Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзо литературы р Эндогенная опиоидная система, её агенты и функции 11
1.1. Открытие эндогенных опиоидных пептидов и их рецепторов 11
1.2. Функции и особенности действия Р-эндорфина в организме 12
1.2.1 Эндогенный синтез Р-эндорфина, процессинг ПОМК 13
1.2.2. Функции и воздействие Р-эндорфина при стрессе 14
1.2.3. Анальгетический эффект Р-эндорфина 16
1.2.4. Продукция Р-эндорфина клетками иммунной системы 17
1.3. Опиатные рецепторы. Классификация и структура 17
1.3.1. (х-опиатный рецептор 22
1.3.2. 8-опиатный рецептор 23
1.4. Иммунологические эффекты Р-эндорфина и селективных агонистов fi- и 8-рецепторов 24
1.4.1. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на эффекторы врожденного иммунитета 24
1.4.1.1. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на функциональную активность клеток моноцитрно-макрофагального ряда 24
1.4.1.2. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на секрецию цитокинов моноцитами и макрофагами 26
1.4.1.3. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на функции полиморфноядерных лейкоцитов 29
1.4.1.4. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на функциональную активность NK-клеток 30
1.4.1.5. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на функции дендритных клеток
1.4.2. Влияние Р-эндорфина и агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на клетки адаптивного иммунитета 31
1.4.2.1. Влияние агонистов fi-, 8-опиатных рецепторов на функции В-лимфоцитов 31
1.4.2.2. Влияние агонистов м-, д-опиатных рецепторов на функции Т-лимфоцитов 33
1.4.3. Неопиоидные эффекты Р-эндорфина 35
1.5. Опиатэргическая система в филогенезе 36
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Основные экспериментальные подходы
2.2.1. Введение препаратов 41
2.2.2. Иммунизация 42
2.2.3. Приготовление клеточной суспензий селезенки 42
2.2.4. Подсчет количества лейкоцитов и ЯСК в суспензиях
2.2.5. Определение числа антителобразующих клеток методом локального гемолиза в геле агарозы 49
2.2.6. Определение количества антител в реакции активной гемагглютинации с нативными эритроцитами барана
2.2.8. Оценка пролиферативной активности спленоцитов 51
2.2.9. Оценка продукции АФК и выработки цитокинов перитонеальными макрофагами 2.2.10. Определение концентрации кортикостерона 52
2.2.11. Определение концентрации цитокинов 52
2.3. Статистический анализ результатов 53
Глава 3. Влияние (3-эндорфина на функции адаптивного иммунитета 54
3.1. Влияние Р-эндорфина и селективных агонистов д- и 8-опиатных рецепторов на гуморальный иммунный ответ в условиях системной иммунизации 54
3.2. Влияние Р-эндорфина на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов 61
3.3.2. Влияние Р-эндорфина на пролиферацию и секрецию цитокинов на фоне блокады опиатных рецепторов 65
3.3. Зависимость выраженности эффектов Р-эндорфина на системный иммунный ответ от времени его введения 69
Глава 4. Влияние р -эндорфина на секреторную активность перитонеальных макрофагов in vivo 75
Заключение 95
Выводы 96
Список основных сокращений 97
Список литературы
- Продукция Р-эндорфина клетками иммунной системы
- Иммунизация
- Влияние Р-эндорфина на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов
- Зависимость выраженности эффектов Р-эндорфина на системный иммунный ответ от времени его введения
Продукция Р-эндорфина клетками иммунной системы
Эндорфины - пептиды, образующиеся в результате процессинга про-опиомеланокортина. В настоящее время говорят о наличии а-, (3-, у-эндорфинов, из которых наиболее активен Р-эндорфин. Он проявляет широкий спектр эффектов на различные системы организма, является фактически связующим звеном в механизмах взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем.
