Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы . 21
1.1. Этиологические факторы хронической крапивницы 21
1.2. Патогенетические механизмы хронической крапивницы . 24
1.2.1. Патогенетические механизмы хронической аутоимммунной крапивницы . 27
1.3. Иммунные нарушения у больных хронической крапивницей . 30
1.3.1. Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице 34
1.4. Применение тестов in vitro для изучения иммунологических нарушений. 38
1.5. Лечение больных хронической аутоиммунной крапивницей 42
Глава 2. Применение теста ex vivo для оценки цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных хронической аутоиммунной крапивницей 43
2.1. Оценка спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей 43
2.2. Влияние препарата «Г абриглобин-Ig G» на цитокин - продуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте еx vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей 47
2.2.1. Результаты отработки диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo на клетках иммунной системы здоровых людей 47
2.2.2. Показатели продукции цитокинов клетками иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей 49 CLASS Глава 3. Характеристика иммунного статуса у больных хронической аутоиммунной крапивницей 52 CLASS
3.1. Характеристика основных иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей 52
3.2. Характеристика уровня цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей 56
Глава 4. Сравнительная характеристика иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей 59
Глава 5. Характеристика иммунологических параметров у больных хронической аутоиммунной крапивницей после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG» 65
5.1. Характеристика спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» 65
5.2. Характеристика цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы под действием препарата «Габриглобин-IgG» в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения... 71
5.3. Оценка иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» 74
5.4. Критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей на
лечение препаратом «Габриглобин-IgG» 80
Заключение 93
Список сокращений 110
Список литературы . 111
- Патогенетические механизмы хронической крапивницы
- Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице
- Влияние препарата «Г абриглобин-Ig G» на цитокин - продуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте еx vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей
- Характеристика уровня цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В современной аллергологии крапивница представляет серьезную проблему и по распространенности занимает третье место после аллергического ринита и бронхиальной астмы (Себекина О.В., 2011; Скороходкина О.В., Ключарова А.Р., 2013). Хронические формы крапивницы значительно снижают качество жизни пациентов ввиду косметических проблем, интенсивного зуда, нарушения сна, ухудшения психоэмоционального состояния и трудоспособности (Горячкина Л.А, Кашкин К.П., 2009; Петров В.И. и соавт., 2010). Ранее считалось, что хроническая крапивница (ХК) в 80-95% случаев является идиопатической (Феденко Е.С., 2002; Горячкина Л.А., Борзова Е.Ю., 2004). Однако в связи с многочисленными исследованиями в данной области процент хронической идиопатической крапивницы (ХИК) заметно сократился и составляет 55%, и около 45% в структуре ХК составляет хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК) (Goh C.L., Tan K.T., 2009). Наиболее тяжелой формой ХК является ХАК. Ввиду сложности и малой изученности иммунных механизмов в патогенезе ХАК, терапевтическая тактика лечения таких пациентов является малоэффективной.
Известно, что в основе патогенетических механизмов ХАК лежит образование аутоантител к высокоафинному IgE рецептору и молекуле IgE, которые способны стимулировать выброс медиаторов из базофилов и тучных клеток, результатом чего является развитие уртикарной реакции (Kaplan A.P., Greaves M., 2009). Однако причина образования аутоантител у больных ХАК на сегодняшний день остается неизвестной. Также отмечено, что при ХАК развиваются различные дефекты иммунной системы, которые могут выражаться в гиперактивации Т- и В-систем иммунитета, активации систем свертывания крови, компонентов комплемента, дисбалансе системы цитокинов (Santos J.C. et al., 2008; Soruri A. et al., 2008; Abd El-Azim М., Abd El-Azim S., 2011; Cugno M. et al., 2012). Доказано, что ключевую роль в патогенезе ХАК играют ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN (Баранова Н.И. и соавт., 2012; Ying S. et al., 2002; Jin C.Y. et al., 2008; Samia A.I. et al., 2009). Однако немногочисленные данные по этому вопросу являются противоречивыми и не дают полного представления о цитокиновой регуляции при ХАК, в связи с чем, изучение иммунологических механизмов с участием цитокинов при данной патологии является особенно актуальным.
