Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина в регуляции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета (обзор литературы)
1.1. Роль лептина в регуляции клеток врожденного и адаптивного иммунитета 14
1.1.1. Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности моноцитов 21
1.1.2. Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности лимфоцитов 32
1.2. Регуляция грелином функциональной активности основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета 40
1.3. Роль лептина и грелина в контроле репродуктивных процессов 51
1.4. Механизмы формирования иммунной толерантности при физиологически протекающей беременности 55
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Дизайн исследования 61
2.2. Объекты исследования 64
2.3. Биологически активные вещества 65
2.4. Оценка фагоцитарной активности моноцитов 66
2.5. Оценка окислительной активности моноцитов в реакции люминолзависимойхемилюминесценции
2.6. Определение продукции NO моноцитами 69
2.7. Изучение активности секреторной миелопероксидазы моноцитов 69
2.8. Изучение активности эластазы моноцитов 70
2.9. Определение активности катепсина G моноцитов 71
2.10. Определение активности индоламин-2,3-диоксидазы моноцитов
2.11. Оценка фенотипа лимфоцитов и тимоцитов 72
2.12. Индукция формирования адаптивных Thl7/Treg из наивных С04+Т-лимфоцитов периферической крови
2.13. Влияние гормонов на формирования естественных Treg, ТЫ7, инвариантных NKT-клеток тимуса
2.14. Модуляция гормонами функциональной активности 78
естественных Treg
2.15. Оценка апоптоза лимфоцитов и тимоцитов 78
2.16. Оценка пролиферации лимфоцитов и тимоцитов 79
2.17. Определение уровня цитокинов в супернатантах клеточных 80
культур
2.18. Оценка внутриклеточной продукции цитокинов лимфоцитами и тимоцитами
2.19. Статистический анализ 81
Глава 3. Молекулярные и клеточные механизмы иммуномодулирующей активности лептина и грелина в регуляции функций клеток врожденного иммунитета 82
3.1. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности моноцитов периферической крови 82
3.1.1. Механизмы иммуномодулирующей активности лептина в отношении моноцитов 83
3.1.2. Регуляция грелином функциональной активности моноцитов. Роль Са2+-зависимых механизмов. 93
3.1.3. Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции интегральных функций моноцитов 103
3.2. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипа NK- и NKT-клеток периферической крови 114
Глава 4. Роль лептина и грелина в регуляции функций основных клеток адаптивного иммунитета 133
4.1. Роль гормонов в контроле активации зрелых Т-лимфоцитов периферической крови 133
4.2. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности Т-регуляторных клеток (Treg) 143
4.3. Роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+T-лимфоцитов периферической крови в адаптивные ТЫ 7 162
4.4. Молекулярные механизмы регуляции лептином и/или грелином дифференцировки С04+-Т-лимфоцитов в адаптивные субпопуляции Thl7/Treg 168
Глава 5. Роль лептина и грелина в регуляции тимического этапа формирования клеток адаптивного иммунитета 179
5.1. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипического
созревания, пролиферации, апоптоза тимоцитов и продукции ключевых цитокинов 181
5.2. Роль лептина и/или грелина в регуляции тимического этапа формирования естественных ТЫ 7 и Treg и контроле их функциональной активности 189
5.3. Роль лептина и/или грелина в регуляции тимического этапа формирования инвариантных NKT-клеток тимуса 202
Заключение 207
Выводы 218
Список сокращений и условных обозначений 221
Список литературы 2
- Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности лимфоцитов
- Оценка окислительной активности моноцитов в реакции люминолзависимойхемилюминесценции
- Механизмы иммуномодулирующей активности лептина в отношении моноцитов
- Роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+T-лимфоцитов периферической крови в адаптивные ТЫ
Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности лимфоцитов
Лептин является пептидным гормоном с мол. массой 16 кДа, который синтезируется, главным образом, адипоцитами и циркулирует в крови как в свободной, так и в связанной форме [126]. Основная биологическая роль лептина связана с регуляцией энергетического баланса организма, потребления пищи и ограничением избыточного накопления жировой массы. Содержание лептина в плазме крови прямо коррелирует с количеством жировой ткани, а также варьирует в зависимости от особенностей обменных процессов, изменения концентрации некоторых гормонов и цитокинов [59, 80, 122, 126].
