Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Современные представления о патогенетических механизмах, определяющих развитие и рост эндометриоидного очага
1.2. Значимость факторов, участвующих в регуляции апоптоза и, инвазии клеток эндометрия, в развитии эндометриоидного1 очага *
1.3. Характеристика иммунных. факторов перитонеального микроокружения при эндометриозе
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Организация работы и объем исследования 37
2.2. Иммунологические методы исследования 38
ГЛАВА 3. Характеристика функционального состояния перитонеальных макрофагов и цитокинового профиля перитонеальнои жидкости при наружном. генитальном эндометриозе
3.1. Особенности функционального состояния перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе
3.2. Особенности содержания цитокинов, регулирующих апоптоз и инвазию, в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом
ГЛАВА 4. Особенности апоптоза и инвазии эндометриальных клеток при наружном генитальном эндометриозе
4.1. Особенности апоптоза клеток эутопического и эктопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе 58
4.2. Особенности синтеза факторов, регулирующих инвазивность клеток, в эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе
ГЛАВА 5. Роль факторов перитонеального микроокружения в регуляции апоптоза и инвазии эндометриальных клеток при эндометриозе
5.1. Влияние in vitro перитонеальных макрофагов и цитокинов перитонеальнои жидкости на апоптоз эндометриальных клеток при эндометриозе
5.2. Влияние in vitro перитонеальных макрофагов и цитокинов перитонеальнои жидкости на инвазивность эндометриальных клеток
при эндометриозе 72
Обсуждение полученных результатов 77
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы
- Значимость факторов, участвующих в регуляции апоптоза и, инвазии клеток эндометрия, в развитии эндометриоидного1 очага
- Иммунологические методы исследования
- Особенности содержания цитокинов, регулирующих апоптоз и инвазию, в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом
- Особенности синтеза факторов, регулирующих инвазивность клеток, в эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе
Введение к работе
Актуальность темы. Наружный генитальный эндометриоз, одно из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, характеризуется ростом эндометриальной ткани вне полости матки, преимущественно в перитонеальной полости, и является причиной развития у пациенток болевого синдрома и бесплодия (Vinatier D., e.a, 2000; Nap A.., e.a., 2004; Rodgers P.A., е.а., 2009). Гипотеза о важной роли иммунных нарушений в развитии эндометриоидных гетеротопий получила в последние годы широкое распространение (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2005; Анциферова Ю.С. с соавт., 2007; Iwabe T., e.a., 2000; Lebovic D.I., e.a., 2001; Berkkanoglu M., Arici A., 2003; Ulukus M, Arici A., 2005; Kyama C.M., e.a., 2009; Velasco I., e.a., 2010).
Развитие и рост эндометриоидных очагов происходит в перитонеальной полости. Известно, что в перитонеальной жидкости содержится большое количество клеток иммунной системы, преимущественно макрофагов, и разнообразных биологически активных веществ, участвующих в регуляции процессов клеточного роста и пролиферации (Vinatier D., e.a., 2001; Yang W.C.V., e.a., 2004; Nap A.., e.a., 2004). У женщин с эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация макрофагов, усилена их активация и продукция ими целого ряда цитокинов и факторов роста (Halme J., e.a., 1987; Gazvani R., Templeton A., 2002; Sidell N., e.a., 2002; Kyama C.M., e.a., 2003; Yang W.C.V., e.a., 2004). Однако до сих пор остается не решенным вопрос о том, почему, несмотря на высокий уровень активации, перитонеальные макрофаги пациенток с эндометриозом не элиминируют из перитонеальной полости гетеротопический эндометрий. В основе этого явления могут лежать нарушения экспрессии макрофагами функциональных рецепторов, а также изменения продукции цитокинов, хотя прямых доказательств этой гипотезы до сих пор не получено.
Эндометриальные клетки у пациенток с эндометриозом обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферацией и инвазивностью (Сотникова Н.Ю. с соавт., 2007; Vinatier D., e.a., 2000; Brenner R.M., e.a., 2002). Особую роль в обеспечении инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе отводят повышенной продукции протеолитических ферментов из семейства матриксных металлопротеиназ (MMPs) в ткани эндометриоидного очага (Ueda M., e.a., 2002; Alviggi C., e.a., 2004; Chen Q.H., e.a., 2004; Li Y., Lang J.H., 2006; Collette T., e.a., 2006). Однако до сих пор не установлены факторы, которые могут влиять на усиление синтеза ММРs при эндометриозе. Считают, что выживанию эндометрия в перитонеальной полости способствует угнетение апоптоза эндометриальных клеток (Dmowski W.P., e.a., 2004; Nishida M., e.a., 2004; Harada Н., е.а., 2004, 2007; Taniguchi F., e.a., 2011). По данным литературы, фагоциты играют важную роль в индукции апоптоза (Mor G., Abrahams V.M., 2003). Однако участие перитонеальных макрофагов в регуляции апоптоза клеток эндометрия при эндометриозе мало изучено.