В последнее время одним из перспективных методов изучения цитокинов является исследование их продукции клетками иммунной системы в тестах ex vivo. Данные тесты создают своего рода модельные системы, наиболее приближенные к реальным условиям, исследовать которые можно вне организма. Кроме того, они позволяют дать оценку не только резервным возможностям клеток иммунной системы к продукции цитокинов, но и использовать их для изучения влияния фармакологических препаратов, с целью назначения терапии больным (Рыжикова С.Л. и соавт., 2011).
Одним из наиболее эффективных методов в лечении больных ХАК является применение внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ). В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва) был разработан ВВИГ четвертого поколения – препарат «Габриглобин-IgG», высокая эффективность которого была доказана в ряде работ (Больц Е.А., 2012; Молотилов Б.А. и соавт., 2013). Однако механизмы действия данного препарата при ХАК до сих пор остаются малоизученными. Также, несмотря на большой процент пациентов с хорошими результатами от терапии, сохраняется процент с неудовлетворительными результатами. В связи с вышеизложенным для оптимизации терапии актуальным является разработка иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG».
Степень разработанности темы исследования
ХАК была открыта в 1993 году M.Greaves и M.Hide (Hide M. et al., 1993). В работе Sabroe R. и соавторов было показано, что в основе патогенеза данной формы ХК лежит образование аутоантител против высокоафинного IgE-рецептора и молекулы IgE (Sabroe R. et al., 1998). Однако до сих пор причина их образования остается неясной. Большой вклад в изучение патогенетических механизмов ХАК внесли зарубежные ученые. Так, Boguniewicz M., Cugno M. доказали роль активации коагуляционного каскада (Boguniewicz M., 2008; Cugno M. et al., 2009). Kasperska-Zajac A. и соавторы изучали роль гормональных нарушений в патогенезе данного заболевания (Kasperska-Zajac A. et al., 2008). Santos J.C. и соавторы исследовали цитокиновую регуляцию и роль хемокинов (Santos J.C., Azor M.H. et al., 2008; Santos J.C., De Brito C.A. et al., 2012). Кроме того, известны работы Caproni M. и соавторов, которые также изучали нарушения цитокиновой регуляции и иммунных клеток при ХК и ХАК (Caproni M., Volpi W. et al., 2003; Caproni M., Giomi B. et al., 2005; Caproni M., Giomi B., Melani L. et al., 2006). Известен ряд ученых, включая Samia A.I., Tedeschi A., Ying S., работы которых посвящены изучению цитокинов у больных с данной патологией (Ying S. et al., 2002; Tedeschi A. et al., 2007; Samia A.I., Naglaa A.K., 2009). Однако до сих пор нет единого мнения о цитокиновой регуляции при ХАК.
Из отечественных ученых, которые занимаются проблемой ХАК, известны Борзова Е.Ю., Гервазиева В.Б., Груздева М.С. Голубчикова Р.Н., Горячкина Л.А., Данилычева И.В., Калимолдаева С.Б., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Сигбатуллина Н.А. и другие. Однако работы данных авторов посвящены, в основном, проблеме диагностики и лечения, а также исследованию отдельных немногочисленных иммунологических параметров.
При этом остаются малоизученными вопросы, связанные с иммунными нарушениями у больных ХАК. Кроме того, до сих пор не было проведено комплексной оценки показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента и цитокинов. В перечисленных выше работах по изучению цитокинов при ХАК, исследования проводились в сыворотке крови, и до сих пор не было проведено изучения спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками иммунной системы. Исследование цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с данной патологией является новым направлением в изучении патогенеза ХАК.
Цель исследования
Оценить цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы и определить ее роль в оптимизации лечения.
Задачи исследования:
1. Оценить выработку ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей.
2. Отработать диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых доноров.
3. Определить влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на показатели выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей.
4. Провести сравнительную оценку иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей.
5. Дать оценку влияния лечения препаратом «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы, а также иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей.
6. На основе показателей продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo разработать критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG».
Научная новизна
Впервые проведена оценка продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте методом ex vivo у больных ХАК.
Подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК.
Впервые изучено влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками в тесте ex vivo у больных ХАК.
Проведена комплексная сравнительная оценка показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показателей ключевых цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК и ХИК.
Выявлено влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных ХАК, а также показатели иммунитета.
Разработаны иммунологические критерии отбора больных ХАК к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG».
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты, полученные при изучении иммунологических показателей и цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы больных ХАК, а также влияния на них препарата «Габриглобин-IgG», будут способствовать пониманию иммунологических механизмов в патогенезе ХАК и механизмов действия данного препарата.
