроническим пародонтитом 75
3.2.3. Иммунокорригирующая активность тамерита у больных с хроническим пародонтитом 82
3.2.3.1. Влияние тамерита на показатели клеточного и гуморального иммунитета периферической крови больных с пародонтитом 83
3.2.3.2. Влияние тамерита на уровень ключевых про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и десневои ткани пациентов с пародонтитом 85
Заключение 87
Выводы 95
Практические рекомендации 96
Указатель литературы
- Факторы вирулентности пародонтопатогенной микрофлоры
- Тамерит: этапы создания, иммунотропная активность, перспективы клинического использования в стоматологии
- Статистическая обработка результатов
- Клинико-иммунологическая характеристика обследованных лиц
Факторы вирулентности пародонтопатогенной микрофлоры
Большинство исследователей объясняет развитие воспалительно-деструктивных изменений пародонта влиянием зубных отложений (бляшки). 1 мг зубного налета содержит около 1-3 х 108 микроорганизмов [30].
Роль бактерий зубной бляшки как основного этиологического фактора пародонтита в настоящее время признается большинством специалистов [12,148,189,210].
И.В.Безрукова и А.И.Грудянов приводят развернутый ответ на возникающий в этой связи вопрос: почему на уровне выраженной деструкции микробный фактор начинает проявлять себя у разных лиц в разном возрасте, тогда как поверхностные воспалительные изменения в виде гингивита выявляются в 50-80% случаях уже у детей раннего школьного возраста [12]?
По мнению авторов, это происходит, во-первых, потому, что при общем приблизительно равном количестве микробных скоплений их качественный состав неодинаков. У подавляющего большинства детей микрофлора относительно неагрессивная, и только в единичных случаях в ее состав входят микроорганизмы, обладающие высокой повреждающей активностью в отношении кости и связочных образований периодонта.
Во-вторых, при одинаковом количественном и качественном составе микрофлоры ее повреждающий эффект определяется тем, насколько сильны механизмы местной и общей тканевой защиты у человека. Если они находятся выше определенного уровня, то повреждающий эффект микроорганизмов либо вообще не реализуется, либо сводится к минимуму, ограничиваясь поверхностным воспалением тканей пародонта - гингивитом. Если же уровень защиты тканей полости рта и организма в целом оказывается ниже какого-то минимального порога, то такая защита не способна в достаточной мере нейтрализовать токсический эффект микрофлоры, и повреждение распространяется на глубокие структуры пародонта. Более того, в зависимости от того, насколько снижен уровень защитных механизмов, какие из них поражены - только местные или местные и общие, различается и глубина повреждения у лиц примерно одинакового возраста [12].
Основываясь на других литературных данных [161,221], следует добавить к вышеприведенным аргументам, что глубина повреждения тканей пародонта определяется не только снижением неспецифических и специфических защитных механизмов, но и во многом степенью избыточной продукции провоспалительных медиаторов иммунокомпетентными клетками, активированными микробными агентами. То есть, иммунореактивность макроорганизма играет существенную роль не только в предотвращении патогенной колонизации пародонта, но и в поддержании патологического процесса.
Достаточно полная характеристика микрофлоры пародонтального кармана представлена Л.А.Дмитриевой и соавторами [22]. Авторы рассматривают поэтапное изменение микрофлоры в области десневого края.
В норме в полости рта человека присутствуют более 300 морфологически и биохимически различных групп и видов бактерий. При строгом соблюдении правил гигиены полости рта, на десневом крае находится небольшое количество бактерий, и десна остается здоровой [29]. Пренебрежение гигиеническими правилами приводит к накоплению бактерий на зубах: уже через четыре часа обнаруживается 103—104 бактерий на 1 мм2 зубной поверхности; среди них -Streptococcus и Actinomyces, а также грамотрицательные, факультативные анаэробные палочки, такие как Haemopholus, Eikenella и Actinobacillus actinomycetemcomitans. За сутки число бактерий увеличивается на два-три порядка, формируя массивные скопления в поверхностных слоях зоны десневой борозды. Характерной чертой микробных скоплений на зубах (зубного налета) является то, что микроорганизмы формируют структуры, перпендикулярные зубной поверхности, за счет различных механизмов адгезии и коагрегации. Жгутиковые и нитевые микроорганизмы играют важную роль в удержании микробных масс [22].