Таким образом, выявление участия перитонеальных макрофагов и гуморальных факторов перитонеальной жидкости в обеспечении повышенной жизнеспособности и инвазивности ткани эндометриоидных очагов является актуальной задачей клинической иммунологии, так как позволит уточнить иммунные аспекты формирования и роста гетеротопий.
Цель исследования: установить механизмы участия перитонеальных факторов в регуляции апоптоза и инвазивности эндометриальных клеток при наружном генитальном эндометриозе для выяснения новых патогенетических аспектов эндометриоза
Задачи исследования:
1. Установить особенности функционального состояния перитонеальных макрофагов и содержания кальпротектина, IL-8, и MCP-1 в перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом.
2. Определить особенности экспрессии факторов, регулирующих апоптоз и инвазию (MT-1, XIAP, каспаза-3, ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом.
3. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на апоптоз стромальных клеток и на экспрессию факторов, регулирующих апоптоз (MT-1, XIAP, каспаза-3), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом и здоровых женщин.
4. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на экспрессию генов, регулирующих инвазивность (ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом.
5. Выявить влияние секреторных продуктов перитонеальных макрофагов и перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом на инвазию эндометриальных клеток в матригеле.
Научная новизна исследования
Установлены новые иммунные механизмы, участвующие в развитии и росте эктопического эндометрия в перитонеальной полости пациенток с наружным генитальным эндометриозом.
Показано, что развитие и рост очагов эндометриоза в перитонеальной полости происходят на фоне угнетения экспрессии перитонеальными макрофагами молекул, участвующих в межклеточном взаимодействии, презентации антигена и запуске апоптоза.
Выявлено, что распространенные формы наружного генитального эндометриоза ассоциируются с усилением внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов макрофагами, и повышением содержания в перитонеальной жидкости хемокинов и кальпротектина.
Показано, что развитие эндометриоза связано с нарушением регуляции апоптоза в ткани эндометрия, проявляющимся в повышении синтеза анти-апоптотическиого фактора XIAP в эутопическом эндометрии, усилении экспрессии мРНК каспазы-3 в ткани эндометриодного очага и резком снижении уровня экспрессии мРНК МТ-1 как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом.
Впервые установлено, что у здоровых фертильных женщин макрофаги и растворимые факторы перитонеальной жидкости in vitro усиливают апоптоз эндометриальных стромальных клеток, тогда как у пациенток с эндометриозом перитонеальная жидкость снижает апоптоз эндометриальных стромальных клеток, а перитонеальные макрофаги угнетают экспрессию мРНК регулирующих апоптоз факторов (MT-1, XIAP и каспазы-3) в ткани эутопического эндометрия.
Выявлено усиление инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе за счет изменения баланса в системе ММРs/TIMPs в сторону преобладания активности протеолитических ферментов.
Впервые показано, что факторы перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия, при этом перитонеальная жидкость повышает синтез в ткани эндометрия протеолитического фермента ММР-2, а макрофаги – угнетают экспрессию мРНК антипротеолитических факторов TIMP-1 и TIMP-2.
Впервые выявлено, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом аутологичная перитонеальная жидкость и продуцируемые макрофагами растворимые факторы усиливают инвазию в матригеле клеток эутопического эндометрия.
Практическая значимость результатов исследования
Выявлены новые патогенетические механизмы развития наружного генитального эндометриоза, заключающиеся в уточнении роли перитонеальных факторов в регуляции инвазивности и апоптоза эндометриальных клеток.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии степени тяжести наружного генитального эндометриоза, основанные на определении относительного содержания в перитонеальной жидкости уровня IL-8+ перитонеальных макрофагов.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии наружного генитального эндометриоза, основанные на определении уровня экспрессии в эндометрии мРНК XIAP.
Положения, выносимые на защиту
Высокий уровень синтеза XIAP в эутопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе обеспечивает повышение жизнеспособности эндометриальных клеток при их попадании в перитонеальную полость, тогда как усиление протеолитической активности ММР-2 и ММР-9 на фоне высокого уровня синтеза каспазы-3 способствует росту эндометриоидного очага.