Различия в основных иммунологических параметрах между больными ХАК и ХИК могут указывать на различие патогенетических механизмов данных форм ХК.
Установлено, что тест ex vivo дает более полную информацию о цитокиновой продукции, в связи с чем изучение уровня цитокинов у больных ХАК целесообразнее проводить в супернатанте клеток, а не в сыворотке крови.
Определены диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК.
На основании данных по продукции ключевых цитокинов, полученных в тесте ex vivo, разработаны критерии отбора больных ХАК, которым целесообразно назначать терапию препаратом внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG».
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стала цитокин-продуцирующая способность клеток иммунной системы и основные иммунологические показатели у больных ХАК, а также их изменения после лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная литература, посвященная проблеме ХАК, была проанализирована формально-логическими методами исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлась венозная кровь больных ХАК.
Проведено клиническое, открытое, проспективное, рандомизированное исследование. Критериями включения пациентов в исследование явились: наличие аутоиммунной формы хронической крапивницы, возраст 18-60 лет, информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: острая крапивница, психические заболевания, туберкулез любой локализации в активной фазе, онкологические заболевания, беременность и период лактации.
Положения, выносимые на защиту:
-
Хроническая аутоиммунная крапивница протекает с преобладанием аутоиммунного механизма заболевания. Спектр иммунологических нарушений характеризуется повышением продукции ИЛ-4, ИЛ-17 и IFN клетками иммунной системы в тесте ex vivo, а также уровней CD4+ популяции лимфоцитов, общего IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, и снижением продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы, снижением уровней CD8+ популяции лимфоцитов и ИЛ-4 в сыворотке крови.
-
Диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG», отработанные на клетках иммунной системы здоровых доноров в тесте ex vivo, составляют для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFN – 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. Показано повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFN клетками под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК.
-
Динамика иммунологических показателей у больных ХАК после проведения терапии препаратом «Габриглобин-IgG» характеризуется повышением продукции клетками иммунной системы ИЛ-10 и снижением продукции ИЛ-17 и IFN в тесте ex vivo, повышением уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также нормализацией соотношения CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов и показателей антител к нативной ДНК.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты настоящего исследования являются достоверными, так как был проведен достаточный объем исследований с использованием адекватных и современных методологических подходов. Обработка данных проводилась при помощи специализированных компьютерных программ, которые позволяют проводить статистический анализ больших массивов данных.
Диссертация обсуждена и одобрена на заседании межкафедральной комиссии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (протокол № 16 от 25 декабря 2013 г.).
Материалы диссертационной работы доложены на XVI Межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (Пенза, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Саранск, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); On-line конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (2013); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2013).
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из которых 8 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций.
Патогенетические механизмы хронической крапивницы
На сегодняшний день патогенез ХК сложен и недостаточно изучен. Однако каковым бы не был этиологический фактор, вызывающий ХК, ключевую роль в патогенезе различных форм данного заболевания играют тучные клетки и базофилы [54,85].
Известно, что при ХК тучные клетки обладают повышенной способностью к дегрануляции. При активации тучных клеток происходит выброс в межклеточную жидкость множества медиаторов, важнейшим из которых является гистамин [18,124]. Гистамин способен воздействовать на Н1 и Н2 рецепторы клеток кожи, вызывая увеличение локального кровотока в коже, дилатацию артериол, экссудацию плазмы из посткапиллярных венул, что приводит к формированию гиперемии, отека, зуда и волдыря [18,58]. Также показано, что гистамин активируют периферические окончания чувствительных С-волокон кожи, которые секретируют нейропептиды [45]. Нейропептиды (вещество Р и кальцитонин ген - связанный пептид) вызывают вазодилатацию и повышение сосудистой проницаемости. Кроме этого, нейропептиды (в большей степени, вещество Р) стимулируют мембран-ассоциированные G-белки тучных клеток, что приводит к высвобождению гистамина и других медиаторов [179].