По результатам многочисленных исследований установлено, что содержание лептина в крови у лиц женского пола достоверно выше, чем у мужчин, независимо от возраста, степени ожирения и типа жироотложения [95, 159]. В целом, концентрация лептина у женщин приблизительно на 40% выше, чем у мужчин [257]. Опубликованные нормативные показатели содержания лептина в периферической крови, согласно различным методикам его определения, составляют: у женщин 1,1-27,6 нг/мл, у мужчин - 0,5-13,8 нг/мл. Эти половые различия, вероятно, связаны со стимулирующим эффектом эстрогенов и прогестерона и подавляющим действием андрогенов [88, 159, 257].
Продукция лептина увеличивается при воспалительных и инфекционных заболеваниях (4,2-132 нг/мл), которые сопровождаются анорексией и потерей веса [122, 272]. При ожирении наблюдается значительное повышение концентрации лептина - 16,4-166,1 нг/мл [95]. Среднее содержание лептина в периферической крови в I триместре беременности составляет 10±1,2 нг/мл, а во П-Ш триместрах - 35±2,5 нг/мл [152]. Данные, приведенные в таблице 1, показывают среднее содержание лептина в периферической крови при различных физиологических состояниях.
Основные исследования по изучению физиологической роли лептина были проведены на моделях ожирения у мышей гомозиготных линий оЪ/оЪ (дефект выработки лептина) и db/db (мутация рецептора к лептину) [59, 80, 122, 126, 335]. У данных животных помимо гиперфагии и ожирения были выявлены гормональный дисбаланс, угнетение репродуктивной функции, гемопоэза и клеточно-опосредованного иммунного ответа [59, 68, 80, 122, 126, 335]. Подобные нарушения были обнаружены и у людей, гомозиготных носителей мутации оЪ гена, причем, экзогенное введение рекомбинантного лептина полностью предотвращало развитие вышеперечисленных дисфункций [59, 80, 122, 126, 335].
Установлено, что лептин регулирует активность клеток при взаимодействии со специфическими мембранными рецепторами (Ob-R) [50, 66, 71, 129, 135, 254, 272]. На системном уровне основным механизмом регуляции лептином энергетического баланса организма является угнетение продукции нейропептида Y и активация синтеза меланоцитстимулирующего гормона при взаимодействии с Ob-R гипоталамуса, что приводит к снижению аппетита, повышению тонуса симпатической нервной системы и, как следствие, усилению основного обмена в периферических органах и тканях [20, 50, 51, 121, 122, 126]. Помимо этого, на уровне гипоталамуса лептин стимулирует выработку тиреотропного гормона, гонадотропинов, что усиливает секрецию тиреоидных и половых стероидных гормонов, принимающих активное участие в регуляции метаболитических процессов [19, 50, 59, 126]. В то же время повышенный уровень инсулина, половых стероидных и глюкокортикоидных гормонов угнетает секрецию лептина адипоцитами, замыкая отрицательную обратную связь [50, 59, 126].
Участие лептина в регуляции иммунных реакций определяется его непосредственным влиянием на клетки иммунной системы, экспрессирующих Ob-R. Так, помимо центральной нервной системы, клеток легких, печени, почек, поджелудочной железы и гонад [122, 126, 177], трофобласта и фетальных тканей [50, 177], Ob-R экспрессируются моноцитами/макрофагами [206, 330], Т- и В-лимфоцитами [133, 269], нейтрофилами [226, 330, 331] и натуральными киллерами (NK) [335]. Такое широкое представительство Ob-R на лимфомиелоидных клетках объясняется его структурным сходством с представителями семейства цитокиновых рецепторов I класса [129, 141]. Благодаря этому, лептин регулирует формирование не только иммунного ответа и процессы воспаления, но и гемопоэз [134, 214, 294]. Анализ литературы убедительно показывает, что лептин является провоспалительным гормоном, который способствует преобладанию клеточно-опосредованных иммунных реакций, вследствие усиления продукции цитокинов Т-хелпер - 1 (ТЫ) типа [214, 267]. Дальнейшая систематизация знаний о молекулярных основах иммуномодулирующего действия лептина необходима для понимания механизмов регуляции иммунных реакций при различных физиологических и патологических состояниях.