Скопление бактерий в области десневого края через 3-4 дня приводит к гингивиту, при котором создаются новые благоприятные условия для роста бактерий, и продолжает изменяться состав микрофлоры. На основании данных микроскопических исследований различают 3 фазы формирования зубного налета. В первую фазу (до 4 ч после гигиенических процедур) преобладают грамположительные кокки, одиночные грамположительные палочки и грамотрицательные кокки, во вторую фазу (4-5 суток) появляется значительное количество грамположительных нитевидных форм и жгутиковые микроорганизмы, в третью фазу наблюдают смещение микробного спектра в сторону преобладания грамотрицательных форм, бактероидов, спирилл и спирохет. При стойком гингивите культивирование бактерий из пораженных участков обнаруживает увеличение количества облигатных анаэробов, особенно из группы бактероидов и извитых форм, по сравнению с факультативными анаэробами.
В.С.Иванов приводит данные по содержанию представителей микрофлоры зубного налета лиц, не соблюдавших правила гигиены полости рта, в зависимости от времени культивирования (таблица 1) [30].
Формирование пародонтальных карманов означает появление принципиально новых обширных участков со свойствами, способствующими бактериальной колонизации. Микробная бляшка растет не только апикально, но и латерально, распространяясь в нижележащие области, где волокна периодонта «врезаны» в поверхность корня зуба. Скорость роста бляшки зависит в значительной степени от количества углеводов в пище: максимальная скорость роста отмечается при поступлении сахарозы, несколько меньшая - глюкозы и фруктозы [30]. Эти углеводы являются источниками синтеза интра- и экстрацеллюлярных полисахаридов кокковыми микроорганизмами.
Тамерит: этапы создания, иммунотропная активность, перспективы клинического использования в стоматологии
С нашей точки зрения, краткое описание основных этапов создания тамерита позволит лучше понять некоторые механизмы его фармакологического действия, анализ которых побудил нас к исследованию эффективности этого лекарственного средства при заболеваниях пародонта.
Созданию тамерита - препарата с иммуномодулирующей, антиоксидантной и противовоспалительной активностью - предшествовала работа по поиску биологически активных соединений из группы фталгидразида [1].
Один из наиболее активных дериватов фталгидразида - тамерит - как объект углубленного исследования был выбран в результате скрининга группы химических веществ, изменяющих функциональную активность макрофагов. На первом этапе исследований была продемонстрирована способность тамерита изменять скорость синтеза ДНК, РНК и белка макрофагами. Трехчасовая преинкубация как резидентных, так и индуцированных пептоном мышиных перитонеальных макрофагов с препаратом в концентрациях 25-125 мкг/мл приводила к существенному снижению синтеза нуклеиновых кислот и протеинов [1].
Изучение спонтанной и индуцированной зимозаном или форболмиристат ацетатом респираторной активности макрофагов после кратковременной инкубации клеток с тамеритом in vitro выявило способность исследуемого вещества в концентрации 200 мкг/мл достоверно увеличивать потребление кислорода клетками. Интересно, что ex vivo препарат вызывал снижение потребления кислорода перитонеальными макрофагами, выделенными через 1-4 часа после его внутривенного введения животным в дозе 50 мг/кг. Это свидетельствует о способности тамерита оказывать разнонаправленные эффекты на макрофаги. Испытания дозозависимых эффектов тамерита на цитокин-продуцирующую функцию макрофагов in vitro подтвердили свойство препарата изменять разнонаправленно активность этих клеток. В концентрации 1-Ю мкг/мл тамерит существенно стимулировал продукцию ИЛ-1р и ФНО-а перитонеальными мышиными макрофагами, тогда как в больших дозах (100 мкг/мл) препарат достоверно (р 0.05) угнетал выработку обоих цитокинов [38].