Снижение экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами и усиление продукции провоспалительных цитокинов приводит к нарушению локального иммунного ответа и изменению микроокружения в перитонеальной полости, вызывая угнетение апоптоза клеток эутопического эндометрия и усиление их инвазивных свойств, что обеспечивает рост гетеротопий.
Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); 90-й Юбилейной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию академии «Неделя науки - 2010» (Иваново, 2010); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» с элементами научной школы для молодежи (Пермь, 2010).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводилось выполнение иммунологических исследований. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 8 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 197 источников, в том числе 24 отечественных и 173 иностранных источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.
Значимость факторов, участвующих в регуляции апоптоза и, инвазии клеток эндометрия, в развитии эндометриоидного1 очага
До сих пор нет единого мнения о патогенезе эндометриоза. В процессе изучения механизмов развития эндометриоза были предложены многочисленные теории происхождения данного заболевания, каждая- из которых по-своему объясняет суть патологического процесса. Многие исследователи называют эндометриоз «болезнью теорий» в связи с множеством теорий его происхождения, однако до сих пор ни одна из них полностью не объясняет многообразия форм проявления и локализации данной патологии [20, 29, 74].
К наиболее распространенным теориям происхождения эндометриоза относятся трансплантационная теория, теория метаплазии целомического эпителия, эмбриональная или дизонтогенетическая теория, теория диссеминации тканей эндометрия из полости матки по кровеносным и/или лимфатическим сосудам, а также иммунная теория.
Согласно господствующей на сегодняшний день трансплантационной теории, выдвинутой в 1927 году J. A. Sampson, эндометриоз развивается вследствие ретроградного заброса менструальной крови в перитонеальную полость через фаллопиевые трубы. Жизнеспособные фрагменты эндометрия, содержащиеся в менструальной крови, имплантируются на поверхности органов или тканей брюшной полости, где подвергаются циклическим преобразованиям в последующие менструальные циклы, включая пролиферацию и кровотечения, что создает возможность дальнейшего распространения эндометриальных имплантатов [83]. Однако данная теория не отвечает на главный вопрос, почему у некоторых женщин после ретроградной менструации развивается эндометриоз, а у других эти менструальные рефлюксные клетки эндометрия бесследно исчезают.
Метапластическая теория развития эндометриоза основана на способности целомического эпителия к трансформации в различные типы тканей. Согласно данной теории очаги эндометриоподобных желез и стромы образуются вследствие перерождения (метаплазии) брюшины. В пользу данной гипотезы говорят казуистические случаи возникновения, эндометриоза у мужчин. Данная теория-была впервые предложена Ивановым Н. С. (1897) и Meyer R. (1903).
Эмбриональная или дизонтогенетическая теория, происхождения. эндометриоза предполагает развитие его из остатков мюллеровых протоков и первичной почки. Описаны случаи эндометриоза у девочек, вступивших в стадию полового созревания, в период от телархе до наступления менархе, что свидетельствует в пользу эмбриональной теории эндометриоза [42, 124]. Данную теорию также подтверждают случаи сочетания эндометриоза с аномалиями развития половых органов [124].
Согласно теории лимфогенной и гематогенной диссеминации патогенеза эндометриоза, жизнеспособные и обладающие способностью к имплантации в окружающие ткани клетки эндометрия переносятся по лимфатическим и кровеносным сосудам. Подтверждением данной концепции могут служить случаи обнаружения эндометриальных клеток в просвете лимфатических и кровеносных сосудов, а также случаи поражения эндометриозом богато кровоснабжаемых органов, таких как кожа, мышцы, легкие [90]. В рамках данной концепции можно рассматривать и теорию ятрогенной диссеминации эндометриальных клеток в брюшную полость во время хирургических манипуляций на матке [83].
Многие исследователи отводят ведущую роль в возникновении эндометриоза генетическим факторам. Впервые генетическая концепция патогенеза эндометриоза была предложена С.Н. Frey (1957) и В. Ranney (1971), которые проанализировали случаи встречаемости эндометриоза у близких родственников. В дальнейшем роль генетических факторов в возникновении эндометриоза была подтверждена в работах Адамян Л.В. и Андреевой Е.Н. (1997), которые выявили взаимосвязь между генетическими факторами, онкоантигенами, иммунными сдвигами и изменениями уровня гормонов [1, 3]. В литературе описано повышение частоты встречаемости эндометриоза у дочерей матерей, страдающих эндометриозом [98,- 57], что также поддерживает гипотезу о наличии генетической предрасположенности к развитию эндометриоза.
