Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 12
1.1. История развития «клеточной и тканевой инженерии» 12
1. 2. Свойства фибробластов (фенотипирование и дифференцировка) 14
1.3. Взаимосвязь между мезенхимальными стволовыми клетками и фибробластами 18
1. 4. Применение факторов роста в стоматологии 20
1.5. Применение клеточных культур в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии 23
1.5. 1. Экспериментальные исследования на животных 23
1. 5. 2. Клинические исследования на человеке 26
Глава 2. Материал и методы исследования 31
2.1. Клинический материал и схема исследования 31
2.2. Забор исходного материала для выращивания клеток 33
2.3. Описание методики инъецирования аутофибробластов 36
2.4. Подбор дозы и кратности введения клеточных культур 36
2.5. Оценка эффективности и безопасности метода 37
2.6. Юридические аспекты проводимого исследования 38
2.7. Методы исследования 39
2.7.1. Клиническая оценка рецессии десны 40
2.7.2. Оценка уровня гигиены полости рта 41
2.7.3. Оценка плотностных характеристик и микроструктуры десны 43
2.7.4. Изучение метрических параметров десны 46
2.7.5. Фотометрия 48
2.7.6. Изучение кровотока десны 48
2.7.6.1. Реопародонтография 49
2.7.6.2. Лазерная допплеровская флоуметрия 50
2.7.7. Статистический анализ 51
Глава 3. Получение клеточной культуры фибробластов в лабораторных условиях 53
Глава 4. Результаты собственных исследований 56
4.1. Оценка цвета и структуры тканей 56
4.2. Анализ метрических показателей цифровых фотографий 56
4.3. Оценка уровня гигиены полости рта 57
4.4. Оценка влияния различных доз клеточных культур на состояние краевой и прикрепленной десны 58
4.5. Динамика изменения глубины десневых карманов и рецессии десны 59
4.6. Динамика плотностных характеристик и микроструктуры десны 65
Глава 5. Результаты функциональных исследований 68
Клинические примеры 87
Глава 6. CLASS Обсуждение полученных результато CLASS в 95
Глава 5. CLASS Заключени CLASS е 114
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список литературы 121
Приложение 141
- Взаимосвязь между мезенхимальными стволовыми клетками и фибробластами
- Оценка эффективности и безопасности метода
- Анализ метрических показателей цифровых фотографий
- Динамика плотностных характеристик и микроструктуры десны
Введение к работе
Актуальность исследования 4
Научная новизна 8
Практическая значимость работы 9
Основные положения, выносимые на защиту 10
Внедрение результатов исследования в практику 10
Взаимосвязь между мезенхимальными стволовыми клетками и фибробластами
Следует отметить также связь фибробластов и стволовых клеток, которым уделяется столько внимания в последнее время. Это исходно разные понятия, потому что стволовые клетки не имеют феномена старения при культивировании.
Тесная взаимосвязь между мезеихимальными стволовыми клетками и фибробластами в культуре отмечена еще в работах первооткрывателя стволовых клеток Фриденштейна А.Я. в середине 60-х годов прошлого столетия [130]. В его лаборатории впервые была получена однородная культура плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, прикрепленных к подложке, которые сохраняли высокий темп размножения в недифференцированном состоянии во многих пассажах. Работы Фриденштейна показали, что мезенхимальные стволовые клетки после прикрепления при пересеве с малой плотностью формировали клоны фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток. В дальнейшем связь между фибробластами и мезенхимальными стволовыми клетками была подтверждена другими исследователями, однако сохранялось мнение, что фибробласты при культивировании утрачивают способность к дифференцировке в другие типы клеток. В исследованиях последних лет [136] in vitro показано, что фибробласты потенциально могут приобретать свойства клеток скелетной мускулатуры, если они трансплантируются в скелетную мышцу.
Также показано, что пролиферативный ответ культивируемых фибробластов на стимуляцию цитокинами и синтез ими коллагена и неколлагеновых белков после стимуляции трансформирующим фактором роста-р не зависели от возраста донора клеток [13]. Количество публикаций, посвященных высокой пластичности культивируемых фибробластов, быстро увеличивается [36,40,45,52].
Пересаженные аллогенные фибробласты оказывали непосредственное влияние на заживление ран (Ross, 1968) и на их эпителизацию (Coulomb et al, 1989), продуцировали коллагены I и II типов (Varga et al., 1987) и компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан (Halfter et al., 1990), фибронектин (Matsura, Hakamori, 1985), некоторые факторы роста, а также другие вещества.
