Введение к работе
Актуальность проблемы. Альфа-фетопротеин (АФП) - один из основных белков эмбриональной сыворотки млекопитающих, который в крови взрослых присутствует в небольших количествах. Альфа-фетопротеин регулирует интенсивность пролиферации клеток печени в эмбриогенезе, при их физиологической и репаративной регенерации, злокачественном перерождении [Абелев Г.И., 1994; Шевцова А.И., 1995; Sarcione E.J., Hart D.,1985; Nunez E.A., 1994].
Зависимость пролиферирующих клеток печени от альфа-фетопротена доказана результатами опытов in vivo и in vitro. В эксперименте регенерация гепатоцитов после гибели части из них под действием четыреххлористого углерода или резекции печени, подавляется введением антител к альфа-фетопротеину. При гепатоцеллюлярном раке аналогичное воздействие приводит к регрессии опухоли [Deutsch Н. F., 1991; Laderoute М.Р., Pilarski L.M., 1994]. Введение альфа-фетопротеина в культуральную среду индуцирует размножение клеток печени, напротив, его удаление или замена на альбумин ингибирует пролиферативный процесс [Uriel J., 1989, Hoffmann В. et al., 1989, Yamamoto Т. et al., 1992].
Б клинической практике отмечено, что официнальные препараты альбумина из ретроплацентарной сыворотки обладают значительно более высокой стимулирующей активностью процесса регенерации клеток печени, чем препараты альбумина полученного из донорской крови [Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1983]. Показано, что подобная терапевтическая активность препаратов альбумина из ретроплацентарной сыворотки находится в сильной зависимости от количества в них альфа-фетопротеина [Мирошников В.М. и др., 1987; Коханов А.В. и др., 1984, 1988].
Изученные функции альфа-фетопротеина в период эмбриогенеза и при канцерогенезе, в полной мере не позволяют объяснить механизм его стимулирующего действия на размножение гепатоцитов. Предположение о влиянии альфа-фетопротеина в период эмбриогенеза на пролиферацию гепатоцитов через связывание эстрогенов матери, транспорт ненасыщенных жирных кислот (НЭЖК) и других соединений [Geuskens М. et al., 1989; Uriel J., 1989; Torres J.M. et al., 1991] не согласуется с целым рядом экспериментальных фактов. В частности, низкое
сродство альфа-фетопротеина человека и приматов к эстрогенам [Абелев Г.П., 1994; Christiansen М. et al., 1993] и обнаружение АФП у филогенетически более древних по сравнению с млекопитающими животных, развивающихся без гормонального контакта с матерью [Коханов А.В. и др., 1988], свидетельствует о том, что в регуляции размножения клеток печени связывание эстрогенов альфа-фетопротеином не играет существенной роли. При культивировании гепатоцитов замена альфа-фетопротеина на близкородственный в структурном и, значительной степени, функциональном отношении белок - альбумин не сказывается на внутриклеточном содержании НЭЖК, но ингибирует пролифератив-ный процесс [Deutsch Н. F., 1991].
Приведенные факты дают основание предполагать, что роль альфа-фетопротеина в пролиферации клеток печени как in vivo, так и in vitro не сводится к транспортной активности белка, а имеет иную природу. Новые подходы к исследованию функциональной активности белков, складывающиеся в молекулярной физиологии, позволяют в ином ключе проанализировать факты относительно зависимости пролифера-тивных реакций от альфа-фетопротеина.
Результаты изучения обмена веществ в пролиферирующих клетках свидетельствуют о наличии значительного количества отличий их метаболизма по сравнению с метаболизмом дифференцированных клеток. Однако широкий спектр особенностей обмена веществ при пролиферации клеток имеет важную закономерность, связанную с определяющей ролью в его формировании уровня интенсивности гликолитиче-ского процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода ІШапот С. В., 1975; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Вольский Н.Н. и др., 1988; Вартанян Л.С. и др., 1992; Марри Р. и др., 1993]. Развитие проли-феративного процесса in vivo требует также нейтрализации функций ряда клеток иммунной системы [Бабаева А.Б., 1985; Ширшев СВ., 1993 ].
Регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении
гликолиза и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в пролиферирующих клетках частично изучена. В частности обнаружено, что увеличение активности анодных изоферментов лактатдегидрогена-зы при гепатоцелюлярном раке корреллирует с уровнем альфа-фетопротеина [Kalpaxis D.L., Giannoulaki Е.Е., 1989]. Показано, что действие альфа-фетопротеина на тропные клетки приводит к увеличению продукции АТФ в реакциях гликолиза и ингибирует активность цикло-
оксигеназы, одного из ферментов внемитохондриальных реакций утилизации кислорода [Карелин А.А. и др., 1997; Aussel С, Fehlman М., 1987]. Однако практически не исследованы эффекты альфа-фетопротеина относительно более мощных внемитохондриальных систем утилизации кислорода - цитохрома Р-450 и ксантиноксидазы (КСО). Не вполне понятны особенности механизмов регенерации NAD для гликолиза при увеличении в них продукции АТФ под действием альфа-фетопротеина. Пролиферирующие клетки, в их числе и гепатоциты, характеризуются низкой функциональной активностью митохондрий, где при сбалансированном метаболизме идет в основном окисление NADH, но они с высокой скоростью поглощают из внеклеточной среды молочную кислоту и затрачивают NAD для ее превращения в пируват [Островский Ю.М. и др., 1984; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988]. В этой связи нельзя исключить, что окисление NADH осуществляется во внемитохондриальных реакциях утилизации кислорода, однако механизм и структура этого процесса не вполне ясны.
С депрессивным действием альфа-фетопртеина на функции Т-хелперов, реагирующих с конканавалином А, связывают формирование благоприятного иммунного фона для пролиферации клеток печени при канцерогенезе [Коханов А.В. и др., 1988; Kucharz Е. L, 1990], но нет ясности относительно комплекса биохимических реакций, реализующих регуляторное действие альфа-фетопротеина на иммунокомпетентные клетки определенного типа.
Исследование регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса и внемитохондриальных процессов утилизации кислорода в гепатоцитах, затруднено рядом обстоятельств, среди которых следует отметить гетерогенность его молекулярных форм: тестируется от 7 до 14 изоформ АФП [Абелев Г.И., 1994; Breborowicz J., 1988; Ishiguro Т., Yashida Y., 1991; Seregni E. et al., 1995]; лабильность физиологически активных форм белка при их получении в очищенном виде [Abramski О. et al., 1982]; трудоемкость работы по очистке белка; несовершенство методов определения физиологической активности изоформ АФП. Комплексом этих же причин обусловлена сложность изучения биохимических механизмов иммуномодули-рующей активности альфа-фетопротеина.
Знание механизмов регуляторного действия альфа-
фетопротеина на интенсивность пролиферативного процесса гепато-2 3.2*6
цитов может дать ключ для целенаправленной разработки принципиально новых фармакологических препаратов, стимулирующих регенеративный процесс или, напротив, средств для профилактики и лечения раковых заболеваний.
Цепь исследования. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолити-ческого процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в гепатоцитах, механизмов иммуномодулирующего действия белка на тимоциты.
Задачи исследования:
-
Разработать метод выделения физиологически активных изоформ альфа-фетопротеина из различного биоматериала.
-
Выявить уровни физиологической активности у различных изоформ альфа-фетопротеина.
-
Исследовать интенсивность гликолитического процесса, особенности распределения изоферментов лактатдегидрогеназы в клетках печени in vivo при действии на них изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью.
-
Изучить характер изменения содержания и активности ведущих внемитохондриальных систем утилизации кислорода - цитохрома Р-450 и ксантиноксидазы в клетках печени in vivo при действии изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью.
-
Определить закономерности ошслениния NADH во внемитохондриальных реакциях утилизации кислорода.
-
Выяснить в эксперименте динамику изменения уровня маркеров апоптоза в тимоцитах, тройных к действию с альфа-фетопртеина и выявить возможные биохимические механизмы ее определяющие.
-
Оценить терапевтическое действие альфа-фетопротеина на характер развития восстановительных процессов при аллиловом гепатите.
Научная новизна. Впервые выполнен комплекс экспериментальных исследований, позволивший получить изоформы альфа-фетопротеина, обладающие выраженной физиологической активностью и выявить их регуляторное действие в отношении гликолитического про-
цесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в гепато-цитах. Установлено, что изоформы альфа-фетопротеина, обладающие выраженной физиологической активностью имеют изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4, насыщены неэстерифицированными жирными кислотами, с длиной углеродной цепи от С18 до С22 и отличаются количеством гидрофобных участков. Выявлено, что действие на клетки печени изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью, приводит к увеличению содержания в них изофермента лактатдешдрогеназы - ЛДГз до уровня, характерного для гепатоцитов в эмбриональный период развития. Показано, что действие альфа-фетопротеина на клетки печени увеличивает интенсивность цианидрезистентного дыхания, обусловленного преимущественно активностью кислородзависимой формы ксантиноксидазы (О-форма КСО), катализирущей окисление NADH до NAD. Установлено, что катализируемое ксантиноксидазои и сопутствующая окислению пуринового субстрата регенерация NAD дозазависимо активируется восстановленной формой пиридиннуклеотида в диапазоне концентраций 0.01 - 0.15 ммоль/л, ионами железа (Fe3+) при концентрациях от 