Особенностью Р-эндорфина, молекула которого состоит из 31 аминокислотного остатка, является способность взаимодействовать с [і- и 5-рецепторами. При этом Р-эндорфин 1-27 проявляет себя как антагонист, а Р-эндорфин 1-26 не оказывает эффектов [113; 189]. Ацетилирование Р-эндорфина также ограничивает его активность через опиатные рецепторы. Причиной этого явления может послужить то, что формы Р-эндорфина с недостатком опиоидной активности имеют другие функции [85; 270].
Концентрация Р-эндорфина в крови - непостоянная величина. Так, некоторыми исследователями показано, что пик выработки Р-эндорфина у лошадей приходится на утро (9.00 AM). Однако другими авторами, определявшими концентрацию Р-эндорфина каждые 2 часа с 8.00 AM до 8.00 РМ, не были отмечены достоверные отличия между уровнями Р-эндорфина в течение суток [114; 203; 176].
Однако суточные колебания уровня Р-эндорфина и его предшественника отмечаются также другими авторами [260; 160; 70]. В частности, в статье Straub H.R. сообщается, что уровень белка в сыворотке имеет циркадный ритм с минимальным значением около полуночи. И этот ритм напрямую связан с выбросом мелатонина, который также влияет на активацию CD4+ Т-лимфоцитов и выброс цитокинов IL-2, IL-4. Другая группа исследователей подтверждает влияние Р-эндорфина на NK-клетки и другие лимфоциты. И это воздействие связано с изменением концентрации Р-эндорфина в нейронах аркуатного ядра, а также с изменением концентрации КРГ в паравентрику-лярном ядре [260]. В целом, литературные данные о суточных колебаниях концентрации Р-эндорфина противоречивы, как и данные о сезонном изменении его концентрации в периферической крови [114; 203; 176].
Прогормон проопиомеланокортин (ПОМК) синтезируется в аркуатном ядре гипоталамуса. Этот полипептид дает начало множеству регуляторных пептидов (АКТГ, МСГ, липотропин, Р-эндорфины), которые регулируют функции нервной, иммунной, кровеносной, ноцицептивной систем, а также рост и пигментацию [179; 180]. На рисунке 1 показаны пептиды-дериваты
Конвертазы прогормона специфически связываются с участками, содержащими фланкирующие аминокислоты аргинин и лизин, расщепляют пептидную связь между ними, тем самым разваливая молекулу на «кусочки», обладающие биологической активностью [55; 65].
В настоящее время клонировано семь представителей PC-семейства: РС1 (РСЗ или PC 1/3); РС2; фурин (или РАСЕ); РАСЕ4; РС4; РС5/РС6; РС7 (может обозначаться как LPC 5 или С8). Конвертазы РС2 и РС4 специфичны для яичников и семенников, остальные синтезируются в том числе иммунными клетками. Наиболее важными для синтеза опиоидных пептидов являются конвертазы РС1 и РС2. РС1 участвует в отщеплении крупных молекул предшественников, в то время как РС2 вступает в дальнейшее созревание и реализует пептиды меньших размеров. Фермент РС1 расщепляет молекулу ПОМК до АКТГ и, действуя совместно с РС2, катализирует его расщепление до ос-МСГ (АКТГ1-13). Также была исследована роль РС1 и РС2 в обработке продинорфина у грызунов. Конвертаза РС2 способна действовать без предварительной обработки предшественника конвертазой РС1, отщепляя низкомолекулярные опиоидные пептиды: динорфин А (1-17), динорфин В (1-13), альфа-нео-Р-эндорфин, а также динорфин А (1-8) и небольшое количество лей-энкефалина.
Было показано, что генерирование низкомолекулярных опиоидных пептидов из промежуточных соединений опосредуется почти полностью РС2, поскольку количество зрелых энкефалинов снижалось на 75% в головном мозге РС2 нокаутированных мышей. Выявлено присутствие и колокали-зация РСЗ и проэнкефалина в макрофагах млекопитающих, что позволяет предположить участие РСЗ в посттрансляционной обработке данного предшественника [73; 244; 259].