Принимая во внимание обнаруженную способность тамерита модулировать функциональную активность моноцитов/макрофагов и большое значение этих клеток и их продуктов в развитии симптомов интоксикации при инфекционных заболеваниях, было изучено влияние тамерита на течение экспериментальной сальмонеллезной эндотоксинемии и уровень ФНО у кроликов «шиншилла». Обнаружено, что, в контрольной группе введение 1 мкг/кг очищенного эндотоксина S. thyphimurium вызывает через 0,5 часа появление симптомов интоксикации, что коррелировало с повышением уровня ФНО в сыворотке крови с пиком около 3 часов после инъекции эндотоксина. Клинически у животных отмечались: адинамия, повышение температуры на 1-2 градуса, учащение дыхания, тахикардия, отказ от пищи и воды. Спустя 40-50 минут к симптомам интоксикации присоединялась диарея. 50% животных погибало в течение первых суток, из них 20% - в течение трех первых часов эксперимента. Внутривенное введение тамерита в дозе 10 мг/кг через 0,5 часа после инъекции бактериального ЛПС приводило к тому, что уровень ФНО в плазме крови через 3 часа эксперимента был в 4 раза ниже показателей в контрольной группе и практически не отличался от значений ФНО у интактных животных. Лечение тамеритом предотвращало в 100% случаев гибель животных, уменьшало выраженность и продолжительность симптомов интоксикации и диареи. Сравнительное изучение выявило существенные преимущества тамерита в купировании симптомов сальмонеллезной эндотоксинемии по сравнению с ингибиторами синтеза простагландинов и другими нестероидными противовоспалительными средствами [1]. Исследование показателей активности микробицидной системы нейтофильных гранулоцитов (НСТ-тест, уровень миелопероксидазы и катионных белков) при экспериментальной сальмонеллезной эндотоксинемии выявило существенное (10-15-кратное) угнетение через 0,5-3 часа после введения ЛПС. Инъекция 10 мг/кг тамерита через 0,5 часа от начала эксперимента приводила к быстрой нормализации указанных показателей. Так, уже на третий час эксперимента значения НСТ-теста превышали в 9 раз, а активность миелопероксидазы - в 8,5 раз показатели контрольной группы, приближаясь к физиологической норме интактных животных [1].
В дальнейшем было продемонстрировано, что тамерит в дозах 1-Ю мкг на 1x10 клеток in vitro достоверно усиливает фагоцитоз частиц латекса лейкоцитами, выделенными из периферической крови здоровых людей [7].
Изучение биологических эффектов препарата на интактных крысах и животных с плоскими инфицированными ранами кожи показало, что исследуемое вещество в дозе 20 мг/кг приводит через 3 часа после внутривенного введения к значительному увеличению супероксидобразующей активности нейтрофилов, превышающей вдвое аналогичные показатели контрольной группы.
Следует отметить, что при увеличении дозы препарата до 100-150 мг/кг происходило, наоборот, угнетение супероксидобразующей активности и адгезивных свойств нейтрофильных гранулоцитов. В результате значительно снижалась неспецифическая резистентность к бактериальной инвазии. Это было использовано в моделировании грамположительного и грамотрицательного сепсиса для быстрого развития характерных симптомов после заражения животных [1].
Статистическая обработка результатов
Общая характеристика (возраст, пол, тяжесть заболевания) и критерии распределения по степени тяжести 92 больных хроническим генерализованным пародонтитом представлены в разделе «Материалы и методы исследования».
Нами проанализированы результаты опроса и осмотра пациентов опытной (47 человек) и контрольной (45 человек) групп больных.
В целом жалобы и объективные симптомы заболевания в группах были сходны и статистических различий в частоте их выявления в группах не обнаружено (таблицы 8 и 9).
Как видно из таблицы 8, у большинства больных определялись кровоточивость, подвижность зубов различной степени, болевые ощущения, гнойные выделения из патологических зубодесневых карманов, гиперчувствительность и оголение шеек зубов. Кроме того, больные предъявляли жалобы характерные для астеновегетативного синдрома и вторичной иммунной недостаточности.