0.1 до 10 мкмоль/л. Стимуляция окисления NADH ингибируется супероксиддисмутазой и не зависит от активности каталазы. Предложена схема реакций цепного окисления NADH до NAD с участием пуринового субстрата, лроокси-дантной формы ксантиноксидазы, ионов железа и супероксидного анион радикала. Расчитано, что цепная реакция утилизации молекулы кислорода обеспечивает окисление двух молекул NADH. Доказано, что про-оксидантная активность ксантиноксидазы обеспечивает образование NAD из NADH для реакций гликолиза. Обоснована физиологическая значимость механизма прооксидантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза в пролиферирующих и дифференцированных клетках печени. Показано, что действие на тимоциты, реагирующие с конканава-лином А, изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью, приводит к увеличению количества одно- и двунитевых разрывов ДНК, продуктов межнуклеосомной фрагментации хроматина, свидетельствующих о более высокой интенсивности в этой группе клеток реакций развития апоптоза. Выявлено, что при аллиловом гепатите альфа-фетопротеин оказывает стимулирующее действие на клетки печени, сокращая сроки развития реакций цитолиза и нормализации обмена веществ в гепатоцитах . г *
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые получены данные о молекулярных механизмах регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса и внеми-тохондриальных реакций утилизации кислорода. Показано, что изофор-мы альфа-фетопротеина, насыщенные неэстерифицированными жирными кислотами с длиной углеродной цепи от С18 до С22 и имеющие изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4, обладают регуляторной активностью в отношении реакций гликолиза и цианидрезистент-ного дыхания. Установлено, что формируемые в гепатоцитах особенности активностей реакций гликолиза и внемитохондриального дыхания при действии на них альфа-фетопротеина направлены на увеличение синтеза гликолитической АТФ, стабилизацию уровня пирувата и элиминацию лактата. Предложен механизм прооксидантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза, отражающий взаимосвязь внеми-тохондриальных реакций утилизации кислорода и синтеза АТФ. Отмечено, что регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении реагирующих с ним клеток тимуса, может быть связана с ускоренной их элиминацией по механизму апоптоза. Выявлена активность альфа-фетопротеина как биостимулятора при аллиловом гепатите.
Для практического здравоохранения предложен:
-
способ фракционирования белков из биоматериала, загрязненного гемоглобином, гемопигментами, микробными и тканевыми белками;
-
чувствительный метод оценки лимфоцитолитического действия веществ.
Представленные рекомендации следует использовать при получении высокоочищенных белковых препаратов крови, а также в исследованиях, касающихся оценки лимфоцитолитического действия фармакологических средств.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Регуляторной активностью в отношении реакций гликолиза и внемитохондриального дыхания в гепатоцитах обладают изоформы альфа-фетопротеина, насыщенные неэстерифицированными жирными кислотами с длиной углеродной цепи от C1S до С22 и имеющие изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4.
-
Регуляторное влияние альфа-фетопротеина на ключевой биоэнергетический процесс в период пролиферации гепатоцитов - гликолиз, выражается в увеличении активности изофермента лактатдегидроге-назы - ЛДГз, возрастании уровня пирувата и снижении содержания пактата.
-
Регуляторное действие альфа-фетопротеина на ведущие реакции внемитохондриального дыхания в гепатоцитах, связанные с активностями цитохрома Р-4Ь0 и ксантиноксидазы, приводит к перераспределению активности между ними в пользу О-формы КСО и инициацией с ее участием цепного механизма регенерации NAD для гликолиза.
-
Действие альфа-фетопротеина на клетки тимуса, реагирующие с конканавалином А, обусловливает увеличение в них интенсивности реакций образования высокомолекулярных фрагментов хроматина.
Реализация и апробация работы. Результаты исследования реализованы в "Программах лабораторной диагностики" (М., 1990), учебно-методическом пособии "Онкомаркеры, их использование в диагностической практике" (публикация в IV квартале 1997), лекции "Биохимия печени" (публикация в IV квартале 1997), практикуме для факультета подготовки врачей ВМедА (публикация в III квартале 1997), учебно-методическом пособии для врачей лаборантов (принято к публикации в I квартале 1998), учебнике по клинической биохимии для медицинских вузов (публикация в 1998).
Теоретические и практические результаты исследований используются в учебном процессе на кафедрах токсикологии и медицинской защиты, акушерства и гинекологии, клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии.
Основные положения работы обобщены и доложены на III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989), десятом объединенном симпозиуме биохимических обществ (Ташкент, 1939), I Российском биохимическом съезде (Ленинград, 1992 г.), V и VII конференциях по актуальным вопросам клиники, диагностики и лечения (Санкт-Петербург, 1995, 1997), III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), объединенном симпозиуме лабораторных обществ (Санкт-Петербург, 1996), II Российском биохимическом съезде (Москва, 1997 г.), XXXIII международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997).
Структура и ооьсм диссертации. Диссертация изложена ил2і0 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методик исследования, пяти глав с описанием полученных результатов и их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 95 отечественных источников и 172 зарубежных. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 33 рисунками.