В множестве работ, посвященных изучению стресса и ответу на него различных систем, отмечается значительное увеличение концентрации 3-эндорфина в крови и плазме [42; 30; 35; 25; 152; 17; 258; 235; 209; 29; 188]. В норме уровень циркулирующего пептида достаточно низкий - порядка 10" М, но под воздействием стресса концентрация пептида возрастает в 3-10 раз.
Концентрация Р-эндорфина повышается в 2-3 раза при остром болевом стрессе, при этом источником пептида является гипоталамус. Кратковременный иммобилизационный стресс также усиливает выброс Р-эндорфина [253; 217; 132], при этом его концентрация повышалась уже на вторую минуту после стресса. После 10 минут ротационного стресса было зарегистрировано увеличение концентрации Р-эндорфина в плазме в два раза сразу после прекращения воздействия, а спустя 6 часов уровень опиоидного пептида возрастал в 8 раз. Однако, если время ротации увеличивалось до 20 минут, изменения в концентрации Р-эндорфина были менее значимыми [152]. При электроболевом воздействии на конечности крыс [35], геморрагическом шоке [42; 258], а также при операционном стрессе [17; 25; 29; 30] концентрация Р-эндорфина возрастала в 10 раз.
Концентрация Р-эндорфина в плазме значительно повышалась в ответ на длительные физические упражнения, если их интенсивность составляла более 50% от максимальной аэробной нагрузки, и при максимальной нагрузке, если она продолжалась как минимум, в течение 3 мин. Такого не наблюдалось при слабых воздействиях независимо от их длительности [228]. Однако в других исследованиях не было зарегистрировано изменений в уровне плазменного Р-эндорфин после 20-60-минутных упражнений у тренированных мужчин [117].
На сегодняшний день принято считать, что высвобождение опиоидных пептидов происходит не тонически, а лишь при сигналах, свидетельствующих об отклонении от гомеостаза [34; 39]. Несмотря на это, есть данные, что Р-эндорфин/р-липотропин выделяется не только в состоянии стресса, но и в состоянии покоя [109].
Иммунизация
Через 1 ч. после введения опиатного агониста мышей иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ), в разовой дозе 10 кл/0,2 мл 0,9% NaCl. На пятые сутки животных выводили из эксперимента цервикаль-ной дислокацией под эфирным наркозом, определяли титр антиэритроцитар-ных антител в плазме периферической крови методом прямой гемагглютина-ции и количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы по Ерне [133]. Для постановки реакции готовили 0,75% золь агарозы марки Б (Олайнский завод химреактивов), добавляя раствор Хенкса, его далее разогревали на водяной бане, доводя до прозрачности. Затем золь разливали в пробирки по 2,5 мл и охлаждали до 45 С в ультратермостате.
ЭБ отмывали средой. Оставляли 2-3 мм жидкости над осадком, перемешивали - это была рабочая суспензия. Затем в пробирку с агарозой вносили по 0,025 мл эритроцитов барана и рабочий объем клеток (0,5x10 ЯСК/0,1 мл - для спленоцитов). Смесь разливали на предварительно подогретые чашки Петри фирмы «Anumbra», отличающиеся от обычных чашек ровным дном. После застывания геля агарозы чашки инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Затем добавляли по 2,5 мл комплемента (производство ФГУП «НПО Микроген», Пермский филиал «Биомед», ампула лиофилизированного комплемента разводилась в 5 мл среды 199). Через 1 ч. инкубации при 37 С комплемент сливали. Число зон гемолиза, каждая из которых соответствует одной антителобразующей клетке, подсчитывали под световой лупой при боковом освещении. Результаты выражали в виде logioAOK на 1 млн. ядросодержащих клеток и на весь орган.