Ob-R имеют структурное и функциональное сходство с I классом цитокиновых рецепторов, которые включают общий сигнальный белок - gpl30 [66, 214]. К этому семейству также относятся рецепторы к интерлейкинам (IL)-2, IL-6, IL-11, IL-12, онкостатину M, гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (G-CSF), гормону роста, пролактину и др. [66, 214]. Ob-R формируют гомодимеры, каждый из которых связывает одну молекулу лептина, в результате чего формируется тетрамерный комплекс, состоящий из 2-х Ob-R и 2-х молекул лептина [66, 214].
Выявлено несколько изоформ Ob-R, образующихся в результате альтернативного сплайсинга и отличающихся по структуре внутриклеточного сигнального домена [66, 214]. Внеклеточный домен Ob-R состоит из 816 аминокислотных остатков и имеет два цитокин-подобных связывающих мотива [285]. По строению внутриклеточного домена выделяют короткую (включает 32-97 аминокислотных остатка), длинную (включает 302 аминокислотных остатка), а также растворимую форму Ob-R [141, 285]. Взаимодействие лептина с короткой формой Ob-R не приводит к активации транскрипционных факторов [71, 141, 285]. Полагают, что короткая форма ОЬ-R осуществляет перенос гормона через гематоэнцефалический барьер, тогда как растворимая форма Ob-R транспортирует лептин в сыворотке крови [141, 285].
Оценка окислительной активности моноцитов в реакции люминолзависимойхемилюминесценции
Активность IDO определяли в супернатантах культур МНЛ спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного продукта при деградации триптофана [75]. МНЛ активировали добавлением IFN-y (10 нг/мл, «Вектор Бест», Россия) [167] или ЛПС - 100 нг/мл, («Sigma», США) [169], и инкубировали в растворе Хенкса, в присутствии триптофана 100 мкМ («Sigma», США) в течение 4 ч. Далее отбирали 100 мкл клеточного супернатанта и смешивали с 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. Затем в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта и добавляли равный объём реактива Эрлиха (100 мг п 72 диметилбензальдегида, 5 мл уксусной кислоты ледяной) и оценивали оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре Biohit ВР 800 («Bioek Instrumens, Inc.», США) при длине волны 492 нм. Содержание кинуренина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по пробам с известным содержанием кинуренина («Sigma», США). Принимая во внимание, что IDO синтезируется только в антигенпрезентирующих клетках, полученные результаты отражают синтез и секрецию IDO моноцитами.
Определение фенотипа разных субпопуляций лимфоцитов и тимоцитов проводили методом иммунофлюоресценции на проточном лазерном цитофлюориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", США) с использованием соответствующих моноклональных антител (МКА). Окрашивание производили согласно инструкции производителя МКА. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции окна использовали соответствующие изотипические контроли. Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. При учете результатов подсчитывали от 10000 до 100000 клеток.
Для оценки влияния гормонов на экспрессию мембранных молекул Т-лимфоцитами суспензию МНЛ инкубировали с гормонами 24ч и далее определяли следующие субпопуляции Т-клеток: Th-лимфоциты - CD3+CD4+ (CD3-FITC/CD4-PE, Caltag, Франция) (Т-хелперы), цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) CD3+CD8+ (CD3-FITC/CD8-PE, Caltag, Франция). При изучении экспрессии CD25 на Th-клетках оценивали количество активированных Th-лимфоцитов - CD3+CD4+CD25dun (FITC Anti-Human CD4, RPA4, «eBioscience», США; РЕ anti-human CD25, ВС96, Biolegend, США) и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+CD25+ (Anti-human CD8-FITC, «Beckman Coulter, США; РЕ anti-human CD25, ВС96, Biolegend, США»). Экспрессию мембранного рецептора CD95 исследовали на Th-клетках CD3+CD4+CD95+ (Anti-human CD4-PE, «eBioscience», США; FITC anti-human CD95, BC96, «eBioscience», США) и ЦТЛ: CD3+CD8+CD95+ (Anti-human CD8-PE, «eBioscience», США; FITC anti-human CD95, BC96, «eBioscience», США).
Влияние лептина и грелина на количество Treg оценивали после суточной инкубации МНЛ с гормонами. Количество Treg оценивали по коэкспрессии CD25 и транскрипционного фактора FOXP3 [158], как процент CD4+CD25bnghtFOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3- Alexa Fluor 488, 206D) в гейте CD4+CD25bnght лимфоцитов (РЕ/Су5 anti-human CD4, ОКТ4; РЕ anti-human CD25, ВС96, «Biolegend», США).
