Введение к работе
Актуальность проблемы. Для оптимального обеспечения газотранспортной функции эритроциты млекопитающих приобрели в процессе эволюции ряд характерных морфологических особенностей. Отсутствие ядра, рибосом и митохондрий позволяет заполнить весь внутриклеточный объем гемоглобином и максимально увеличить количество молекул кислорода, транспортируемых одним эритроцитом. Процессы газообмена между кровью и тканями осуществляются в микроциркуля-торном русле во время прохождения эритроцитов через кровеносные капилляры. Средний диаметр эритроцитов (»7,55 мкм) вдвое превышает диаметр самых мелких капилляров (»3 мкм), поэтому при прохождении через кровеносные капилляры происходит сдвиговая деформация эритроцитов, при которой меняются линейные размеры и форма клеток, но остается постоянной площадь поверхности мембраны /Evans , Skalak, 1980/. Деформация эритроцитов осуществляется за счёт сил напряжения сдвига со стороны смещающихся слоев плазмы крови. После прекращения воздействия деформирующей силы эритроциты восстанавливают прежние размеры и форму за счет энергии, запасенной в процессе деформации, то есть им присущи свойства упругого твёрдого тела.
Таким образом, способность эритроцитов к деформации является непременным условием их прохождения через микроциркуляторное русло, а это во многом определяет выполнение кровью одной из основных её функций - газотранспортной.
Свойства мембран эритроцитов при деформациях, по аналогии с упругим твёрдым телом, определяются молекулярной организацией мембраны и физико-химическими свойствами образующих её молекул. Способность эритроцитов к деформации получила название деформа-бильность (deformability). Следует различать понятия деформабиль-ность эритроцита в целом и деформабильность мембраны эритроцита. Мембрана эритроцита также обладает свойствами упругого твёрдого тела Поведение мембраны эритроцита при действии деформирующей силы как упругого твёрдого тела определяется ее молекулярной орга-
низацией и физико-химическими свойствами структурных молекул. Мембрана эритроцита представляет из себя композитную структуру, основой которой служит липидный матрикс, формируемый молекулами фосфолипидов, который пронизывают молекулы интегральных белков (полосы 3 и гликофоринов). На цитоплазматической поверхности ли-пидного бислоя локализована прочная эластичная сеть, образуемая молекулами белков цитоскелета. Липидный бислой и белковая сеть цитоскелета вносят индивидуальный вклад в упругое поведение мембран эритроцитов при их деформациях /Waugh е.а., 1995/.
Особая роль в обеспечении упругих способностей при сдвиговой деформации и поддержании формы дискоцита приписывается белковому цитоскелету мембран эритроцитов, формирование которого должно быть завершено к моменту выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь/С.А. Сторожок, 1995/.
Роль цитоскелета в регуляции выхода молодых эритроцитов из костного мозга и селезенки в циркулирующую кровь мало исследована. По-прежнему в литературе большое значение при описании механизма выхода ретикулоцитов из костного мозга и селезенки придается "липкости" их мембран /Jandl, 1960; В.И Филимонов, Ю.М Захаров, 1974/. Во многом не исследована роль, которую играет эволюция вязко-эластических свойств мембран ретикулоцитов в процессах поступления молодых эритроцитов в кровь. Это связано с недостаточной разработанностью технических подходов для оценки в эксперименте вклада отдельных компонентов цитоскелета в обеспечение деформабильности ретикулоцитов- эритроцитов.
Подходы, исследующие количественные стороны эритроцитарного баланса, исходят лишь из скорости созревания ретикулоцитов периферической крови in vitro /Е.Н. Мосягина и соав., 1976/, и не учитывают взаимоотношений между процессами формирования цитоскелета этих клеток и их прохождением через стенки синусоидов костного мозга в кровь. В результате наши представления о влиянии эволюции формирования цитоскелета эритроидных клеток на кинетику последних остаются далеко неполными.