Для постановки реакции гемагглютинации сыворотки раститровывали с двукратным шагом в диапазоне от 1:2 до 1:4096 в пластиковых круглодон-ных 96-луночных планшетах для иммунологических реакций (завод медицинских полимеров, Санкт-Петербург) на физиологическом растворе с добавлением 0,2% человеческого сывороточного альбумина (рН=7,3) в объеме 25 мкл на лунку микротитровальной панели. В каждую лунку добавляли по 25 мкл 0,5% суспензии нативных эритроцитов барана. Пробы инкубировали в течение 2 ч. при температуре 40 С. Результаты реакции оценивали общепринятым способом и выражали с учетом log-нормального распределения данных в виде отрицательных log2 обратного титра антител. 2.2.8. Оценка пролиферативной активности спленоцитов
Для оценки пролиферативного ответа спленоциты выделяли и культивировали их в пластиковых кругло донных 96-луночных планшетах (завод «Медполимер», Санкт-Петербург) в течение 72 ч. Каждая культура содержала 5x10 клеток в 0,2 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore на основе среды RPMI 1640 («Gibco Live Technology», США) с добавлением Glutamax («Gibco Live Technology», США), комплекса незаменимых аминокислот (MEM) («Gibco Live Technology», США), пирувата натрия (Sodium piruvate) («Gibco Live Technology», США) в соотношении 1:100, ген-тамицина из расчета 2,5 мкл на 1 мл готовой среды, меркаптоэтанола (10 М) из расчета 10 мкл на 1мл и 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) («Биолот»). Показатели рН доводили NaOH до 7,4. В качестве митогенов использовали липополисахарид (ЛПС E.coli В55:05, «Sigma»; 10 мкг/мл) и конканавалин А (Кон A, «Sigma»; 20 мкг/мл). Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СОг при 37 С в течение 72 ч. За 18 ч. до окончания культивирования в лунки вносили по 2 мкКи Н-метилтимидина в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждали на фильтры при давлении вакуумного насоса 0,5-1,0 атм., промывая лунку 0,85% расвором NaCl. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» («Wallac», Финляндия) после высыхания фильтров. При подсчете радиоактивности использовали сцинтилляци-онную жидкость ЖС-107.
Для оценки выработки активных форм кислорода перитонеальные макрофаги выделяли в 2 мл холодного раствора Хэнкса («Биолот») и вносили в плоскодонный 96 луночный планшет в концентрации 2x10 клеток в 0,2 мл раствора. В качестве индуктора окислительного взрыва добавляли опсонизи-рованный зимозан (150 мкг/мл) и люминол для оценки интенсивности ХЛ. Данные об интенсивности реакции ЛЗХЛ записывали в течение 1 ч. с интервалом 5 мин. с помощью спектрофотометра TEC AN (Австрия). Для оценки продукции цитокинов макрофаги культивировали в ППС с теми же условиями, что и для спленоцитов (см. выше) в течение 24 ч.
Подопытные животные были разделены на две группы. Р-Эндорфин вводили внутрибрюшинно в дозе 0,0005 мкг/кг. Животных из первой группы выводили из эксперимента через 1 ч. после введения пептида, животных второй группы - через 6 ч. Эксперимент планировали таким образом, чтобы забор крови произвести в утренние часы с 8 до 11 . Сыворотку крови животных собирали в пробирки Эппендорфа, замораживали и хранили при температуре -20С. Концентрацию кортикостерона определяли методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора Enzo Life Sciences (США) при помощи спектрофотометра TECAN (Австрия).
Для оценки секреторной активности спленоцитов и перитонеальных макрофагов супернатанты 24-часовых (IL-2, IL-1J3, IL-10, TNF-a) и 48-часовых (IL-4, IFN-y) культур собирали в пробирки Эппендорфа, замораживали и хранили при -20 С. Количественное определение цитокинов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Bender Medsystems (Австрия) и R&D (США) по методике, предложенной производителем. 2.3. Статистический анализ результатов
Полученный материал обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Для оценки зависимости «доза-эффект» использовали одно-факторный дисперсионный анализ для непарных данных и post-hoc критерия наименьшей значимой разницы (LSD-тест). При оценке совместных эффектов Р-эндорфина и антагонистов использовали факторный анализ и непарный /-критерий Стьюдента. Все результаты на рисунках представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (М±т).