Совсем недавно был сделан очередной прорыв в изучении фибробластов. Группа исследователей разработала метод обратной дифференцировки фибробластов человека в плюрипотентные стволовые клетки. Полученные клетки морфологически идентичны эмбриональным стволовым клеткам человека, полученным из внутренней клеточной массы бластоцисты, их ДНК совпадает с ДНК человека, у которого были взяты фибробласты. Кроме того авторы доказали, что полученные клетки дают все три зародышевых лепестка [148]. Это исследование является важным шагом на пути получения неограниченного количества эмбриональных стволовых клеток, которые идеально подходят пациенту, не вызывают этических проблем и могут использоваться для лечения широкого спектра заболеваний, справиться с которыми наука сейчас не способна.
Согласно Л.И. Бобро, (1991), фибробласты представляют собой клеточную популяцию, функциональная полипотентность которой находится в зависимости как от местных, так и от общих факторов. Способность фибробластов вступать в контакты с различными клетками, проявлять высокую чувствительность к нарушениям местного гомеостаза и оказывать на него самое активное регулирующее воздействие дает основание считать их одними из регуляторов гомеокинеза. Фибробласты играют ключевую роль в регуляции метаболизма и структурной стабильности указанных выше веществ и структурных элементов, а также в регуляции их микроокружения и формирования эпителиально-мезенхимального взаимодействия.
1. 4. Применение факторов роста в стоматологии
Имеется значительное число работ, свидетельствующих о большой роли факторов роста, влияющих на регуляцию соединительной ткани и, в частности, пародонтальных структур [22].
Факторы роста — это регуляторные пептиды (тканевые гормоны), вырабатываемые клетками различных типов, которые в значительной степени ускоряют регенераторный процесс.
Фибробласты продуцируют следующие ростовые факторы:
1. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) положительно влияет на рост всех типов клеток кожи, стимулирует продукцию компонентов внеклеточного матрикса фибробластами (фибронектина и коллагена), стимулирует хемотаксис фибробластов и выработку ими новых волокон коллагена, эластина и фибронектина;
2. Трансформирующий ростовой фактор альфа (TGF-альфа) влияет на ангиогенез (Chen J., et al., 1993). Продуцируемые фибробластами факторы роста могут ускорять восстановление пораженной дермы, что во многом объясняет стимулирующее воздействие аллогенных клеток на заживление ран. 3. Трансформирующий ростовой фактор бета (TGF-бета) стимулирует хемотаксис фибробластов и синтез коллагена 1 типа и фибронектина (Капе С. et al., 1991).
S.Lorimier, W.Hornebeck (1998) показали, что фибробласты, внесенные в рану, выделяют основной фактор роста фибробластов (ОФРФ), влияющий на ускоренный ангиогенез, в результате которого клетки, сопутствующие новообразованным сосудам (так называемые перициты), сохраняющие свойства мезенхимальных клеток и являющиеся стволовыми плюрипотентными клетками, становятся способными к превращению в фибробласты и остеобласты. Кроме того, регенерационный остеогенез осуществляется за счет стимуляции остеогенных клеток надкостницы при обязательном участии растущих новообразованных кровеносных сосудов.
В ряде экспериментальных исследований in vivo было также установлено выраженное стимулирующее влияние ОФРФ на ускорение процессов ангиогенеза [185]. Так, в опытах in vitro и in vivo показано, что в присутствии ОФРФ значимо усиливается пролиферация эндотелиоцитов капилляров и крупных сосудов, интенсифицируется миграция эндотелиоцитов и прорастание этих клеток в трехмерный коллагеновый матрикс с формированием тубулярных структур, схожих с кровеносными капиллярами [165]. Кроме того, ОФРФ стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и перицитов, которые играют важную роль в формировании сосудов.