Также после суточной инкубации с гормонами определяли уровень NK-клеток с фенотипом CD3"CD16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE, «Caltag», Франция).
Для исследования участия лептина и грелина е изменении фенотипа NK-лимфоцитое с цитотоксического на регуляторний, а также в экспрессии хемокиновых молекул, МНЛ инкубировали с гормонами 72 ч в ГШС и далее исследовали экспрессию поверхностных маркеров. Поскольку маркеры NK-клеток экспрессируются также на других типах лейкоцитов, наиболее важной для идентификации данных клеток молекулой является NKp46 (Anti-human CD335-PC5, «Beckman Coulter», США), конститутивно экспрессирующаяся только на NK-клетках [298]. Определяли маркеры активации NK-клеток - по экспрессии активационной молекулы NKG2D (Anti-human CD314-FITC, «eBioscience», США) и ингибиторных - LILRB1 (Anti-human CD85J-PE, «Beckman Coulter», США) и NKG2A (Anti-human CD159-PE, «Beckman Coulter», США). Для оценки хоминга NK-клеток оценивали экспрессию CCR7 (Anti-human CD197-FITC, «eBioscience», США) и L-селектина (Anti-human CD62L-FITC, «Beckman Coulter», США). Также производили оценку степени экспрессии маркера CD56 (Anti-human CD56-PE, «Beckman Coulter», США) на NKp46+ клетках. Влияние гормонов на фенотипическое созревание тимоцитов, оценивали по изменению коэкспрессии молекул CD4/CD8, и переходу незрелых CD4+CD8+ - тимоцитов в более зрелые CD4+CD8" /CD4"CD8+- клетки. Для этого в гейте тимоцитов подсчитывали число CD4+CD8+; CD4+CD8"; CD4" CD8+; CD4"CD8"-KJICTOK (РЕ Anti-Human CD4, OKT4; PC5 Anti-Human CD8, «eBioscience», США) методом проточной цитометрии. Поскольку известно, что основным тимопоэтическим фактором, поддерживающим рост и развитие тимоцитов, является IL-7 [43], исследовали влияние гормонов на экспрессию рецептора к IL-7 (CD127) на поверхности тимоцитов. Оценивали количество CD4+CD127+THMOUHTOB (FITC Anti-Human CD4, ОКТ4; РЕ Anti-Human CD127, eBioRDR5, «eBioscience», США).
Влияние гормонов на индукцию формирования адаптивных (индуцибельных) Thl7/Treg оценивали в культурах CD4+-лимфоцитов периферической крови. Для индукции формирования ТЫ 7 из CD4+T-лимфоцитов в культуры вносили IL-ip (10 нг/мл, «eBioscience», США) и IL-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США), поскольку по данным литературы именно эти цитокины стимулируют экспрессию орфанового ядерного рецептора ROR-gamma (RORyt) и дальнейшую продукцию IL-17A [47]. А для инициации формирования Treg в культуры добавляли трансформирующий фактор роста опухоли - pi (TGF-pl) (5 нг/мл, «GIBCO») [298]. С04+-лимфоциты инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (105кл/мл - 5 106/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% ЭТС, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10"5М2 -меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 72 ч при 37С в условиях 5% СОг с гормонами. Помимо этого во все культуры добавляли магнитные частицы с нанесенными aHTH-CD3/CD28 МКА (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen», Norway), имитирующими активацию лимфоцитов при контакте с антиген-презентирующими клетками, а также нейтрализующие анти-IFNy и анти-1Ъ-4 МКА (10 мкг/мл, «eBioscience»).
После 72 ч инкубации с гормонами снимали супернатант, удаляли магнитные частицы, и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч инкубации с гормонами, составляла 92-98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя МКА.
Поскольку экспрессия транскрипционного фактора FOXP3 является основным маркером Treg [256], их количество оценивали как процент CD4+FOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3-Per-Cy5, PCHlOl; FITC Anti-Human CD4, RPA4) в гейте С04+-лимфоцитов. Для анализа гормональных механизмов регуляции функциональной активности Treg исследовали экспрессию CTLA-4 (CD152) (РЕ anti-human CD152, 14D3, "eBioscience") и GITR - (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) (РЕ anti-human GITR, eBioAITR, "eBioscience"), GARP - (РЕ anti-human GARP, TNFRSF18, "eBioscience") как на Treg, так и на С04+тимоцитах.