Влияние Р-эндорфина на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов
В данном разделе представлены данные о том, насколько модифицируются эффекты Р-эндорфина (0,0005 мкг/кг) в условиях предварительной блокады опиатных рецепторов селективным и неселективным антагонистами. В ходе экспериментальных исследований мы подтвердили стимулирующий эффект низкой дозы Р-эндорфина (F=8,00; р 0,006) на индуцированную Кон А пролиферацию (рисунок 14). При проведении факторного анализа было зарегестрировано факторное взаимодействие Р-эндорфина и налоксона гидрохлорида (F= 4,1; р 0,05). Последующее сравнение средних показало, что предварительное введение мышам налоксона гидрохлорида отменяло активирующее действие Р-эндорфина на стимулированный Кон А пролифера-тивный ответ. На фоне блокады только 8-опиатных рецепторов налтриндо-лом гидрохлоридом эффекты Р-эндорфина не модифицировались.
Статистически значимый эффект был получен при оценке влияния пептида на секрецию IL-4 (F=6,32; р 0,05) (рисунок 15 Б). Р-Эндорфин стимулировал Кон А-индуцированную продукцию IL-4. Ввдение мышам налоксона нивелировало эффект Р-эндорфина. Продукция IL-2 и IFN-y под влиянием исследуемых факторов статистически значимо не изменялась ни в спонтанных, ни в митоген-индуцированных культурах (рисунок 14 Б, 15 Б).
Таким образом, Р-эндорфин усиливал пролиферативную активность и продукцию IL-4 в стимулированных Кон А культурах (F=6,3; р=0,017), эффект блокировался налоксоном, что свидетельствует об участии д-рецепторов в регуляции процессов пролиферации и продукции IL-4 клетками селезёнки под воздействием Р-эндорфина. A
Суммируя представленные в этом разделе данные, можно сделать следующее заключение: 1. Р-Эндорфин при внутрибрюшинном введении в низких дозах усиливает ЛПС и Кон А-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов, стимулирует продукцию IL-4 и угнетает спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию IL-2.
Баева Т.А., Небогатиков В.О. Модуляция функциональной активности спленоцитов бета-эндорфином в условиях блокады опиатных рецепторов // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7. - № 2-3. - С. 164. 3.3. Зависимость выраженности эффектов Р-эндорфина на системный иммунный ответ от времени его введения
Согласно литературным данным Р-эндорфин относится к молекулам коротко дистантного действия, так как очень быстро расщепляется протеазами крови, церебро-спинальной жидкости и других биологических сред, поэтому основным методологическим приемом в наших экспериментах было введение пептида за 1 ч. до момента антигенной активации иммунной системы. Тем не менее наличие в организме сложнейших регуляторных систем дает возможность предполагать существование опосредованных, отсроченных по времени эффектов. Поэтому на следующем этапе мы исследовали способность Р-эндорфина оказывать воздействие на количество АОК селезенки, титр антиэритроцитарных антител, продукцию IL-2 и IL-4 в зависимости от времени, прошедшего между введением пептида и иммунизацией.
Данные о влиянии Р-эндорфина в зависимости от времени введения на антителогенез в селезёнке представлены на рисунке 16. Установлено, что пептид значимо влиял на исследуемые показатели за час до введения антигена и через час после введения. При одномоментном введении Р-эндорфина и антигена наблюдалась выраженная тенденция к стимуляции как количества АОК в селезенке, так и антиэритроцитарных антител в плазме крови, но она оказалась статистически незначимой. Введение Р-эндорфина за 6 и через 6 ч. после иммунизации влияния на интенсивность антителогенеза в селезёнке не оказывает (рисунок 16).