Оценка эффективности и безопасности метода
На доклиническом этапе исследования оценивали безопасность использования методики в клинических исследованиях с участием человека, а также риск возникновения осложнений в день первого введения аутофибробластов и далее через 1 и 2 недели, 1 и 3 месяца после инъекций клеточных культур. Учитывали наличие или отсутствие побочных эффектов в виде развития как системных (анафилактическая реакция, реакция «трансплантат против хозяина» и т.п.), так и местных осложнений (гематомы, инфекционные осложнения). 2.6. Юридические аспекты проводимого исследования
Все исследования в ФГУ ЦНИИС, начиная с получения материала и заканчивая непосредственным проведением клеточной трансплантации, проведены в соответствии с решением Росздравнадзора о проведении клинических испытаний, а также с соблюдением существующих правовых, юридических и этических норм Российской Федерации:
1. Закон РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (1992, № 5142-1);
2. Закон РФ «Об охране здоровья населения Российской Федерации» (1999, №214-ФЗ);
3. Приказ МЗ РФ от 29.08.01 № 345 «О создании экспертного совета по рассмотрению научных исследований в области развития клеточных технологий и внедрению их в практическое здравоохранение»;
4. Этический кодекс Российского врача (1994);
5. Кодекс врачебной этики (1997);
6. Государственный реестр новых медицинских технологий;
7. Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения (2002);
8. Программа «Новые клеточные технологии - медицине» (2002);
9. Приказ № 325 «О развитии клеточных технологий в Российской
Федерации» от 25. 07. 2003г.
Практическое использование аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта человека согласно «Временной инструкции о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения» (Приказ МЗ РФ №325 от 25 июля 2003г. Приложение №3, Раздел 4) предполагает 3 этапа:
1. экспериментальный (испытание метода на моделях заболевания у животных);
2. ограниченная клиническая апробация метода (1 клиника, 15-30 пациентов); 3. расширенное испытание нового метода (мультицентровое).
В 2006 г. получен патент «Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата» (№ 2281776 от 20.08.2006г. Авторы - Зорин В.Л., Зорина А.И., Терехов СМ., Смирнова Т.Д., Трошинкин О.Ю., Зурабова Ю. А. Патентообладатель - Зорин В.Л.).
В 2006 г. ГУ Медико-Генетическим Научным Центром РАМН получено разрешение на «Забор, выделение, культивирование и хранение аутологичных фибробластов человека». Регистрационное удостоверение № ФС-2006/137 от 02.06.2006г.
В 2007 г. получено разрешение на проведение клинических исследований с использованием аутофибробластов в стоматологии (Регистрационное удостоверение № 01-3500/07 от 05.02.2007г.).
В процессе проведения данной работы применяли следующие методы исследования:
Оценка рецессии десны (по классификации Миллера, 1985);
определение индексов гигиены полости рта (метод Силнеса-Лоэ, 1962; Грин-Вермильона, 1960);
изучение микроструктуры десны с помощью оптического когерентного томографа (производство ИПФ РАН, г. Нижний Новгород);
изучение метрических параметров десны (для замера глубины десневых карманов и рецессии исследуемых зубов использовали градуированный пародонтальный зонд и автоматизированную компьютерную диагностическую систему «Флорида Проуб» (США);
оценка динамики кровотока исследуемого участка десны с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (ЛАКК-01, НЛП «ЛАЗМА», г. Москва) и реопародонтографии (НТЦ «Медасс», г. Москва);
фотометрия исследуемых участков десны (с использованием фотоаппарата Canon PowerShot G5 и мерной сетки). Контрольные обследования с применением комплекса диагностических методов производили в следующие сроки:
1. Фотографирование участка вмешательства каждый месяц;
2. Изучение толщины десны в динамике (до инъекции, через 2 нед., 2, 5 и 9 мес. после инъекции);
3. ЛДФ, РПГ - до инъекции и через 1, 3, 6 и 9 месяцев после инъекции аутофибробластов;
4. Florida Probe - до инъекции и в последующем 1 раз в месяц на протяжении 9 мес.
Результаты статистического анализа заносили в комбинированные таблицы.
Рецессии десны определяли по шкале Miller (1985):
I класс. Рецессия в пределах прикреплённой (кератинизированной) десны. Потеря десны и/или кости в межзубных промежутках отсутствует. Подкласс А: узкая. Подкласс В; широкая. Прогноз: возможно закрытие на 100%.
II класс. Рецессия в пределах свободной десны (апикальнее зоны прикреплённой десны). Потеря десны и/или кости в межзубных промежутках отсутствует. Подкласс А: узкая. Подкласс В: широкая. Прогноз: возможно закрытие на 100%.