Ранее большое внимание уделялось гормональной концепции эндометриоза. Был получен ряд экспериментальных и клинических доказательств того, что эндометриоз является эстроген - зависимым заболеванием и эстрогены непосредственно участвуют в процессах, определяющих рост эндометриоидных гетеротопий [63]. Известно, что у большинства женщин после менопаузы происходит атрофия эндометриоидных очагов, обусловленная снижением продукции половых гормонов, что также свидетельствует о важной- роли гормональных нарушений в механизмах развития эндометриоза [83]. В работах ряда авторов было показано, что высокий уровень эстрогенов, в эндометрии может стимулировать продукцию ростовых факторов эндометриальными стромальными клетками и приводить к усилению процессов пролиферации на границе эндометрия и миометрия [185], что служит дополнительным фактором, способствующим формированию эктопического эндометрия. Однако работы последних лет показали, что гормональные нарушения не являются непосредственной причиной формирования эндометриоидных очагов, а лишь способствуют этим процессам, играя роль триггерных факторов, предрасполагающих к возникновению патологического процесса [20, 36]. На сегодняшний день в работах ряда авторов высказывается мнение о том, что существовавшая ранее теория о важной роли гиперэстрогении в развитии гормонально-зависимых заболеваний матки уступило место теории изменения ритма и метаболизма половых гормонов, нарушению чувствительности яичников к гонадотропной стимуляции, а матки - к половым гормонам. Множество проведенных исследований, посвященных гормональному гомеостазу, не выявили специфичного для эндометриоза нарушения в длительной цепи гормональных взаимоотношений [20].
Достаточно давно было высказано предположение о том, что развитие эндометриоза происходит из-за нарушения гормональной регуляции в системе «гипоталамус - гипофиз - яичники - органы - мишени» [1]. По имеющимся литературным данным у женщин с эндометриозом повышено содержание в сыворотке и перитонеальной жидкости лютеинизирующего гормона и лептина [132, 126]. Повышение содержания лептина может играть антиапоптотическую роль в активированных эндометриальных стромальных клетках в перитонеальной полости, стимулируя имплантацию эндометриальных клеток [126]. Некоторые исследователи отмечают корреляцию повышения содержания лептина в сыворотке крови со стадией эндометриоза [192].
В последние годы интенсивно изучаются изменения в иммунной системе при эндометриозе. Многочисленные исследования свидетельствуют о нарушениях системного и локального звеньев иммунитета при эндометриозе [13, 36, 83, 64, 186]. Достаточно давно было показано, что у женщин, страдающих эндометриозом, наблюдаются общие признаки иммунодефицита и аутоиммунизации, приводящие к ослаблению иммунного надзора, которые и создают условия для имплантации эндометриальных клеток и формирования эндометриоидного очага [64]. Первые исследования, посвященные иммунным механизмам развития эндометриоза, показали, что у женщин с эндометриозом снижена пролиферация лимфоцитов периферической крови в ответ на презентацию антигенов эндометриальных клеток [64, 176].
Иммунологические методы исследования
Для выявления особенностей функционирования перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе нами был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии функциональных молекул CD Mb, CD49e, HLA-DR, CD95, CD95L, CD86 на поверхности макрофагов перитонеальнои жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом и у здоровых фертильных женщин. Полученные результаты представлены в таблице 3.1.1
Как видно из приведенных данных, в перитонеальнои жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом было достоверно снижено относительное содержание макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности интегриновые молекулы GDI lb и CD49e, по сравнению с показателями контроля (р 0,001 и р 0,05 соответственно). Кроме того, у женщин с наружным генитальным эндометриозом в перитонеальнои жидкости было достоверно снижено содержание макрофагов, несущих на своей поверхности HLA-DR молекулы, по сравнению с параметрами здоровых женщин (р 0,05). Также нами было отмечено, что уровень CD95L+ макрофагов в перитонеальнои жидкости женщин с эндометриозом был значительно ниже, чем аналогичный показатель в группе здоровых женщин (р 0,001). Нами не было выявлено достоверных различий в содержании CD95+ макрофагов в перитонеальнои жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом относительно показателей контроля (р 0,05). Достоверных различий в содержании CD86+ макрофагов в перитонеальнои жидкости женщин с наружным эндометриозом и здоровых фертильных женщин также отмечено не было (р 0,05), наблюдалась лишь тенденция к снижению относительного количества макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CD86 молекулы в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом.