При оценке влияния пептида на продукцию IL-2 и IL-4 за 1 ч. и за 6 ч. до выведения животных из эксперимента были получены следующие результаты. При оценке влияния пептида на продукцию IL-4 наблюдалось усиление Кон А-индуцированной продукции как через 1ч., так и через 6 ч. после инъекции. На спонтанную продукцию IL-4 спленоцитами Р-эндорфин не влиял. о
Зависимость выраженности эффектов Р-эндорфина на количество АОК селезенки (А) и титр антител периферической крови (Б) мышей от временного отрезка между введением пептида и иммунизацией (п=10). Светлый столбец - контрольная группа (введение 0,9% раствора NaCl), темный столбец - введение Р-эндорфина 0,0005 мкг/кг. - р 0,05 по непарному t критерию Стьюдента по отношению к контрольной группе Кон А-индуцированную продукцию IL-2 пептид не модулировал как за 1 ч., так и за 6 ч. до получения спленоцитов, в то время как спонтанную продукцию за 1 ч. до введения пептид угнетал, а через 6 ч. после введения - стимулировал (рисунки 17, 18).
Помимо прямого эффекта на клетки иммунной системы, Р-эндорфин может влиять на их активность опосредованно через модуляцию продукции гормонов гипоталамо-гипофизарной оси, и в частности кортикостерона, продуцируемого клетками коры надпочечников. Нами было исследовано влияние различных доз Р-эндорфина на уровень кортикостерона у интактных мышей за 1 ч. (F=0,45; р=0,768) и за 6 ч. (F=l ,166; р=0,348) до выведения животных из эксперимента. Нами отмечено, что концентрация кортикостерона в плазме крови интактных мышей под воздействием Р-эндорфина не изменяется как в ранние, так и в поздние сроки, после введения пептида (рисунок 19), что, в свою очередь, свидетельствует об отсутствии опосредованности эффекта пептида через продукцию кортикостерона . По данным литературы известно, что наиболее выраженные эффекты на функции гипоталамо-гипофизарной оси Р-эндорфин оказывает в условиях стресса, угнетая секрецию кортикотропин-рилизинг-фактора (КРФ) в гипоталамусе через налок-сонзависимый механизм [190]. Кроме того, Р-эндорфин может оказывать прямое действие на кору надпочечников, и наличие или отсутствие эффекта будет зависеть от экспрессии того или иного типа рецептора [32].
Зависимость выраженности эффектов Р-эндорфина на системный иммунный ответ от времени его введения
В процессах иммунорегуляции участвует три класса эндогенных пептидов: нейропептиды (к которым относятся опиоидные пептиды), пептиды тимуса и пептиды костного мозга. Эндогенные опиоидные пептиды секрети-руются как в специфических тканях, так и на периферии, в том числе клетками иммунной системы. Вместе со своими рецепторами они образуют эндогенную опиоидную систему, которая играет важную роль в процессах адаптации и поддержании гомеостаза, особенно в стрессовых условиях [33].
Изучение регуляции процессов адаптации организма в условиях стресса является одним из актуальных направлений медико-биологических исследований на протяжении последних десятилетий. Регуляция работы иммунной системы гормонами коры надпочечников, адренергическими соединениями и эндогенной опиоидной системой зависит от природы воздействующего стрессора, силы и продолжительности стресса. С момента описания механизмов стресса ведущая роль в регуляции адаптивных процессов отводилась гормонам надпочечников и активации соответствующих рецепторов [10; 11; 22]. В результате свойства и влияние глюкокортикоидов и катехоламинов на характеристики иммунитета при стрессе изучено достаточно подробно [3; 20; 21; 22; 58; 60; 84; 98; 122; 145; 149; 184; 194; 202; 228; 230]. Вовлеченность эндогенных опиатов в формирование адаптации отмечена сравнительно недавно и изучена не столь подробно, как активность гормонов надпочечников.