Частыми (примерно у 1/3 больных) были жалобы на невротические расстройства: раздражительность, чувство внутренней напряженности, беспокойство, тревогу и др. Вегетативные нарушения, нашедшие отражение в ощущениях больных, проявлялись преимущественно периферическими вегетативно-сосудистыми расстройствами: диффузный гипергидроз на фоне ощущения зябкости, склонность к покраснению кожи. Таблица 8 Основные жалобы и их частота у обследованных больных
Выпадение зубов 14 29,8 15 33,3 Анализ клинической картины показал, что наиболее часто встречающимися симптомами являются наличие пародонтальных карманов (основного признака пародонтита), гиперемия, отёчность десневого края, кровоточивость десен при зондировании, подвижность зубов, наличие мягких и твёрдых над- и поддесневых отложений (таблица 9). Таблица 9. Характеристика объективных симптомов заболевания у обследованных больных
Со стороны показателей крови у большинства больных хроническим пародонтитом грубых изменений не обнаружено. Однако у 6 (12,8%) пациентов опытной и 7 (15,6%) больных контрольной группы наблюдали умеренный нейтрофильный лейкоцитоз, у 17 (36,2%) больных опытной группы и 15 (33,3%) пациентов контрольной - умеренную лимфопению, у 5 (10,6%) больных в опыте и у 4 (8,9%) в контроле - тенденцию к повышению числа эозинофилов. Таблица 10. Пародонтальные индексы обследованных больных
Биохимические показатели крови сильно варьировали, но были в основном в пределах нормальных значений. Тем не менее, сопоставление этих показателей с таковыми у обследованных нами здоровых доноров выявило статистически значимое увеличение уровня в сыворотке крови ACT на 26% (р 0,05) и тенденцию к повышению концентрации ЛДГ.
Панорамные и прицельные рентгенологические исследования выявили характерные для пародонтита изменения альвеолярной кости. У больных с легкой формой пародонтита выявляли остеопороз и деструкцию кортикальной пластинки вершин межальвеолярных перегородок, расширение периодонтальной щели в пришеечной области зубов. У пациентов с заболеванием средней тяжести наблюдали истинные костные карманы и фестончатый вид альвеолярной костной ткани. Тяжелые формы заболевания характеризовались резорбцией костной ткани альвеолы более 2/3 корня зуба и глубокими (вплоть до верхушек корня зуба) костными карманами. Убыль костной ткани альвеолы составляла 51,9+3,1% и 52,6+3,3 в контрольной и опытной группах соответственно. Изучение показателей клеточного и гуморального иммунитета периферической крови проведено у 50 больных с пародонтитом средней тяжести: у 25 больных опытной и 25 пациентов контрольной группы.
Результаты иммунологических исследований суммированы в таблице 11. Обнаружены изменения показателей как клеточного, так и гуморального иммунитета. В частности, в сравнении со здоровыми донорами выявлено снижение общего числа лимфоцитов в основном за счет CD3+, CD4+ клеток и выраженную тенденцию к увеличению числа CD8+ лимфоцитов, что отражалось в снижении иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8). Кроме того, наблюдались достоверное снижение концентрации в сыворотке крови всех классов иммуноглобулинов, тенденция к увеличению числа CD20+ клеток, и повышенные показатели НСТ-теста.
Следует заметить, что большинство вышеперечисленных показателей не выходили за верхние и нижние границы нормальных физиологических колебаний, указанные в иммунологических пособиях [27]. Констатированные нами изменения определялись в сравнении с показателями обследованной нами группы здоровых доноров.
Помимо изучения показателей иммунного статуса пациентов, нами проведено исследование концентраций ключевых про- и противовоспалительных цитокинов в десневой ткани и сыворотке крови.