Для уточнения роли перитонеальных макрофагов в иммунных механизмах, участвующих в развитии очага эндометриоза, мы провели дифференцированный анализ данных, характеризующих экспрессию функциональных рецепторов перитонеальными макрофагами женщин с наружным гснитальным эндометриозом, в зависимости от степени распространенности эндометриоидного процесса. Полученные данные представлены в таблице 3.1.2.
Как видно из приведенных данных, в перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом как 1-2, так и 2-3 степени распространенности патологического процесса было достоверно снижено содержание CDllb+ макрофагов относительно показателей контроля (р 0,001 и р 0,01 соответственно). Причем наиболее выраженное снижение наблюдалось в группе пациенток с 1-2 стадией наружного генитального эндометриоза. Содержание CD49e+ макрофагов в перитонеальной жидкости при эндометриозе изменялось только у пациенток с 1-2 степенью распространенности эндометриоидного процесса. У этих женщин уровень CD49e+ макрофагов был достоверно снижен относительно аналогичного параметра здоровых женщин (р 0,01). При 3-4 стадии эндометриоза количество перитонеальных макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CD49e молекулы, не отличалось от такового в группе здоровых фертильных женщин (р 0,05). Уровень экспрессии HLA-DR. молекул перитонеальными макрофагами в обеих подгруппах женщин с эндометриозом был достоверно снижен по сравнению с показателями здоровых женщин (р 0,05 в обоих случаях). Как видно из таблицы 3.1.2. в перитонеальнои жидкости женщин с эндометриозом вне зависимости от стадии распространенности эндометриоидного процесса был резко снижен уровень CD95L+ макрофагов по сравнению с показателями контроля (р 0,001, р 0,01, соответственно). статистически достоверны ( - р 0,05, - р -0,01, - р 0,001). Анализ полученных результатов не выявил достоверных изменений в экспрессии CD95 и CD86 перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом различной степени тяжести патологического процесса относительно аналогичных параметров здоровых фертильных женщин (р 0,05 во всех случаях). По мнению многих исследователей, макрофаги играют ведущую роль в изменении цитокииового профиля перитонеальной жидкости [83]. Для оценки характера иммунного ответа в перитонеальной жидкости при наружном генитальном эндометриозе, нами было проведено исследование внутриклеточной продукции цитокинов перитонеальными макрофагами женщин с эндометриозом в зависимости от стадии заболевания. Данные, характеризующие особенности внутриклеточного синтеза цитокинов макрофагами перитонеальной жидкости при эндометриозе, представлены в таблице 3.1.3.
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при наружном генитальном эндометриозе достоверно повышена внутриклеточная продукция перитонеальными макрофагами провоспалительных цитокинов IL-1[3, IL-8 и TNFa относительно показателей здоровых женщин (р 0,05; р 0,05 и р 0,01 соответственно).
Мы провели дифференцированный анализ данных, характеризующих внутриклеточный синтез цитокинов перитоиеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом в зависимости от степени распространенности эндометриоидного процесса. Полученные данные представлены-в таблице 3.1.4.
Как видно из приведенных данных, изменение внутриклеточной продукции макрофагами IL-lp и IL-8 отмечалось только у пациенток с 3-4 стадией наружного эндометриоза. В этой подгруппе уровень перитонеальных IL-1(3+ и IL-8+ макрофагов был достоверно выше, чем у женщин контрольной группы (р 0,001 и р 0,01 соответственно). Тогда как при 1-2 стадии эндометриоза внутриклеточная продукция IL-lp и IL-8 макрофагами не отличалась от таковой у здоровых фертильных женщин (р 0,05 в обоих случаях). Нами было установлено, что внутриклеточная продукция TNFa перитонеальными макрофагами при эндометриозе не зависела от степени распространенности патологического процесса и уровень TNFa+ макрофагов в перитонеальной жидкости женщин как с 1-2 стадией, так и с 3-4 стадией наружного эндометриоза был достоверно повышен относительно значений контрольной группы (р 0,01 и р 0,05 соответственно).
Дифференцированный анализ данных внутриклеточной продукции IL-6 при различной степени распространенности наружного генитального эндометриоза показал, что при 1-2 стадии заболевания содержание перитонеальных IL-6+ макрофагов не отличалось от показателей здоровых женщин (р 0,05), а при 3-4 стадии эндометриоза внутриклеточная продукция IL-6 перитонеальными макрофагами была достоверно выше аналогичного параметра в контрольной группе (р 0,05). Статистически значимых изменений внутриклеточной продукции IL-12 перитонеальными макрофагами у пациенток с 1-2 и 3-4 стадией эндометриоза выявлено не было (р 0,05 в обоих случаях).