Анализ метрических показателей цифровых фотографий
Сразу же после введения клеточных культур отмечалось напряжение тканей десны и перифокальное побледнение слизистой оболочки в месте проведенной инъекции, которое сохранялось на протяжении 2-3 часов. Кроме этого на десне имелись следы от вколов, которые исчезали самостоятельно в течение первых суток после проведения процедуры.
За весь последующий период наблюдения (до 9 мес.) цвет десны был бледно-розовым и не отличался от окружающих тканей полости рта. Симптомов воспаления десны (гиперемии, кровоточивости) не отмечено.
Кроме визуальной оценки состояния тканей производили фотосъемку участков рецессии десны и открытых межзубных пространств до процедуры инъекции аутофибробластов и на протяжении всего периода исследования (при стандартном увеличении 1:1).
Сравнение изображений цифровых фотографий показало, что, начиная со 2-го месяца после инъекции клеточных культур и до конца 4-го месяца наблюдения, отмечено нарастающее со временем утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекции аутоклеток, увеличение высоты межзубных десневых сосочков (рис. 8). В последующий период наблюдения (до 9 месяцев) достигнутые изменения фенотипа десны сохранялись. Рис. 8. Динамика изменений толщины и структуры кератинизированной десны, высоты десневого сосочка, выраженности десневого контура по данным цифровой фотометрии до инъекции клеток (а) и через 4 месяца после инъекционного введения аутологичных фибробластов (б). Горизонтальные линии использовались для планиметрического анализа цифровых фотографий.
Динамика гигиенического состояния была вполне предсказуемой и закономерной в обеих исследуемых группах, и уровень гигиены оставался достаточно стабильным на протяжении всего срока наблюдения (9 мес.) (см. табл. 1,2).
В целях отработки оптимальной дозировки аутоклеток для последующего введения в мягкие ткани краевого пародонта в сравнительном аспекте изучали особенности введения раствора при концентрации клеток: 2x106, 4x10б, 5x106, 8x106 и 10x106 (из расчета на 1 мл физиологического раствора для инъекций).
При попытке забора клеточной суспензии из стерильной пробирки с клеточным материалом в дозе 8x10 и 10x10 аутофибробластов в 1 мл физиологического раствора возникала трудность аспирации содержимого таких пробирок в шприц в связи с негомогенностью раствора и формирования клеточных конгломератов. В связи с этим было принято решение об исключении данных дозировок из эксперимента.
В последующем в каждый исследуемый участок вводили 0,3 - 0,4 мл клеточной суспензии, что соответствовало дозировке от 2x10б до 5x106 аутофибробластов.
В связи с уменьшением общего количества клеточных культур в растворе облегчалась его аспирация в шприц и введение в десну без чрезмерного давления на поршень. При этом максимальная суммарная доза, которая могла быть использована для инъекции в один участок, составила 5x106 клеток.
На протяжении 3-х месяцев после одной инъекции аутофибробластов исследовано 3 пациента с идентичным исходным состоянием пародонта и фенотипом десны с целью изучения влияния вышеуказанных дозировок клеточных культур на состояние мягкотканного субстрата. При этом у каждого из них исследовано по 6 различных участков десны.
На основании планиметрического и ОКТ - исследования выявлено, что на протяжении 1-го месяца после инъекции клеток видимых изменений в указанных участках десны во всех трех исследуемых группах не выявлено. Через 2 мес. изменения объема составили в среднем 0,2 мм во всех группах с несущественной разницей между показателями. Через 3 месяца прирост тканей также не выявил существенной разницы между тремя из вышеперечисленных концентраций и составил 1,5 мм.
Используемые методы исследования и полученные на их основании данные не позволили выявить разницы в эффекте при введении вышеуказанных концентраций клеток. Клинический эффект оказался идентичным при использовании любой из трех доз аутофибробластов: 2x106, 4x106 и 5x106. В дальнейшем исследовании дифференцировке концентрации аутофибробластов не придавали значения.
Динамика плотностных характеристик и микроструктуры десны
При оценке плотностных характеристик и микроструктуры десны с помощью оптического когерентного томографа после введения аутофибробластов в собственно слизистую оболочку десны было отмечено нарастающее со временем появление контрастности изображения, выраженной слоистости (на рис. 9Б,В,Г - наличие трех контрастных горизонтально ориентированных слоев), увеличение толщины эпителиального слоя и собственной пластинки десны, появление более упорядоченного расположения соединительнотканных волокнистых структур.
Подобная картина отмечалась в обеих группах наблюдения.