Клинико-иммунологическая характеристика обследованных лиц
Как следует из представленных в обзоре литературы данных, степень воспалительно-деструктивных изменений пародонта в большей степени определяется не количеством патогенных бактерий, колонизирующих пародонтальные ткани, а иммунореактивностью макроорганизма. При этом прогрессирующее развитие пародонтита связано одновременно как с недостаточностью основных факторов неспецифической резистентности и специфического антибактериального иммунного ответа, так и с вызванной микробными агентами избыточной продукцией провоспалительных медиаторов моноцитами/макрофагами, фибробластами и некоторыми другими клетками. Бактериальные компоненты, в первую очередь липополисахариды грамотрицательных бактерий, оказывают свое действие на функцию клеток промоноцитарного происхождения, связываясь со специфическими рецепторами (CD14, TLR-4).
Именно поэтому поиск высокоэффективных иммунотропных лекарственных препаратов, способных корригировать вышеуказанные иммунные сдвиги, представляется весьма актуальным при разработке рациональных тактических схем комплексной терапии заболеваний пародонта.
По мнению Р.М.Хаитова, Б.Ф.Пинегина [66] и многих других ведущих иммунологов, центральная роль макрофага в воспалительных реакциях и в защите организма от инфекционных агентов предопределяет то, что в большинстве ситуаций основной мишенью действия иммунотропных средств должен быть макрофаг, который в свою очередь дает импульсы к усилению функциональной активности факторов как клеточного, так и гуморальнного иммунитета. В результате, под действием регуляторов функции макрофагов в движение приходит вся система иммунитета, и это соответствует естественному ходу активации иммунной системы, в частности наблюдаемого при развитии антибактериального иммунного ответа [3,66].
Все вышесказанное обусловило направление предпринятого нами поиска лекарственных средств, пригодных для иммунопатогенетическоЙ терапии пародонтита. Наше внимание привлекли препараты, у которых основной точкой приложения фармакологического действия являются моноциты/макрофаги. В результате анализа литературных данных [7,31,32,59,66] были выбраны для сравнительного изучения 3 лекарственных средства, способных регулировать функцию этих клеток: синтетический аналог компонента бактериальной клеточной стенки некоторых бактерий - ликопид, дериват аминофталгидрозида - тамерит, а также производное полиэтиленпиперазина - полиоксидоний.
Что касается разработки адекватной тест-системы для сравнительного доклинического изучения этих препаратов, мы попытались смоделировать in vitro ситуацию, воспроизводящую одно из ключевых звеньев патогенеза пародонтита, - активацию цитокин-продуцирующей функции макрофагов бактериальным эндотоксином. Исследуемые лекарственные средства добавляли к культуре мышиных макрофагов, предварительно инкубированных с ЛПС в субоптимальной концентрации. Кроме того, изучали влияние ликопида, тамерита и полиоксидония на спонтанную продукцию провоспалительных цитокинов: ИЛ-1(3 и ФНО-а. При этом препараты тестировались в эквиграммовых концентрациях в 3 серийных десятикратных разведениях. Использованные дозы изучаемых лекарственных средств продиктованы, помимо других соображений, рекомендациями Государственного фармакологического комитета РФ по доклиническому изучению иммунотропной активности фармакологических веществ в тест-системах in vitro [64,65].
Полученные нами в результате экспериментальных исследований данные позволили выбрать тамерит из 3 сравниваемых препаратов как потенциально эффективное средство патогенетической терапии заболеваний пародонта, которое способно снизить гиперпродукцию провоспалительных цитокинов макрофагами и одновременно восстановить эффективный антибактериальный иммунный ответ.
Правильность этого выбора была подтверждена в клинических испытаниях тамерита у больных с хроническим пародонтитом.
Включение этого препарата в комплекс лечебно-реабилитационных мероприятий приводило к существенному улучшению результатов лечения по основным клиническим и рентгенологическим критериям. Тамерит потенцировал эффект комплексной терапии и по такому важному показателю, как продолжительность индуцированной ремиссии.
Нами установлено, что терапевтическое действие препарата коррелирует с его иммунокорригирующей активностью, проявляющейся в нормализации системных показателей клеточного и гуморального иммунного ответа, и регуляции продукции про- и противовоспалительных цитокинов.