Механизмы иммуномодулирующей активности лептина в отношении моноцитов
В период ранней беременности натуральные киллеры (NK-клетки) являются преобладающей популяцией среди лимфоидных клеток, локализованных в децидуальной оболочке [303]. NK-клетки обеспечивают как прямую, так и антителозависимую цитотоксичность (АЗКЦ), и играют важную роль на протяжении всей беременности. Кроме того, NK-клетки потенцируют индукцию Т-регуляторных лимфоцитов, что приводит к формированию иммунной толерантности в период беременности [91, 185, 338]. Циркулирующие зрелые NK-клетки идентифицируют как CD3" CD16+CD56+ [26]. Более 80-90% периферических зрелых NK-клеток имеют фенотип CD16+CD56m и проявляют большую цитотоксичность по сравнению с CD16low/negCD56bnght [96, 97, 185, 223]. Антиген CD 16 является низкоаффинным рецептором к IgG и необходим для реализации АЗКЦ. За цитотоксическую активность NK-клеток, кроме молекул CD 16 отвечают активационные рецепторы NKG2D и NKp46, причем последний конститутивно экспрессируется на всей популяции NK-клеток и служит одним из основных маркером для их идентификации. При беременности литический потенциал NK-клеток снижается за счет уменьшения процента С016+С056сШплимфоцитов. Повышение содержания CD16+56dimNK -клеток в периферической крови у женщин ассоциировано с привычным невынашиванием беременности [18]. Предполагается, что децидуальные NK-клетки созревают из периферических CD16low/negCD56bnght лимфоцитов, мигрирующих в матку [185]. CD16low/negCD56bnghtNK секретируют цитокины и обладают низкой цитолитической активностью [96]. Маточные CD16low/negCD56bnghtNK-KiieTKH принимают непосредственное участие в имплантации, ангиогенезе и поддержании беременности [261]. При нормальной беременности NK-клетки способствуют замещению клеток эндотелия в спиральных артериях клетками трофобласта, что позволяет спиральным артериям обеспечивать все возрастающие потребности в кровотоке. В отличие от NK периферической крови, NK-клетки эндометрия не обладают цитотоксической активностью, особенно по отношению к клеткам трофобласта (эмбриона), однако продуцируют высокие уровни цитокинов IFN-y, IL-10, GM-CSF, TNF. На клетках трофобласта человека отсутствуют так называемые классические молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса - HLA-A и HLA-B, которые являются мишенью для цитотоксического действия NK-клеток периферической крови. В то же время клетки трофобласта экспрессируют HLA-C, HLA-E, HLA-G, которые взаимодействуют с NK-клетками эндометрия и децидуальной ткани, и участвуют в процессах развития беременности. Поэтому представлялось важным исследовать участие лептина и грелина в изменении фенотипа NK-лимфоцитов с цитотоксического на регуляторный, а также в экспрессии хемокиновых молекул, способствующих миграции этих клеток в матку и дренирующие лимфатические узлы.
Поскольку NK-клетки конститутивно экспрессируют CD56, а присутствие CD 16 варьирует в зависимости от зрелости и функциональной активности, исследовали влияние гормонов на общее содержание 56+NK-клеток периферической крови, экспрессирующих CD 16. Гистограммы, отражающие оценку количества CD3"CD16+CD56+-KneTOK (NK-клетки) и CD3+CD16+CD56+-KneTOK (NKT-клеток) в 24 ч культуре МНЛ методом проточной цитометрии на примере одного эксперимента представлены на рисунке 21.