Статистический анализ результатов измерения толщины десны методом оптической когерентной томографии показал следующее: если исходное значение толщины десны в обеих группах наблюдения составило в среднем 429,4 ± 0,01 мкм, то после однократного введения аутофибробластов через 2 недели этот показатель увеличился по отношению к исходному и составил 494,3 ± 0,03 мкм (табл. 6). Через 2 месяца после 1-й инъекции клеточных культур толщина мягких тканей равнялась в среднем 526 ± 0,03 мкм. В последующие сроки наблюдения (с 5-го по 9-й мес.) отмечалось постепенное увеличение толщины десны, и через 9 мес. после однократного введения аутофибробластов толщина мягких тканей в обеих исследуемых группах составляла 653,2 ± 0,03 мкм, что на 223,8 ± 0,02 мкм больше исходного значения.
При повторной инъекции аутофибробластов с промежутком между инъекциями в 9 месяцев увеличение толщины десны через 2 недели после инъекции составило 655,2 ± 0,02 мкм. Через 2 месяца после двухкратного введения клеток отмечалось увеличение толщины десны в среднем до 663,8 ± 0,02 мкм, а через 5 мес. этот показатель достигал максимального значения (676,2 ± 0,02 мкм) и в последующие сроки наблюдения не изменялся.
Через 2 мес. после 3-й инъекции клеточных культур с промежутком между инъекциями в 9 месяцев зафиксировано увеличение толщины десны на 255,3 ± 0,01 мкм (с 429,4 ± 0,01 мкм до 684,7 ± 0,02 мкм). С 5-го по 9-й месяцы наблюдения этот показатель не менялся и в среднем составил 684, 6 ± 0,02 мкм.
Изучение эффективности трехкратной инъекции аутофибробластов с интервалом в 1 неделю между инъекциями с использованием данного метода исследования нами не проводилось. Глава 5. Результаты функциональных исследований
Известно, что функциональное состояние сосудов пародонта и состояние гемомикроциркуляции в тканях десны при заболеваниях пародонта изменяется в зависимости от степени тяжести заболевания [50]. В связи с этим рецессии десны, возникшие после лечения хронического пародонтита и отнесенные нами к первой группе, были дополнительно разделены на 2 подгруппы в зависимости от степени тяжести заболевания: легкой и средне-тяжелой.
При этом 59 участков от общего количества составили рецессии десны, возникшие после лечения хронического пародонтита легкой степени, 43 участка - рецессии десны у лиц с патологией пародонта средне-тяжелой степеней.
Результаты реопародонтографических исследований.
Визуальные и цифровые данные реопародонтографии у лиц с патологией пародонта легкой степени перед введением аутофибробластов указывали на повышенный тонус сосудов: наличие пологой анакроты, уплощенной вершины и сглаженной дикротической волны, расположенной близко к вершине. При этом до инъекции клеточных культур индекс периферического сопротивления (ИПС), в норме составляющий 80 - 90 %, в данной исследуемой группе равнялся в среднем 131,2 ± 2,02 %.
Определение эффективности однократной инъекции аутофибробластов в различные сроки наблюдения при пародонтите легкой степени. Через 1 месяц после однократной инъекции аутофибробластов у этих пациентов отмечалось снижение ИПС до 97,5 ± 2,38 %. В последующие сроки наблюдения (3-9 мес.) значение ИПС постепенно возвращалось к исходному (табл. 7).
Индекс эластичности (ИЭ), который в норме составляет 70 - 80 %, колебался обратно пропорционально значениям ИПС в различные сроки наблюдения. При этом исходное значение ИЭ у этих пациентов составило в среднем 75,6 ± 2,16 %. Через 1 месяц после однократной инъекции клеточных культур эластичность сосудистых стенок увеличилась (88,2 ± 2,86 %), а в последующие сроки наблюдения (3-9 мес.) отмечалось снижение эластичности сосудов, причем значения ИЭ в этот период колебались в пределах нормы.
Географический индекс (РИ), который является показателем интенсивности кровенаполнения тканей пародонта, до инъекции клеточных культур у лиц с патологией пародонта легкой степени тяжести составлял в среднем 0,028 ± 0,03 Ом. Максимальное увеличение этого показателя отмечалось на 3-м месяце после однократного введения аутофибробластов (0,06 ± 0,03 Ом), а на 9-м месяце после инъекции клеток среднее значение РИ возвращалось к исходному.