Секреторные гранулы тучных клеток помимо гистамина содержат нейтральные протеазы: триптаза, химаза, карбоксипептидаза, катепсин Нейтральные протеазы способствуют повышению проницаемости сосудов кожи и аккумуляции клеток воспаления – нейтрофилов и эозинофилов [108,157]. Эозинофилы в свою очередь являются основным источником тканевого фактора, который способствует запуску коагуляционного каскада и синтезу тромбина. Тромбин вызывает увеличение проницаемости сосудов и активирует тучные клетки, вызывая их дегрануляцию [146]. Также при активации в тучных клетках синтезируются эйкозаноиды, которые обладают мощной провоспалительной активностью [174]. Так, простогландин D2 вызывает вазодилатацию и потенциирует действие гистамина и других медиаторов, повышающих сосудистую проницаемость, усиливает зуд, вызываемый гистамином и другими медиаторами, а также является хемоаттрактантом нейтрофилов [156]. Лейкотриены С4, D4 и Е4 увеличивают сосудистую проницаемость, вызывают локальное сужение артериол с последующей вазодилатацией и повышением проницаемости венул [149]. Кроме того, тучные клетки являются источником различных цитокинов. В секреторных гранулах тучных клеток хранятся в преформированном виде фактор некроза опухолей (ФНО-) и интерлейкины-3, 4, 5, 6 и 13 [94]. Активация тучных клеток может происходить по иммуннологическому и неиммуннологическому механизму [38,82]. Иммунологическая активация возникает при аллергической крапивнице, обусловленной специфической гиперреактивностью, когда комплекс аллерген-IgE-антитело связывается с IgE-рецепторами на поверхности тучной клетки, способствуя проявлению аллергической реакции 1 типа. Такая активация характерна также для ХК, вызванной употреблением пищевых добавок, лекарственных препаратов и консервантов. Кроме того, иммунологическую активацию вызывают иммунные комплексы, содержащие IgE или другие типы иммуноглобулинов, а также аутоантитела к IgE или –цепи его высокоафинного рецептора [19]. Взаимодействие аллергена с молекулой IgE или ее рецептором является основным иммунным механизмом активации тучной клетки и лежит в основе возникновения острой крапивницы, но редко является причиной возникновения ХК [154]. Исследования последних лет показали, что ХК, в патогенезе которой лежал механизм образования аутоантител к IgE или к рецептору IgE относили к ХАК [118]. У некоторых пациентов с ХК присутствуют IgG антитела против низкоафинного IgE рецептора на эозинофилах (CD23). Взаимодействие этих антител с рецептором CD23 способствует активации эозинофилов и вызывает высвобождение эозинофильного катионный белка, который приводит к дегрануляции тучных клеток и выбросу гистамина [78]. Так, известно, что при иммунной активации тучных клеток возникает «ранняя фаза» воспалительного ответа, которая приводит к немедленному высвобождению медиаторов тучных клеток и «поздняя фаза» воспалительного ответа, которая возникает через несколько часов и способствует привлечению различных клеток воспаления, включая эозинофилы, нейтрофилы, базофилы и СD4+ Т-клетки [58,133]. Формирование поздней фазы воспалительной реакции обусловлено действием цитокинов, продуцируемых тучными клетками и приводит к привлечению вторичных эффекторных клеток воспаления, например, нейтрофилов (ФНО-, ИЛ-1,8), эозинофилов (ИЛ-4, 5) и других [157]. Вторичные клетки воспаления, в свою очередь, продуцируют различные цитокины, обусловливающие дополнительное привлечение лейкоцитов.
Неиммуннологическая активация тучных клеток возможна под действием ряда нейропептидов (субстанция Р, вазоактивный интестинальный полипептид, пептид, кальцитонин-связанный пептид, нейрокинин), гормонов (эстрогены, АКТГ, гастрин), фактора активации тромбоцитов, фрагментов комплемента (С3а и С5а), вещества 48/80, морфина, кадеина и других веществ [118,177]. Отмечено, что при вирусных инфекциях происходит активация системы комплемента с образованием анафилотоксина С5а, который способствует активации тучных клеток и развитию уртикарной реакции [161]. Гормональные нарушения могут вызывать активацию комплемента и запуск каскада воспалительных реакций [126,160], а также активацию тучных клеток через Gq/11 белки [145]. В последние годы была показана патогенетическая значимость нейрогенного воспаления при ХК с участием нейропептидов. Этот механизм лежит в основе развития нейрогенной крапивницы [44]. Основным нейропептидом, который способствует усилению секреции, отеку и вазодилатации в коже, признается субстанция Р. Высвобождаясь из окончаний сенсорных нервов, субстанция Р взаимодействует с тучными клетками и запускается цепочка физиологических реакций, результатом которых является дегрануляция тучных клеток с выбросом медиаторов: кининов, простагландинов, серотонина и гистамина. Эти вещества могут оказывать влияние на изменение тонуса и проницаемости микрососудов, развитие болевой реакции, а также миграцию лейкоцитов. Имеются факты взаимной связи аллергического и нейрогенного воспаления. В свою очередь существует и обратная связь: чувствительные нервные окончания способны активироваться под влиянием медиаторов воспаления, таких как брадикинин, гистамин, фактора активации тромбоцитов, простагландинов, создавая, таким образом, порочный круг, усиливая и распространяя первоначальное воспаление [138]. При неиммунной активации происходит дегрануляция тучных клеток с высвобождением преформированных медиаторов, но без синтеза эйкозаноидов и цитокинов и, соответственно, поздней фазы воспалительного ответа [50]. Таким образом, тучные клетки и их активация играют ключевую роль в развитии ХК. В настоящее время лечение крапивницы остается сложной проблемой и поэтому изучение патогенетических механизмов ХК представляется очень важным.
