Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Свободнорадикальное окисление и старение 10
1.2. Перекисное окисление липидов при интоксикации 19
1.3. Возрастные изменения микроциркуляторного русла 23
1.4. Изменения микроциркуляторного русла при интоксикации 27
1.5. Влияние лекарственных препаратов на лимфатический дренаж тканей 31
Глава 2. Объекты и методы исследования 44
Глава 3. Дренажная функция лимфатической системы, показатели пере кисного окисления липидов и общего анализа крови у мышей разного возраста : 51
3.1. Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке 51
3.2. Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови 51
3.3. Показатели общего анализа крови 52
3.4. Расчет коэффициента корреляции 54
Глава 4. Дренажная функция лимфатической системы, перекисное окисление липидов и показатели общего анализа крови у мышей разного возраста при экзогенной интоксикации
4.1. Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке 56
4.2. Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови 56
4.3. Показатели общего анализа крови 57
4.4. Расчет коэффициента корреляции 64
Глава 5. Дренажная функция лимфатической системы, перекисное окисление липидов и показатели общего анализа крови у мышей разного возраста при медикаментозной коррекции экзогенной интоксикации
5.1. Перекисное окисление липидов, дренажная функция лимфатической системы и показатели общего анализа крови у зрелых мышей при воздействии препаратов с антиоксидантной активностью 66
5.1.1. Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови 66
5.1.2 Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке 66
5.1.3. Показатели общего анализа крови 67
5.1.4. Расчет коэффициента корреляции 74
5.2. Дренажная функция лимфатической системы, перекисное окисление липидов и показатели общего анализа крови у мышей разного возраста с экзогенной интоксикацией при сочетанном применении препаратов мексидол и хофитол 77
5.2.1. Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке 77
5.2.2. Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови 78
5.2.3. Показатели общего анализа крови 78
5.2.4. Расчет коэффициента корреляции 88
6. Обсуждение полученных результатов 90
Выводы 107
Список литературы 109
Список сокращений
- Перекисное окисление липидов при интоксикации
- Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови
- Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови
- Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке
Перекисное окисление липидов при интоксикации
В метаболизме органов и тканей большую роль играет свободнорадикальное окисление [60]. Перекиси ли-пидов участвуют в окислительном фосфорилировании, в биосинтезе простаг-ландинов, стероидных гормонов и тромбоксанов [8], в трансформации жирных кислот и углеводов [143], в клеточном метаболизме и поддержании постоянства внутренней среды организма [109, 162]. Они регулируют обновление и проницаемость липидов биологических мембран, синтез ДНК, РНК и белковых макромолекул [7, 60]. Таким образом, свободнорадикальное окисление протекает непрерывно во всех тканях живых организмов и при низкой интенсивности является одним из неотъемлемых компонентов нормальных метаболических процессов [62]. Однако, при нарушении физиологических условий (стресс, гипоксия, длительное воздействие прооксидантов) происходит неадекватная активация перекисного окисления липидов.
В начале 50-х годов американский ученый D. Наппап [294] выдвинул гипотезу, согласно которой активация свободнорадикального окисления является универсальной причиной старения. Она стимулирует возрастные изменения митохондрий и вызывает в клетках и тканях организма необратимые окислительные повреждения. Аналогичные взгляды высказывали и другие авторы [180, 256, 257]. Благодаря большому количеству экспериментальных и клинических наблюдений гипотеза трансформировалась в свободнорадикальную теорию старения [15, 60]. Основные аргументы, которые приводят сторонники этой теории, сводятся к следующему. С возрастом в организме нарастает продукция активных форм кислорода при одновременном уменьшении способности антиоксидантной защиты и снижении эффективности процессов репарации окислительных повреждений. Центральная роль в инициации возрастных изменений принадлежит таким продуктам перекисного окисления липидов, как малоновый диальдегид, основания Шиффа, свободнорадикальные формы хинонов и металлы с переменной валентностью [118, 166, 173, 203]. Накапливаясь в органах и тканях, они ускоряют процессы естественного старения, способствуют преждевременному старению и раннему формированию болезней пожилого возраста, включая рак, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, возрастную иммунодепрессию, нейродегенеративные заболевания и дисфункции мозга [15, 283, 296]. Высокий уровень перекисного окисления липидов в периферической крови определяет и усугубляет большую часть полиорганной патологии [264]. Дополнительный вклад в эти процессы вносят экологические (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, загрязнение атмосферного воздуха, воды и пищи химическими веществами) и параэкологические (неполноценное питание, гиподинамия, стресс, вредные привычки) воздействия. Процессы старения у животных можно замедлить, а продолжительность их жизни увеличить применением природных или синтетических антиоксидантов [16, 232]. 1.1.2. Интенсивность образования свободных радикалов при старении. Данные о возрастной динамике отдельных показателей свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов и белков в различных тканях противоречивы [128, 296, 320, 326, 329, 341]. Это может быть обусловлено различиями в объектах изучения (видовые, линейные, органные), особенностями диеты животных в разных лабораториях (в том числе содержанием в корме про-и антиоксидантов), исследованием различных возрастных периодов и другими факторами.