К настоящему моменту охарактеризовано более двух десятков соединений с опиоидной активностью, влияющих на формирование разнообразных физиологических и патологических процессов в организме. Тем не менее ключевая роль в регуляции принадлежит Р-эндорфину, самому активному и полифункциональному представителю опиоидной системы. Значение других соединений, в частности энкефалинов, в формировании адаптации неоднозначно и многими учеными оспаривается [17; 26; 39; 195; 269]. В своей работе мы использовали рекомбинантный человеческий 3-эндорфин, так как показано, что аминокислотная последовательность 3-эндорфина высоко консервативна у разных видов млекопитающих. В частности, в работе Roberts et al. представлены данные, свидетельствующие о высокой гомологии Р-эндорфинов мыши, свиньи и человека [215].
В экспериментальной модели in vivo мы вводили Р-эндорфин в дозах 0,0005-100 мкг/кг. При выборе дозировок мы опирались прежде всего на литературные данные. Показано, что в состоянии покоя физиологическая концентрация Р-эндорфина в плазме циркулирующей крови составляет примерно 10" -10" М [51]. Различные по природе стрессоры способны увеличивать уровни Р-эндорфина в 2-10 раз [96]. Кроме того, выраженная биологическая активность Р-эндорфина в отношении клеток иммунной системы проявляется в диапазоне концентраций, близких к физиологическим. Так, показано, что в концентрациях 10 -10 М пептид активировал цитотоксическую активность NK-клеток [171]. В низких концентрациях (10 М) пептид выраженно модулировал пролиферативную активность [137; 86], продукцию провоспалитель-ных цитокинов IL-ip, IL-6 [47; 52; 53; 124] и активных форм кислорода [206; 243] различными популяциями клеток иммунной системы. Физиологической концентрации Р-эндорфина соответствуют используемые нами дозы 0,0005-0,01 мкг/кг.
Ранее в клинической практике были отмечены случаи успешного применения синтетического Р-эндорфина (1,5-6 мг) при терапии депрессивного состояния [2]. При пересчете на массу тела это составляет примерно 1-10 мкг/кг и также входит в диапазон исследуемых нами дозировок пептида.
Согласно литературным данным при попадании в кровоток Р-эндорфин быстро гидролизуется. Еще в 1998 г. Sandin J. с соавторами продемонстрировали, что скорость расщепления Р-эндорфина в периферической крови составляет 25 пмоль/мин. [229]. Также было установлено, что отщепление пяти С-концевых аминокислотных остатков сопровождается почти полной потерей активности пептида [13]. Однако возможность отложенного опосредо 83 ванного влияния Р-эндорфина на иммунитет ранее в литературе не рассматривалась.
Одним из этапов нашего исследования была оценка влияния (3-эндорфина на показатели иммунного ответа в зависимости от сроков его введения относительно момента иммунизации. Установлено, что Р-эндорфин оказывал стимулирующие эффекты на количество АОК в селезенке только при введении за час до попадания антигена, одномоментно с антигеном или через час после инициации иммунного ответа. При увеличении времени между введением Р-эндорфина и антигена все эффекты пептида нивелировались.
Таким образом, представленные выше данные об особенностях метаболизма Р-эндорфина и собственные результаты подтверждают, что Р-эндорфин в основном является молекулой короткодистантного действия и способен оказывать кратковременные биологические эффекты. Согласно этому в наших экспериментах в системе in vivo временной интервал между введением пептида и иммунизацией животных составил 1 ч.
Как уже неоднократно упоминалось выше, Р-эндорфин - это олигопеп-тид, который способен связываться одновременно с несколькими типами опиатных рецепторов, при этом аффинность связывания уменьшается в ряду ц,— 8 — к [201]. Для того чтобы оценить, какой тип опиатных рецепторов является доминирующим в реализации эффектов Р-эндорфина на исследуемые показатели, мы использовали два экспериментальных подхода: 1) сопоставление эффектов Р-эндорфина с эффектами синтетических агонистов пептидной природы, селективно взаимодействующими с тем или иным типом опиатных рецепторов; 2) фармакологическая блокада разных типов опиатных рецепторов соответствующими антагонистами.