Учитывая выявленные отличия в содержании перитонеальных макрофагов, продуцирующих внутриклеточно IL-1(3, IL-6 и IL-8, у женщин с 1-2 и 3-4 стадией наружного генитального эндометриоза, мы определили пороговые значения показателей внутриклеточной продукции этих цитокинов, использование которых позволило бы проводить дифференциальный диагноз степени распространенности патологического процесса. Определение пороговых значений проводилось с помощью ROC-анализа (Рисунок 3.1.1). Было установлено, что наружный генитальный эндометриоз 3-4 стадии диагностируется при значениях относительного содержания IL-1P+ макрофагов более 76,2% (чувствительность 53 %, специфичность - 75%), IL-6+ макрофагов - более 62,8% (чувствительность 64,7%, специфичность - 75), IL-8+ макрофагов - более 73,2% (чувствительность 80%, специфичность - 81,8). То есть максимальной диагностической значимостью обладает показатель IL-8+ макрофагов.
Особенности содержания цитокинов, регулирующих апоптоз и инвазию, в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом
Анализ полученных результатов показал, что у женщин с наружным генитальным эндометриозом уровень экспрессии мРНК МТ-1 был достоверно снижен как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии относительно аналогичного показателя в эндометрии здоровых женщин (р 0,05 в обоих случаях). Уровень экспрессии мРНК фактора XIAP, обладающего выраженным анти-апоптотическим действием, был значительно повышен в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом относительно показателей контроля (р 0,05). Однако в самом эндометриоидном очаге мы.не выявили статистически значимых изменений в экспрессии мРНК XIAP по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин (Таблица 4.1.1.). Сравнительный анализ уровня экспрессии мРНК XIAP в эутопическом и эктопическом эндометрии пациенток с наружным генитальным эндометриозом показал, что в ткани эндометриоидного очага экспрессия мРНК XIAP была снижена по сравнению с таковой в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом (р 0,05) (рис. 4.1.1.) При оценке характера спонтанной экспрессии мРНК каспазы-3 в эндометриальной ткани было установлено, что уровень экспрессии мРНК этого фактора в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом практически не отличался от показателей контроля (р 0,05) (Таблица 4.1.1). Непосредственно в эндометриоидном очаге уровень экспрессии мРНК каспазы-3 был достоверно повышен относительно аналогичного параметра в эндометрии здоровых женщин (р 0,05). Следует особо подчеркнуть, что уровень экспрессии мРНК каспаза-3 в очаге эндометриоза был также достоверно выше относительно такового параметра в эутопическом эндометрии женщин с наружным генитальным эндометриозом (р 0,01) (Рис. 4.1.1.).
Для оценки уровня апоптоза эндометриальных стромальных клеток при эндометриозе мы выделяли ферментативным методом обогащенную популяцию стромальных клеток из ткани эндометрия и оценивали уровень их апоптоза в тесте с Annexin V методом проточной цитометрии. При анализе данных гейт стромальных клеток устанавливали, используя окрашивание клеток на Vimentin. Не менее 90% Vimenlin+ клеток содержалось в каждом анализируемом гейте.
Известно, что при вступлении клетки в апоптоз, происходит инверсия белка фосфатидилсерина на поверхность клетки, в результате чего она приобретает способность связываться с Annexin V. Дополнительная окраска клеток пропидиумом йодидом (Pi) позволяет одновременно определить стадию апоптоза клетки. Эндометриальные стромальные клетки, фиксирующие на своей поверхности Annexin V, но не окрашивающиеся пропидиумом йодидом (Annexin V+Pi -), оценивались нами как клетки, находящиеся на ранних этапах апоптоза, а дабл-позитивные Annexin V+Pi+ -как клетки, вступившие в поздние, необратимые этапы апоптоза. Данные, характеризующие апоптоз стромальных клеток эутопического и эктопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом, представлены в таблице 4.1.2.
Как видно из приведенных данных, достоверных различий в количестве клеток, вступивших в апоптоз, в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным генитальным эндометриозом, нами не отмечалось (р 0,05 в обоих- случаях). Количество клеток, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза как в эутопическом эндометрии, так и в очаге эндометриоза также достоверно не отличалось от аналогичных показателей эндометрия здоровых женщин (р 0,05 во всех случаях).