Исследования последних лет позволяют говорить о наличии регуляторного контроля за функциональным состоянием белкового цито-
скелета и, соответственно, способности эритроцитов к деформации /Bennett, 1990/. Особое внимание уделяется изучению генетических аномалий белков цитоскелета мембран эритроцитов, наличие которых ставится в причинную связь с повышенным разрушением эритроцитов и развитием анемии у человека /Palek, Sahr, 1992/.
Показана также роль дефектов цитоскелета эритроцитов в патогенезе гипертонической болезни, проявляющаяся в снижении дефор-мабильности эритроцитов вследствие увеличения кальмодулин зависимого связывания Са2+ с цитоскелетом /Bennett е.а., 1988; Gardner, Bennett, 1988/. Поэтому исследования молекулярної! структуры белкового цитоскелета эритроцитов и особенностей его формирования на различных этапах дифференцирования эритроидных клеток, изучение взаимоотношений между белковым цитоскелетом и механизмами регуляции системы эритрона несомненно имеет важное теоретическое и прикладное значение.
Особо значимо при проведении исследований подобного рода объективно оценить способность эритроцитов к упругой деформации. Одним из методов, отвечающих этому требованию, является компьютерная эктацитометрля /Bessis е.а., 1981/. Использование эктацитомет-рии в клинической гематологической практике создало новые возможности для успешной дифференциальной диагностики анемий, вызванных нарушениями мембран или цитоскелета эритроцитов /Bessis е.а., 1981; Mohandas е.а., 1981; Kuypers е.а., 1990; Nash е.а., 1990; Johnson е.а., 1994; Johnson, Ravidranath, 1996; Baskurt, Meiselman, 1996/.
Однако, в настоящее время в России отсутствует отечественная серийная модель эктацитометра, что в значительной мере ограничивает возможность проведения российскими учёными исследований по изучению вязко-упругих свойств цитоскелета эритроцитов и их влияние на реологические свойства клеток крови. Поэтому разработка и создание отечественной модели эктацитометра с компьютерной обработкой полученной информации, отработка технологии эктацитометри-ческих исследований вязко-эластических свойств эритроцитов при физиологическом и стимулированном эритропоэзе, внедрение эктацито-метрии в практику научно-исследовательских и клинических лаборато-
рий России, безусловно является актуальной проблемой как для практической, так и теоретической медицины.
Цель работы: Выяснить роль белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток в регуляции системы эритрона в условиях нормального и напряженного эритропоэза.
Задачи исследования:
1. Разработка и создание отечественной лабораторной установки
для оценки деформабильности эритроцитов методом эктацитометрии.
Написание и отладка программного обеспечения для компьютерной об
работки результатов эктацитометрического анализа деформабильности
эритроцитов. Отработка технологии проведения эктацитометрических
исследований;
-
Исследовать деформабильность эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях нормального эритропоэза;
-
Исследовать деформабильность эритроцитов "молодой" и "старой" популяций эктацитометрическим методом в условиях напряжённого эритропоэза;
-
Разработать технологию специфической блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток моноспецифическими кроличьими антителами к спектрину;
-
Исследовать изменения в системе красной крови в условиях длительной блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток антителами к спектрину;
-
Исследовать способность системы эритрона отвечать на острую кровопотерю на фоне блокады белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток антителами к спектрину.
Научная новизна. Впервые показано, что деформабильность ретикулоцитов является фактором, определяющим момент их выхода из костного мозга в кровь. Способность ретикулоцитов к деформации зависит от степени завершенности формирования функционально полноценной структуры белкового цитоскелета.
Скорость выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь прямо-пропорционально зависит от их количества в костном мозге и значения константы выхода, величина которой определяется деформабильностью ретикулоцитов и размерами пор в стенках синусоидных капилляров костного мозга.
Изменения скорости выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь могут привести к нарушению эритроцигарного баланса при отсутствии изменений интенсивности продукции ретикулоцитов костным мозгом и интенсивности гемолиза эритроцитов.
Выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях нормального эритропоэза регулируется механизмом, который обеспечивает селекцию ретикулоцитов по их способности к упругой деформации. В условиях напряженного эритропоэза возможна блокада этого механизма отбора ретикулоцитов. В результате в циркуляцию поступают рети-кулоциты ранней степени зрелости, в которых незавершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета, вследствие этого они обладают низкой деформабильностью.
Блокада белкового цитоскелета мембран эритроидных клеток у крыс антителами к спектрину препятствует включению механизмов, обеспечивающих компенсаторные реакции системы красной крови в ответ на острую кровопотерю.
Впервые в России создана лабораторная установка, позволяющая исследовать деформабильность эритроцитов методом лазерной дифрак-тометрии (эктацитометрии) с непосредственным вводом информации в компьютер.
Создано оригинальное программное обеспечение для обработки результатов эктацитометрических исследований. Отработана технология эктацитометрических измерений.
Научно-практическая значимость работы. На основе результатов настоящей работы разработаны и научно обоснованы:
новые представления о механизмах выхода ретикулоцитов из костного мозга в кровь, о значимости процессов формирования цитоскелета эритроидных клеток на кинетику последних.;
математическая модель, описывающая скорость поступления рети-кулоцитов в кровеносное русло;
экспериментальная модель эффективной блокады белкового цито-скелета мембран эритроидных клеток с помощью липосом, загруженных антителами к спектрину;
лабораторная эктацитометрическая установка, которая может служить основой для создания серийного промышленного образца отечественной модели эктацитометра;
технология исследований деформабильности эритроцитов с помощью эктацитометра, которая может быть использована для разработки методических рекомендаций по исследованию реологических свойств крови методом эктацитометрии в практической гематологии
-
Способность ретикулоцитов к деформации зависит от степени завершенности формирования функционально-полноценной структуры белкового цитоскелета;
-
Деформабильность ретикулоцитов является фактором, определяющим момент их выхода из костного мозга в кровь;
-
Снижение деформабильности эритроцитов молодой популяции в периферической крови через четыре часа после острой крово-потери обусловлено поступлением в циркуляцию из костного мозга ретикулоцитов ранней степени зрелости, в которых, не завершены процессы формирования структуры белкового цитоскелета;
-
В условиях напряженного эритропоэза возможна блокада механизма, который регулирует выход ретикулоцитов из костного мозга в кровь в условиях физиологического эритропоэза, селектируя их по способности к упругой деформации.;
-
Нарушения эритроцитарного баланса могут возникать вследствие изменения скорости выхода ретикулоцитов из костного мозга в
кровь при отсутствии изменений интенсивности продукции рети-кулоцитов костным мозгом и интенсивности гемолиза эритроцитов;
-
Компьютерная эктацитометрия является объективным методом исследования деформабильности эритроцитов, обеспечивающим высокую степень автоматизации измерений.
-
Внутрибрюшинное введение крысам липосом, загруженных антителами к спектрину, позволяет эффективно блокировать белковый цитоскелет мембран эритроидных клеток.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на пленуме правления научного общества гематологов и трансфузпологов "Проблемы регуляции гемопоэза в норме и патологии", г. Майкоп, 1989; на межрегиональном семинаре "Современные проблемы гематологии", Челябинск, 1989; на конференциях: "Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области", Тюмень, 1993; "Актуальные проблемы фармации", Тюмень, 1994; "Медицина и охрана здоровья", Тюмень, 1995, 1996; на Всероссийском симпозиуме "Кроветворение и физиологические функции иммунной системы организма" , Санкт-Петербург, 1995; на II Международном, симпозиуме "Патология эритрона и метаболизма железа", Рязань, 1995; на IY Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1997.
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликована 21 печатная работа (1 монография, 7 статей, 13 тезисов докладов).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 235 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 58 рисунками. Библиографический указатель включает 352 работы отечественных и зарубежных авторов.