В результате было показано, что Р-эндорфин, DAGO и DADLE оказывали выраженное стимулирующее влияние на количество антителобразую-щих клеток в селезенке при индукции генерализованного иммунного ответа. Тем не менее механизмы участия опиоидных пептидов значительно отличались. В условиях системной иммунизации Р-эндорфин и селективный fl-агонист DAGO усиливали интенсивность антителогенеза в селезенке как в индуктивный период иммунного ответа, так и в эффекторную фазу. DADLE, селективный 8-агонист, продемонстрировал статистически значимый эффект на исследуемые параметры только в том случае, если вводился на 4-е сутки от момента индукции иммунного ответа, то есть в его эффекторную фазу. При этом эффект DAGO был выражен сильнее, чем DADLE.
В ряде работ, посвященных оценке влияния Р-эндорфина на антитело-генез, отмечается ингибирующее влияние пептида на количество антитело-образующих клеток и продукцию антител [27; 59; 119]. В статье A.W. Kusnecov с соавторами представлены данные, свидетельствующие о стимуляции продукции IgG в селезенке при иммунизации крыс гемоциани-ном улитки [151]. Большинство исследователей также отмечают позитивное влияние Р-эндорфина на регуляцию локального воспаления. Так, было показано, что Р-эндорфин секретируется локально тканевыми макрофагами и лимфоцитами [64; 162]. Снижение концентрации Р-эндорфина или блокада опиатных рецепторов в очаге воспаления усиливает отек лапы у крыс, вызванный введением суспензии пивных дрожжей [223]. Другим коллективом ученых было отмечено снижение количества CD4+ клеток, секретирующих Р-эндорфин, в воспаленной лапе под действием циклоспорина А. Авторы связывают с этим снижение общей концентрации Р-эндорфина в зоне воспаления и, соответственно, повышение болевой чувствительности у животных [120].
При блокаде опиатных рецепторов антагонистами различной селективности нами было показано, что во время индукции генерализованного иммунного ответа ключевая роль в регуляции исследуемых иммунных процессов принадлежит 8-опиатым рецепторам. Следует отметить, что данное явление характерно только для индуктивной фазы иммунного ответа. В продуктивную фазу блокада опиатных рецепторов налоксоном или налтридолом не влияла на выраженность стимулирующих эффектов Р-эндорфина, что свидетельствует о важной роли неопиоидных механизмов в регуляции иммунного ответа на более поздних стадиях его развития.
Полученные различия мы связываем, главным образом, с динамикой экспрессии опиатных рецепторов на клетках иммунной системы при формировании и дальнейшем развитии иммунного ответа. Согласно многочисленным литературным источникам на клетках иммунной системы присутствуют все три типа опиатных рецепторов - fi, 8, к [27]. В то же время опиатные рецепторы распределены на клетках неравномерно, а их качественное и количественное соотношение зависит от стадии иммунного ответа [14]. В 1994 г. К.В. Дубинин с соавторами показали, что во время развития первичного иммунного ответа степень связывания налоксона, меченого тритием, возрастала в 6 раз, при вторичном же иммунном ответе этот показатель увеличивался только в 1,5 раза. Однако исходная величина связывания препарата при вторичном иммунном ответе была почти в 6 раз выше, чем при первичном [14]. Авторы отметили, что с 0-го по 7-й день первичного и с 0-го по 5-й день вторичного иммунного ответа возрастала экспрессия к-рецепторов и снижалась экспрессия S-, jLi-рецепторов, а затем происходил обратный процесс [14].
Спектр взаимодействия налоксона до сих пор остается важным вопросом. Ряд авторов отмечает наибольшее сродство налоксона именно с д-опиатным рецептором [35; 224]. Другие же считают, что налоксон в равной степени блокирует Li- и 8-рецепторы [153]. В нашей работе мы придерживаемся мнения о перекрываемости сайтов взаимодействия налоксона и 3-эндорфина [16]. Оба вещества чаще связываются с fi-рецепторами, но способны взаимодействовать также с 8-опиатными рецепторами.
![Роль [B]-эндорфина в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы](/i/i/4239/406786.png "Роль [B]-эндорфина в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы Гейн Сергей Владимирович")