Таким образом, в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом была усилена экспрессия мРНК анти-апоптотического фактора XIAP и снижена экспрессия мРНК МТ-1. Отличительной характеристикой ткани эндометриоидиого очага являлось усиление экспрессии мРНК про-апоптотического фактора каспазы-3, сопровождающееся низким уровнем экспрессии мРНК МТ-1. Изменений в эутопическом и эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом содержания стромальных клеток, вступивших в апоптоз, выявлено не было. 4.2. Особенности синтеза факторов, регулирующих инвазивность клеток, в эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе
Важную роль в обеспечении процессов инвазии эндометриальных клеток в перитонеальной полости отводят тканевому протеолизу, опосредованному энзимами из семейства матриксных металлопротеиназ (MMPs) и их тканевых ингибиторов (TIMPs) [122]. Для уточнения иммунных механизмов, регулирующих процессы формирования и роста эктопического эндометрия в перитонеальной полости, нами было проведено исследование особенностей экспрессии в ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин с эндометриозом мРНК ММР-2 и ее специфического ингибитора TIMP-2, а также ММР-9 и ее тканевого ингибитора TIMP-1. Количественная оценка уровня экспрессии мРНК проводилась методом RT-PCR в режиме реального времени.
Данные, характеризующие уровень экспрессии мРНК этих факторов в эндометриальной ткани женщин с эндометриозом, представлены в таблице 4.2.1. и на рисунке 4.2.1.
В эутопическом эндометрии при эндометриозе по нашим данным s усиливалась экспрессия мРНК как ММР-2, так и ее специфического ингибитора TIMP-2 относительно показателей эндометрия здоровых женщин (р 0,05 в обоих случаях) (Таблица 4.2.1.). Заслуживает особого внимания выявленное нами соотношение уровней экспрессии мРНК этих ферментов в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом: уровень экспрессии мРНК анти-инвазивного фактора TIMP-2 более чем в 3 раза превышал экспрессию мРНК ММР-2 (рис. 4.2.1.).
В очаге эндометриоза изменения экспрессии мРНК ММР-2 и TIMP-2 имели другую направленность. В эктопическом эндометрии при эндометриозе экспрессия мРНК ММР-2 была повышена по сравнению с аналогичными показателями здоровых женщин (р 0,05), тогда как уровень экспрессии мРНК TIMP-2 в очаге эндометриоза существенно не отличался от аналогичного показателя в эндометрии здоровых женщин (р 0,05) (Таблица 4.2.1.)- Баланс активности ферментов с про- и антипротеолитической активностью в эндометриоидном очаге также отличался от такового в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом и характеризовался практически одинаковым уровнем экспрессии мРНК как ММР-2, так и ее специфического ингибитора TIMP-2 (рис. 4.2.1.).
Нами не было выявлено достоверных изменений в экспрессии мРНК ММР-9 в эутопическом эндометрии пациенток с наружным генитальным эндометриозом относительно показателей контроля (р 0,05). При этом уровень экспрессии мРНК TIMP-1 в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом был значительно повышен относительно аналогичного показателя здоровых женщин (р 0,05). Соотношение синтеза ММР-9 и TIMP-1 в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом характеризовалось доминированием активности антипротеолитической активности TIMP-1 (рис. 4.2.1.).
В очаге эндометриоза нами было выявлено достоверное повышение уровня экспрессии мРНК как ММР-9, так и TIMP-1 относительно показателей эндометрия здоровых фертильных женщин (р 0,05 в обоих случаях). При этом в эктопическом эндометрии сохранялась та же направленность соотношения синтеза ММР-9 и TIMP-1, которая отмечалась в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом, характеризующаяся превалированием активности фактора TIMP-1 (рисунок 4.2.1.).
Особенности синтеза факторов, регулирующих инвазивность клеток, в эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе
Нами не было выявлено достоверных различий в содержании IL-6+ и IL-12+ макрофагов в перитонеальнои жидкости у пациенток с эндометриозом и у женщин контрольной группы. Однако при поведении дифференцированного анализа данных внутриклеточной продукции IL-6 при различной степени распространенности наружного Тенитального эндометриоза показал, что при 1-2 стадии заболевания содержание перитонеальных IL-6+ макрофагов не отличалось от показателей здоровых женщин, а при 3-4 стадии эндометриоза внутриклеточная продукция IL-6 перитонеальными макрофагами была достоверно выше аналогичного параметра в контрольной группе. Статистически значимых изменений внутриклеточной продукции IL-12 перитонеальными макрофагами у пациенток с 1-2 и 3-4 стадией эндометриоза выявлено не было.