Установлено, что лептин в концентрации, сопоставимой с I триместром, повышает количество С016+56+МС-клеток (таблица 10), что коррелировало с увеличением продукции IFN-oc мононуклеарными фагоцитами под влиянием лептина (по данным корреляционного анализа R = 0.76; р 0.05). Тогда как в концентрации, характерной для П-Ш триместра беременности, лептин, напротив, снижает количество С016+56+МС-клеток. Рассуждая о механизмах реализации разнонаправленных эффектов лептина, можно полагать, что гормон действует как непосредственно, связываясь с Ob-R на NK-клетках [87, 297], так и опосредовано, путем активации продукции IFN-oc мононуклеарными фагоцитами. По данным литературы, лептин при связывании с Ob-R способен усиливать цитотоксичность NK-клеток путем стимуляции фосфатидилхолин-специфичной PLC, что увеличивает трафик CD 16 из цитоплазматических гранул аппарата Гольджи на мембрану NK-клеток [87, 297]. По-видимому, в I триместре беременности, совместное воздействие лептина и IFN-oc на NK-клетки повышает экспрессию CD 16. Тогда как во П-Ш триместрах беременности самостоятельного действия лептина не достаточно для стимуляции экспрессии CD 16, либо оно направлено в большей степени на стимуляцию экспрессии CD56 и повышает количество CD56bnght NK-клеток. Что касается снижения экспрессии CD 16 под влиянием высокой концентрации лептина, следует отметить, что подобная конверсия CD56+CD16+NK в CD56bnghtCD16"NK-mieTKH периферической крови отмечена и другими авторами при культивировании in vitro выделенных из периферической крови CD56+CD16+NK с TGF-pi, либо с клетками децидуальной стромы [172]. Также было показано, что и другие продукты стромальных децидуальных клеток способны индуцировать подобную конверсию, причем механизмы зависят от совокупности действующих факторов [172].
Грелин, в исследуемых концентрациях, не влияет на количество CD16+56+NK-KneTOK. При совместном внесении гормонов, в комбинации, характерной для I-II триместров беременности, гормоны не влияют на процент CD 16+CD56+NK. Тогда как в сочетании, характерном для П-Ш триместра, гормоны повышают содержание СГЛ6+С056+МС-клеток (таблица 10). Хотя прямых литературных данных о наличии рецепторов к грелину на NK- и NKT-клетках нет, выявленные эффекты свидетельствуют об участии гормона в регуляции фенотипа NK-клеток как непосредственно, так и опосредованно, возможно, путем регуляции количества рецепторов к лептину, либо реализации эффектов гормона через другие типы рецепторов, как это показано для других субпопуляций лимфоцитов [110, 111, 153].
Роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+T-лимфоцитов периферической крови в адаптивные ТЫ
Предполагая возможные молекулярные механизмы реализации регуляторних эффектов гормонов на поляризацию С04+Т-лимфоцитов в Treg/Thl7, следует отметить, что взаимодействие лептина со специфическим рецептором (Ob-R) на лимфоцитах, запускает несколько сигнальных путей [248, 249], основной из которых аналогичен таковому для IL-6, и включает Jak2 (янус-киназа) и далее STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) - ключевой индуктор RORyt [238, 248, 249]. Помимо этого, лептин, связываясь с Ob-R, стимулирует ERK1/2 (экстраклеточно-регулируемая протеинкиназа), с последовательным фосфорилированием Akt, и, как следствие, высвобождением NF-KB [200, 300], который инициирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов, в том числе, и RORyt. Следовательно, преобладание дифференцировки CD4+T-лимфоцитов в ТЫ 7 под действием лептина объясняется преимущественной активацией гормоном RORyt. Принципиальная роль PI3K для экспрессии RORyt, по-видимому, заключается в том, что взаимодействие лептина с Ob-R индуцирует РІЗК-зависимую активацию фосфодиэстеразы (PDE) [179], что поддерживает низкий уровень сАМР в клетке, поскольку повышение его уровня угнетает транскрипцию генов провоспалительных факторов [38] и RORyt. Преимущественная активация лептином RORyt в С04+Т-лимфоцитов является причиной угнетения гормоном дифференцировки CD4+T-лимфоцитов в aTreg, так как по данным литературы, и mTOR [249], и STAT3 [191] эффективно подавляют экспрессию FOXP3 в С04+Т-клетках независимо от активности РКА и PI3K. Гипотетическая схема, суммирующая молекулярные механизмы реализации регуляторных эффектов гормонов на поляризацию С04+Т-лимфоцитов представлена на рисунке 46.
При изучении молекулярных механизмов действия грелина показано, что блокада РКА нивелирует регуляторные эффекты гормона на формирование аТЫ7 и aTreg (рисунок 44, 45). При внесении W (ингибитора PI3K) эффекты гормона меняются на противоположные: грелин стимулирует синтез аТЫ7 и угнетает формирование aTreg (рисунок 44, 45).