Нарушения цитокиновой регуляции при хронической крапивнице
Известно, что немаловажную роль в патогенезе ХК играют цитокины. Цитокины содержат в себе большое количество эндогенных биологически активных соединений, которые участвуют в иммунной регуляции и процессах воспаления. Поэтому, изучение цитокинов при ХК актуально в настоящее время и может открыть новые возможности в понимании патогенеза данного заболевания [21,94].
Известно, что при нейрогенной крапивнице, происходит выброс нейропептидов, особый интерес среди которых вызывает вещество Р. Есть работы, указывающие на взаимосвязь уровня субстанции Р с провоспалительными цитокинами TNF-, ИЛ-1-, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12 [100]. Авторами показано, что субстанция Р индуцирует выработку данных цитокинов, которые участвуют в нейроиммунорегуляции. Также есть исследования, касающиеся роли SP – рецептора, который экспрессирован на всех клетках иммунной системы и является мощным модулятором нейроиммунорегуляции [135]. Было показано, что SP специфически активирует транскрипционный фактор (в частности, NF-kB), который включается в контроль цитокиновой экспрессии и стимулирует моноциты и макрофаги к продукции воспалительных цитокинов, включая ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и TNF-. Накапливающиеся в коже под влиянием хемоаттрактантов (LtB4, ИЛ-5, и ИЛ-8, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор – RANTES) лимфоциты, эозинофилы, нейтрофилы секретируют фактор, высвобождающий гистамин из тучных клеток. Эозинофилы являются источником эозинофильного катионного белка, вызывающего появление в коже волдырей и гиперемии. При хроническом течении заболевания наблюдаются периваскулярные инфильтраты, состоящие из Т-лимфоцитов, моноцитов, тучных клеток, эозинофилов и нейтрофилов [60].
Патогенез семейного холодового аутовоспалительного синдрома связывают с изменениями белка криопина (из-за мутации гена CIAS1), который активирует каспазу 1, что приводит к высвобождению ИЛ-1 и секреции воспалительных цитокинов ИЛ-6, TNF-, ИЛ-3 [64]. Есть единичные публикации, касающиеся роли других посредников (в частности, PGD2, лейкотриена Е4, хемотаксических факторов, фактора активации тромбоцитов, TNF-) в возникновении холодовой крапивницы [167]. Высокая терапевтическая эффективность антагониста рецептора ИЛ-1 – препарата Анакинра в предотвращении синдромов ХК, подтверждает тот факт, что ИЛ-1 играет центральную роль при этом заболевании [120].