С возрастом в различных органах и тканях увеличивается образование свободных радикалов и других активных форм кислорода [214, 319]. Минимальные значения показателей липидной пероксидации в сыворотке крови регистрируется у людей и животных среднего возраста, максимальное — старческого возраста [26]. По данным Н.М. Эмануэля [256], при старении в печени мышей линии SHK на 15% повышается содержание свободных радикалов. Ж.И.Абрамова и Г.И. Оксенгендлер [2] приводят сведения, указывающие на возрастное усиление генерации свободных радикалов в тканях головного мозга. Показано, что у людей с 25 до 93 лет в мышцах происходит существенное накопление маркера 8-ОН-2 дезоксигуанозина, малонового диальдегида и карбонильных групп белков, что свидетельствует об усилении процессов их перекис-ного окисления [309].
Существует обратная зависимость между максимальной продолжительностью жизни и интенсивностью аэробных окислительных процессов у животных разных видов. Например, количество окислительных повреждений ядерной ДНК в клетке человека в среднем составляет 10 000 в день, а в клетке крысы, имеющей более высокую интенсивность дыхания (и окислительного фосфори-лирования) - 100 000 в день [214]. Так как скорость генерации свободных радикалов прямо пропорциональна скорости потребления кислорода при дыхании, уменьшение интенсивности дыхания должно в принципе удлинять продолжительность жизни [128].
Нельзя не учитывать, что с возрастом нарастают изменения в кровеносном русле, приводящие к развитию вторичной гипоксии. При этом, несмотря на дефицит кислорода, наблюдается активация перекисного окисления липидов. Блокада конечного звена переноса электронов сама по себе приводит к неполному восстановлению 02, что сопровождается усилением генерации его активных форм. В условиях гипоксии накопление гидроперекисей связано также с возрастанием уровня активаторов оксидантной системы. Одним из важных факторов усиления липидной пероксидации может стать возникающее при гипоксии повышение симпатоадреналовых влияний, так как в процессе биосинтеза и распада катехоламинов образуются активные формы кислорода. Кроме того, катехоламины усиливают действие интрацеллюлярных липаз, способствуют накоплению жирных кислот и тем самым увеличивают интенсивность перекисного окисления липидов.
Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови
В исследование включено 599 белых беспородных лабораторных мышей массой от 20 до 40 г., находящихся в идентичных условиях содержания и получавших одинаковый, стандартный для мышей, рацион питания.
Эксперименты проведены на молодых (3 месячных) мышах массой 18-22 г., зрелых (6-ти месячных) мышах массой 30-34 г. и старых (20-ти месячных) мышах массой 36-41 г. в острых опытах с соблюдением правил работы на животных согласно базисным нормативным документам Минздрава России и ВОЗ [36, 352]. Во время эксперимента мыши находились под нембуталовым наркозом (5 мг/100 г массы внутримышечно), после его окончания животные забивались введением летальных доз нембутала. Изучались скорость интерстициаль-ного гуморального транспорта (ИГТ) и лимфатического дренажа (ЛД) тканей, активность перекисного окисления липидов и показатели периферической крови с расчетом гематологических индексов интоксикации.
Исследование скорости ИГТ и ЛД тканей
Для определения состояния ИГТ и ЛД тканей использовали общепринятую методику изучения микроциркуляции в брыжейке тонкой кишки методом витальной микроскопии в проходящем свете [225, 245]. Скорость ИГТ и ЛД тканей определяли по времени (мин), за которое происходило полное выведение из ткани брыжейки предварительно введенного в нее лимфотропного маркера. В качестве маркера использовали краситель Evans blau «Merck», который вводили в толщу корневого участка брыжейки (область илеоцекального угла) мышей, с помощью прецизионного шприца Microliter Syringes фирмы Hamilton Bona-duz AG в дозе 0,002 мл 2% раствора. После введения красителя появлялась хорошо визуализируемая метка в виде синего пятна с четкими границами (рис.1). Известно, что краситель Evans blau в тканях соединяется с белками интерсти-циальной жидкости и вместе с ними направляется в сторону лимфатических капилляров, чему способствует коллоидная структура красителя [182]. В свя 45 зи с этим время полного удаления пятна маркера служит показателем не только скорости ИГТ, но и сопряженного с ним процесса ЛД ткани. Рис. 1. Исследование скорости ИГТ и ЛД в брыжейке мышей. Метка лимфотропного красителя синего Эванса: А - в начале эксперимента; Б - в середине эксперимента; В - в конце эксперимента На протяжении всего эксперимента температура мышей поддерживалась на уровне 37С: постоянно подогревался столик, на котором располагалось животное, а брыжейка кишки капельным способом орошалась подогретым изотоническим раствором хлористого натрия. О состоянии животного судили по частоте дыхания и перистальтических сокращений кишки, окраске видимых слизистых покровов.