Следовательно, действие грелина на девиацию С04+Т-лимфоцитов опосредовано и через РКА-; и через PI3K, однако ведущая роль в активации грелином экспрессии FOXP3 и подавлении RORyt принадлежит PI3K. Исследования последних лет показали, что при связывании грелина со своим рецептором (GHS-R) происходит димеризация GHS-R с привлечением других типов G-сопряженных рецепторов с разными типами а-субъединиц G-белка [275]. В зависимости от специфичности а-субъединицы G-белка инициируются такие сигнальные каскады, как фосфолипаза С (PLC)-зависимый путь с активацией протеинкиназы С (РКС) и повышением уровня внутриклеточного Са ; аденилатциклаза (Ас) - РКА - зависимый путь [275]. Помимо этого, при лигировании GHS-R происходит диссоциация G-белка на а- и Ру-субъединицы, каждая из которых имеет собственные объекты действия [186]. Показано, что Ру-субъединицы G-белка способны активировать и PI3K [62], и Ас [186, 275], с последующей стимуляцией РКА.
Стимуляция РКА также осуществляется комплексом Са /кальмодулин, через кальмодулин-зависимую протеинкиназу (СаМКК2) и АМР-активируемую протеинкиназу (АМРК) [90, 220], а также PI3K [62]. Таким образом, РКА играет значимую роль в реализации эффектов грелина, что отмечено в работах и других авторов [143, 180]. Ключевая роль РКА в усилении грелином формирования Treg обусловлена, по-видимому, РКА-зависимой активацией CREB - основного стимулятора для FOXP3. Индукция FOXP3 подавляет экспрессию RORyt, поскольку FOXP3 непосредственно связывается с промотором RORyt, блокируя его активацию [166], что и является возможной причиной угнетения грелином дифференцировки С04+Т-лимфоцитов в ТЫ 7. Помимо этого, АМРК, активируемая через GHS-R - PLC - Са2+ -путь, угнетает mTOR [220], что также способствует превалированию экспрессии FOXP3.
Что касается принципиальной роли PI3K в реализации эффектов грелина, следует отметить, что по данным литературы активация GHS-R вызывает как угнетение PI3K через Gaq-субъединицу [62], так и стимуляцию PI3K через Ру-субъединицы G-белка [275]. Поэтому определение точной роли PI3K в поляризирующих эффектах грелина требует дальнейших исследований. Учитывая, что блокада PI3K меняет направленность действия грелина, можно предположить, что PI3K регулирует экспрессию ключевых транскрипционных факторов, таких как Smad3 (фактор транскрипции TGF-P), NF-AT (ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов), NF-кВ И АР-1 (активирующий протеин-1), поскольку формирование комплексов между ними приводит к преобладанию экспрессии либо FOXP3, либо RORyt [299]. Другим возможным механизмом, объясняющим ключевую роль PI3K в грелин-опосредованной регуляции дифференцировки С04+Т-лимфоцитов, является участие PI3K в контроле локальной продукции и деградации внутриклеточного сАМР, который реципрокно, инициируя/угнетая разные сигнальные пути, активирует либо FOXP3, либо RORyt.
Анализ совместных эффектов гормонов показывает, что ингибирование РКА и PI3K не влияет на сочетанное действие лептина и грелина на индукции аТЫ7 (рисунок 44), а внесение Н-89 отменяет стимулирующий эффект комбинации лептина и грелина на индукцию aTreg (рисунок 45). Можно полагать, что характерное для I-II триместров беременности повышение числа aTreg периферической крови обусловлено преимущественно эффектами грелина, реализуемыми через РКА. При одномоментном связывании лептина и грелина с клеткой, за счет грелин-опосредованного повышения внутриклеточного сАМР, реализуются, главным образом, РКА-зависимый эффект грелина, что приводит усилению формирования aTreg. По-видимому, РКА является ключевым фактором кооперации лептина и грелина при поляризации С04+Т-лимфоцитов, что характерно и для других типов клеток [123, 180]. Гипотетический механизм реализации совместных эффектов лептина и грелина суммирован на рисунке 47. Можно предполагать, что экспрессии FOXP3 в ответ на активацию CD4+-клетки является доминирующей, тогда как для экспрессии RORyt необходимы дополнительные стимулы, например, связывание с провоспалительными цитокинами. Так генетически-обусловленное повышение экспрессии рецепторов к лептину, характерное для некоторых народностей, объясняет увеличение у них частоты аутоиммунных патологий, хронических воспалительных процессов. Это также объясняет высокую частоту прерывания беременности у женщин, страдающих ожирением, когда концентрация лептина в периферической крови резко возрастает [215].