При сравнительном изучении провоспалительных цитокинов TNF-, ИЛ-1, ИЛ-12р70 и ИЛ-6 у пациентов ХИК и ХАК было выявлено их достоверное повышение в группе пациентов с ХИК. У больных ХАК были выявлено повышение продукции Т-клетками регуляторных цитокинов ИЛ-17 и ИЛ-10. Противоположные данные были получены у больных с ХИК, где изучаемые показатели были снижены [165]. Немаловажную роль в развитии ХК играют цитокины ИЛ-15 и ИЛ-21. Huilan Z. и соавторы в своем исследовании показали, что у больных ХК наблюдалось снижение уровня данных цитокинов, а у пациентов с положительной пробой с аутосывороткой, напротив уровень ИЛ-21 был более высоким по сравнению со здоровыми людьми. Известно, что ИЛ-21, который продуцируется Th17-клетками, усиливает пролифирацию CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов, увеличивает активность NK клеток, а также подавляет синтез IgE. А ИЛ-15 вызывает продукцию ИЛ-5 Th2-клетками. Авторы, предположили, что Th17-популяция лимфоцитов и цитокины ИЛ-21 и ИЛ-15 играют ключевую роль в патогенезе ХАК [121]. Есть исследования, показывающие, что хронически высокие уровни IFN- и IFN- могут приводить к образованию аутоантигенов и развитию аутоиммунного заболевания [169]. Этот процесс может быть как следствием генетической предрасположенности, так и результатом влияния специфических агентов (вирусов, бактерий, факторов окружающей среды). Есть сообщения о том, что назначение в терапии IFN- и IFN- может приводить к обострению различных аутоиммунных заболеваний или запускать развитие различных аутоиммунных расстройств у генетически предрасположенных лиц [93]. Относительно уровня IFN- мнения исследователей неоднозначны: одни авторы отмечают его повышение у больных ХАК [33,182]. По данным других исследований уровень IFN- у больных ХК не отличается от показателей здоровых лиц [106]. В ряде работ показана роль противовоспалительных цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, подавляющих функцию IFN- и IFN- [165,122]. Дело в том, что по ИЛ-4 данных литературы много, но они порой противоречивы. Так, одни исследователи указывают на повышение уровня ИЛ-4 у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми [104]. Другие авторы наоборот, не находят повышения показателей ИЛ-4 у данной категории больных по сравнению с контрольной группой [165]. Что касается показателей ИЛ-10, то в имеющейся литературе все авторы указывают на его повышение у больных ХАК [7,109]. Известно, что ИЛ-10 является продуктом Тreg1, обладающим супрессорной активностью. Более того, хорошо известна способность ИЛ-10 подавлять функциональную активность макрофагов. После проведения специфической иммунотерапии авторами было отмечено снижение показателей ИЛ-10, что являлось прогностическим критерием эффективности лечения [137,180].
Также есть немногочисленные исследования по определению уровня ИЛ-18 у больных ХАК. Одни авторы считают, что данный цитокин может стимулировать продукцию IFN- и тем самым запускать развитие аутоиммунного заболевания [164]. На основании других, недавно проведенных исследований, было выявлено, что повышенные уровни ИЛ-18 коррелируют с тяжестью заболевания у пациентов с положительным результатом пробы с аутосывороткой и с результатами теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки крови больных ХАК. Данный факт может свидетельствовать об участии ИЛ-18 в качестве непосредственного фактора высвобождающего гистамин [134,173].
Влияние препарата «Г абриглобин-Ig G» на цитокин - продуцирующую способность клеток иммунной системы в тесте еx vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей
В настоящее время тесты ex vivo кроме оценки спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов клетками широко используются для оценки влияния фармакологических препаратов на клетки иммунной системы больных людей с целью назначения лечения. Данный подход был использован и в нашей работе. Было проведено изучение влияния диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы у больных ХАК.
Как видно из данных таблицы 4, при постановке теста ex vivo у 67% здоровых людей максимальная выработка ИЛ-10 клетками иммунной системы наблюдалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:3, у 22% – при разведении 1:10 и лишь у 11% – при разведении препарата 1:1. Из этого следовало, что оптимальным разведением препарата по выработке ИЛ-10 клетками иммунной системы явилось – 1:3. При изучении показателей выработки ИЛ-17 клетками иммунной системы было установлено, что у 50% здоровых людей максимальная выработка данного цитокина отмечалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:3, у 30% – при разведении препарата 1:1 и у 20% – при разведении 1:10. В связи с этим, оптимальное разведение препарата «Габриглобин-IgG» по выработке ИЛ-17 клетками иммунной системы составило – 1:3. При исследовании продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы было выявлено, что у 70% здоровых доноров максимальная продукция ИЛ-18 наблюдалась при разведении препарата «Габриглобин-IgG» 1:10, у 20% – при разведении 1:1 и лишь у 10% – при разведении 1:3. Исходя из полученных данных, диагностически значимое разведение препарата по выработке ИЛ-18 клетками иммунной системы составило – 1:10. При изучении показателей продукции IFN клетками иммунной системы было выявлено, что оптимальным разведением препарата «Габриглобин-IgG» явилось – 1:3, так как у 60% здоровых людей максимальная продукция данного цитокина клетками отмечалась при данном разведении и лишь у 40% - при разведении препарата 1:10.