Известно, что IL-6 относится к группе провоспалительных цитокинов и может оказывать плейотропное действие, влияя на репарацию тканей, стимулируя ангиогенез, активируя макрофаги и усиливая клеточную пролиферацию в эндометрии [83]. В работах многих авторов был показан высокий уровень содержания IL-6 в перитонеальнои жидкости женщин с эндометриозом [98, 93 и др.], который коррелировал со стадией заболевания [68]. Таким образом, наши данные о высоком уровне IL-6-позитивных макрофагов в перитонеальнои жидкости женщин с распространенными формами эндометриоза согласуются с ранее проведенными исследованиями и позволяют говорить о важной роли этого цитокина в процессах роста эндометриоидной ткани.
Для уточнения роли факторов перитонеальнои жидкости в регуляции процессов формирования и роста эндометриоидного очага, мы оценили содержание в перитонеальнои жидкости ряда цитокинов, влияющих на апоптоз и инвазию. Нами было установлено, что у женщин с наружным генитальным эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация кальпротектина, МСР-1 и IL-8.
Исследованиями разных авторов было показано, что у женщин с эндометриозом повышено содержание в перитонеальной жидкости МСР-1 (макрофагального хемотаксического протеина), причем выраженость этих изменении коррелирует со степенью тяжести заболевания [180, 44, 62]. Ряд исследователей отводят МСР-1 важную роль в: метастазироваиии опухолей, индукции пролиферации и инвазии опухолевых клеток [141]. Показано, что МСР-1 вызывает развитие как острого, так и хронического воспаления в результате рекрутирования в очаг воспаления тучных клеток, эозинофилов и макрофагов [55]. В свою очередь, эти клетки могут индуцировать реакцию эпителиально-мезенхимальную трансформации, которая играет важную роль при формировании ткани эндометриоидного очага [187]. Выявленное нами повышение содержания МСР-1 в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом 3-4 стадии уровень по сравнению с показателями здоровых женщин и женщин с эндометриозом 1 -2 степени также позволяет говорить о возможном вовлечении данного хемокина в механизмы роста эндометриоидных гетеротопий.
В перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом по нашим данным также была повышена концентрация хемокина 1L-8, причем это повышение коррелировало со степенью распространенности патологического процесса и максимально проявлялось при 3-4 стадии заболевания. Данные по содержанию IL-8 в перитонеальной жидкости полностью соответствуют полученным нами результатам о высокой внутриклеточной продукции 11 о перитонеальными макрофагами женщин с распространенными формами эндометриоза.
Известно, что IL-8 способствует пролиферации строгальных эндометриальных клеток [186], что может усиливать рост эндометриальных имплантов. Selam с соавт. [161J изучали влияние IL-8 на экспрессию FasL эндометриальными клетками. Они выявили дозо-зависимое стимулирующее действие IL-8 на экспрессию FasL молекул эндометриальными стромальными клетками. На основании полученных данных авторы высказали предположение о том, что высокий уровень экспрессии FasL-молекул в стромальных клетках эндометриоидного очага может быть важнейшим механизмом, способствующим усилению выживания эндометриоидных клеток, за счет приобретения ими способности индуцировать апоптоз активированных Fas-позитивных Т-лимфоцитов в перитонеальной полости и тем самым избегать атаки со стороны клеток иммунной системы [161]. По мнению ряда авторов, IL-8 влияет на хемотактическую активность преимущественно нейтрофилов и ингибирует их апоптоз даже при одновременной экспрессии Fas молекул [115]. Kwak е.а. (2002) в эксперименте установили, что внесение в культуру нейтрофилов перитонеальной жидкости женщин с тяжелыми формами эндометриоза снижало уровень их спонтанного апоптоза. По мнению авторов, IL-8 является одним из факторов выживаемости макрофагов в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом [140]. Таким образом, нарушение иммунного надзора со стороны фагоцитарных клеток в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом может быть ассоциировано с прогрессировавием заболевания [140].
Нами также было выявлено повышение содержания кальпротектина в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом. Как известно, кальпротектин относится к семейству S100 протеинов и представляет собой гетерокомплекс кальций-зависимых белков S100A8/A9 [167]. Известно, что кальпротектин высвобождается из нейтрофилов и макрофагов во время их активации или гибели и вовлекается в активный воспалительный процесс. К настоящему времени показано, что кальпротектин может оказывать различное действие на клеточный рост, в ряде случаев прямо противоположное [169]. С одной стороны, кальпротектин является сильным
![Роль индукторов апоптоза TGF [B] 1 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором](/i/i/4228/392260.png "Роль индукторов апоптоза TGF [B] 1 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором Кирсанов Алексей Николаевич")