Изучение исходного иммунного статуса у больных с хроническим пародонтитом средней тяжести до лечения выявило, в целом, те же иммунные расстройства, на которые указывали большинство других авторов, исследовавших системные показатели клеточного и гуморального иммунитета при заболеваниях пародонта [61,74]. Исключение составляли лишь наши данные по уровню иммуноглобулинов в сыворотке крови: в работе многих исследователей документирована тенденция не к снижению, а, наоборот, к повышению уровня основных классов иммуноглобулинов. Вероятно, эти различия связаны с тем, что разные авторы проводили исследования в различные фазы (обострение, ремиссия) заболевания, а также на отличных по степени тяжести и наличию сопутствующих заболеваний группах больных.
Включение в комплексную терапию хронического пародонтита тамерита способствовало стойкой нормализации практически всех измененных показателей иммунной системы, тогда как в контрольной группе традиционное лечение не влияло на иммунный статус. Очевидно, сохранение иммунных расстройств в значительной степени определяет дальнейшее прогрессирование заболевания.
Отдельно следует отметить изменение кислородозависимого метаболизма нейтрофильных лейкоцитов, оцениваемого в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Установлено, что традиционная терапия не влияет на исходно повышенные показатели НСТ-теста. Это свидетельствует о том, что у больных сохраняется метаболическая гиперактивация нейтрофилов, ведущая к разрушению соединительной ткани связочного аппарата зубов и резорбции костной ткани альвеолярных отростков. В группе пациентов, получавших тамерит, по результатам исследования через 1 и 6 месяцев после лечения наблюдалось снижение этого показателя до нормальных значений.
Важным фактом является обнаруженное нами модулирующее действие тамерита на продукцию про- и противоспалительных цитокинов.
Исходно у больных с хроническим пародонтитом различных степеней тяжести выявлены повышенные концентрации ИЛ-ір и ФНО-а в сыворотке крови и тканях десны, причем их уровень коррелировал с тяжестью заболевания и выраженностью воспалительных изменений в десне. Эти данные не противоречат литературным данным [135]. Тамерит вызывал достаточно стойкое снижение концентраций тканевых и циркулирующих ИЛ-ір и ФНО-а -ключевых медиаторов, обусловливающих выраженность как местных, так и системных проявлений воспалительного синдрома.
С нашей точки зрения, среди выявленных иммунорегуляторных эффектов тамерита особого внимания заслуживает его способность повышать содержание ИЛ-10 в сыворотке крови и тканях воспаленной десны.
ИЛ-10 обладает мощным противовоспалительным действием и синтезируется Т1і2-клетками, а также цитотоксическими Т-лимфоцитами второго типа (Тс2) и макрофагами. Он стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, подавляет синтез Т-хелперами 1 типа ИЛ-2 и ИФН-у, угнетает продукцию ИЛ-10, ФНО-а, ИЛ-12 макрофагами [27].
M.Yamamoto и соавторы, изучая лейкоцитарный состав очагов поражения при пародонтите, обнаружили повышенное накопление в участках воспаления макрофагов и плазматических клеток; CD4+ Т-клетки составляли 20-30% гингивальных лимфоцитов, среди которых преобладали представители Th2-субпопуляции с преимущественной продукцией цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, что объясняет повышенное содержание антителопродуцентов в зоне воспаления [224]. Число клеток, синтезировавших ИЛ-4 и ИЛ-6 в пораженных участках, преобладало над количеством продуцентов ИЛ-2 и ИФН-у, что свидетельствует о сдвиге иммунного компонента в области деструкции в сторону ТЬ2-ответа. Среди лейкоцитов численность клеток, экспрессировавших ИЛ-10 превышала количество клеток, содержащих IL-6 и TNF-a [146].
![Клинико-физиологическое обоснование применения гирудо- и фитотерапии при лечении хронических воспалительных заболеваний пародонта [Электронный ресурс]](/i/i/4323/200084.png "Клинико-физиологическое обоснование применения гирудо- и фитотерапии при лечении хронических воспалительных заболеваний пародонта [Электронный ресурс] Девяткова Мария Александровна")