Таким образом, при изучении показателей продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы было выявлено, что диагностически значимое разведение препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFN клетками иммунной системы составило – 1:3, а для ИЛ-18 – 1:10. Следовательно, в работу по изучению влияния препарата «Габриглобин-IgG» на выработку цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN клетками иммунной системы больных ХАК были взяты следующие разведения препарата: для ИЛ-10, ИЛ-17 и IFN – 1:3, а для ИЛ-18 – 1:10. В предыдущей главе нами были подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых людей, с целью использования их в тесте ex vivo у больных ХАК. Также нас интересовал вопрос изучения влияния диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у наблюдаемых пациентов. В соответствие с целью и задачами нашего исследования, был проведен сравнительный анализ уровня цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в супернатанте клеток имунной системы, стимулированных препаратом «Габриглобин-IgG» (диагностически значимые разведения 1:3 и 1:10) между больными ХАК и контрольной группой. Как видно из данных таблицы 5, показатель продукции ИЛ-10 клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) у больных ХАК был более низким по сравнению с контрольной группой. При этом в группе пациентов mediana данного показателя была в 2 раза ниже по сравнению с mediana в группе контроля. Однако уровень ИЛ-10 в сравниваемых группах не имел статистически значимого различия, из-за большого разброса значений данного показателя. Полученные результаты согласуются с данными по спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10, которые также не имели достоверных различий между группой больных ХАК и контрольной группой. При изучении продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в группе пациентов и контрольной группе были получены следующие данные. Так, уровень данного показателя у больных ХАК составил 55,35 пг/мл [33,8-111,0], что было достоверно более высоким по сравнению с показателем контрольной группы (9,95 пг/мл [5,7-28,6]) (Mann-Whitney test, р=0,00091). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что препарат «Габриглобин-IgG» способен вызывать повышенную продукцию ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с группой контроля. Также, полученные данные согласуются с достоверно более высоким показателем спонтанной продукции ИЛ-17 (Mann-Whitney test, р=0,00068) и достоверно более высоким уровнем ФГА-индуцированной продукции данного цитокина (Mann-Whitney test, р=0,000028) у больных ХАК по сравнению с контрольной группой. Анализ продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:10) в группе больных ХАК и контрольной группе не выявил статистически значимых различий. Так, значения данного показателя у пациентов и в группе контроля практически находились на одном уровне.
При изучении продукции IFN клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3), было выявлено, что уровень данного показателя был статистически более низким у больных ХАК и составил 19,6 пг/мл [4,6-42,3] по сравнению с показателем контрольной группы (44,05 пг/мл [22,4-55,1]) (Mann-Whitney test, р=0,045). Также было отмечено, что mеdiana показателя IFN у больных ХАК была ниже в 2 раза по сравнению с контрольной группой. Таким образом, сравнительный анализ результатов, полученных в тесте ex vivo с диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG», позволил выявить, что данный препарат вызывал повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFN клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой (рисунок 2).
Характеристика уровня цитокинов в сыворотке крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей
Цитокины играют ключевую роль в регуляции всех функций иммунитета, и их изучение является неотъемлемой частью для оценки работы клеток иммунной системы. В настоящее время уровень цитокинов определяют в различных биологических жидкостях разнообразными методами. Исследование их уровня в сыворотке крови является самым доступным методом и отражает системный характер их функционирования. В главе 2.1. нами было проведено изучение уровня цитокинов у больных ХАК в спонтанной и ФГА-индуцированной продукции клеток иммунной системы. Но также нас интересовал вопрос изучения уровня цитокинов и в сыворотке крови у больных ХАК. С этой целью было проведено определение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в сыворотке крови у больных ХАК в сравнении с контрольной группой. Полученные данные представлены в таблице 7. Как видно из данных таблицы 7, у больных ХАК уровень ИЛ-4 в сыворотке крови составил 0,39 пг/мл [0-0,71], что было достоверно более низким по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 4,6 пг/мл [0,21-5,0] (Mann-Whitney test, p=0,000032). Также было выявлено, что mеdiana у больных ХАК была почти в 12 раз ниже, чем в контрольной группе. Полученный результат о более низком уровне ИЛ-4 в сыворотке крови у больных ХАК по сравнению со здоровыми людьми согласуется с данными литературы [165]. Сравнительный анализ уровней ИЛ-10, ИЛ-17 и IFN между группой пациентов и контрольной группой не выявил достоверных различий. Полученные результаты могут быть связаны с тем, что цитокины являются коротко дистантными субстанциями, поэтому их не всегда можно определить в системном кровотоке.
При сравнении уровня ИЛ-18 в сыворотке крови между группой больных ХАК и группой контроля, также не было выявлено статистически значимых различий. Однако, как видно из данных таблицы 7, уровень ИЛ-18 у больных ХАК, который составил 87,1 пг/мл [61,4-198,2] имел тенденцию к снижению по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 111,0 пг/мл [60,0-121,3]. При этом, mеdiana показателя ИЛ-18 у пациентов была ниже в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой. Полученные данные согласуются с данными литературы, о том, что уровень ИЛ-18 в сыворотке крови у больных ХАК не отличался от здоровых людей, и изменялся только в зависимости от тяжести заболевания [164].
Таким образом, при изучении уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN в сыворотке крови в группе больных ХАК в сравнении с контрольной группой, было выявлено только статистически значимое снижение уровня ИЛ-4, при этом, показатели других изучаемых цитокинов достоверно не различались (рисунок 4). На основании полученных результатов, можно сделать вывод о том, что определение уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК не является достаточно информативным по сравнению с изучением цитокинов методом ex vivo. До недавнего времени ХИК составляла 80-95% в структуре ХК [23,62]. Однако в связи с многочисленными исследованиями в данной области и диагностикой ХАК, процент ХИК заметно сократился и составляет 55% [111]. Несмотря на то, что клинические проявления разных форм ХК являются практически одинаковыми, механизмы развития их различаются. Исследованиями последних лет доказано, что при аутоиммунной форме ХК важную роль в патогенезе играет процесс образования патологических аутоантител, которые вызывают ряд иммунологических нарушений [155]. Одним из важных диагностических критериев ХАК является положительная проба с аутосывороткой, которая позволяет отнести пациентов именно в группу с аутоиммунной формой ХК. В тоже время, пациенты с ХИК имеют отрицательную пробу с аутосывороткой, так как в патогенезе данной формы ХК, по-видимому, играют роль другие механизмы развития патологии [13]. В связи с вышесказанным, актуальным является сравнительное изучение иммунологических показателей между больными ХАК и ХИК. С этой целью нами было проведено исследование основных показателей клеточного, гуморального иммунитета, компонентов комплемента, а также уровней цитокинов в сыворотке крови в группах больных ХАК и ХИК. Кроме того, данные показатели были проанализированы у больных ХИК в сравнении с контрольной группой. Полученные в работе результаты представлены в таблице 8. При сравнительном анализе уровня CD4+-популяции лимфоцитов между больными ХАК и ХИК не было выявлено статистически значимых различий. Также у больных ХИК в сравнении с контрольной группой данный показатель достоверно не различался. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХИК уровень CD4+-популяции лимфоцитов соответствовал уровню здоровых лиц. В отличие от этого, уровень данного показателя у больных ХАК был достоверно повышен и составил 47,0% [42,0-52,0] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 42,0% [38,0-46,0] (Mann-Whitney test, р=0,008) (см. главу 3.1). При исследовании уровня CD8+-популяции лимфоцитов в группе больных ХАК было выявлено достоверно значимое снижение уровня данного показателя, который составил 18,0% [16,0-21,0] по сравнению с группой больных ХИК, где аналогичный показатель составил 23,0% [19,0-30,0] (Mann-Whitney test, р=0,019). При сравнительном анализе уровня CD8+-популяции лимфоцитов между больными ХИК и контрольной группой не было выявлено достоверно значимых различий. Из полученных результатов по уровню CD8+-популяции лимфоцитов следует, что только при ХАК возникает снижение показателей цитотоксических Т-лимфоцитов. При изучении показателя ИРИ между больными ХАК и ХИК было получено, что в группе больных ХАК уровень данного показателя составил 2,3 [2,0-3,2], что было достоверно выше по сравнению с группой ХИК, в которой данный показатель составил 1,9 [1,5-2,1] (Mann-Whitney test, р=0,0178). В то же время показатель ИРИ у больных ХИК не имел достоверных различий с группой контроля. Полученные данные по показателям клеточного иммунитета, свидетельствуют о дисбалансе основных популяций лимфоцитов у больных ХАК, который не наблюдается у больных ХИК.