Оценка активности перекисного окисления липидов
О состоянии перекисного окисления липидов судили по уровню малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови, определяемому по тесту с тиобарбиту-ровой кислотой [62]. Концентрацию МДА рассчитывали по уравнению регрессии: С=0,81+106 х АД (С - концентрация тиобарбитуровой кислоты, АД - разница показателей оптической плотности) и выражали в наномолях на 1 мл биологической жидкости (нмоль/мл). Исследования проведены в лаборатории ли-пидного обмена ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава.
Изучение параметров общего анализа крови с расчетом индексов интоксикации
Общий анализ крови осуществлялся на гематологическом анализаторе АВХ Micros 60. Поскольку процентное выражение клеток периферической крови не отражает их истинное содержание, что может привести к ошибочным выводам. Поэтому при анализе полученных результатов мы использовали абсолютные значения клеток периферической крови. По показателям общего анализа крови рассчитывали следующие гематологические индексы интоксикации. Лейкоцитарный индекс интоксикации Кальф-Калифа (ЛИИ) предложенный автором еще в 1941 году [112], раскрывает соотношение гранулоцитарного и агранулоцитарного ростков белой крови и рассчитывается по формуле: (4 миелоциты+3 юных+2 палочкояд.+сегмантояд.) х (плазм, клетки+1) ЛИИк= (лимфоциты+моноциты) х (эозинофилы + 1) В норме ЛИИ составляет 0,62 ±0,3.
Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови
По мере старения животных происходило увеличение времени эвакуации лимфотропного красителя из брыжейки: с 42,4±2,3 мин - у мышей 3-х месячного возраста, до 74,0+1,8 мин - у мышей 20-ти месячного возраста (рис. 3.1). У зрелых мышей по сравнению с молодыми животными показатель был на 44% больше и составлял 61,0±1,5 мин. У старых животных по сравнению со зрелыми мышами время выведения лимфотропной метки из брыжейки повышалось на 21 %, а по сравнению с молодыми животными - на 74% .
С возрастом в сыворотке крови мышей происходило нарастание уровня МДА: с 2,06±0,4 нмоль/л у мышей 3-х месячного возраста, до 17,94±1,3 нмоль/л у животных 20-ти месячного возраста (рис. 3.2). У 6-тимесячных мышей уровень МДА был в 7,3 раза больше, чем у молодых животных и составлял 15,05±0,3 нмоль/л. У 20-ти месячных животных по сравнению с 6-ти месячными мышами наблюдалась только тенденция к увеличению концентрации МДА в сыворотке крови. Возраст(месяцы) 15 нмоль/л Рис. 3.2. Концентрация малонового диальдегида в сыворотке крови мышей разного возраста
Показатели общего анализа крови у мышей разного возраста представлены в таблице 3.1. Таблица 3.1 Показатели общего анализа крови (М±т) у мышей разного возраста Показатель Возраст Показатель достоверности месяца 6 месяцев 20 месяцев РЗ-6 РЗ-20 Рб-20 Эритроциты (102/л) 9,17±0,35 10,65±0,27 10,26±0,32 0,01 0,05 0,2 Гемоглобин (г/л) 152,6±2,2 169,4±3,44 171,3±5,27 0,005 0,01 0,2 Гематокрит (л/л) 41,98±0,49 45,54±0,94 47,81±1,53 0,01 0,01 0,2 Тромбоциты (10у/л) 378,9±19,68 585,7±43,04 508,4±32,76 0,005 0,01 0,2 Лейкоциты (109/л) 4470±338 9030±913 10850±928 0,005 0,001 0,2 Сегментоядерные Нейтрофилы (109/л) 691,8±149 3405,6±616 4774,1 ±512 0,005 0,001 0,2 Палочкоядерные нейтрофилы (109/л) 59±9,18 164,8±49,66 207,4±28,54 0,1 0,001 0,2 Эозинофилы (109/л) 39±7,96 90±22,30 35,2±18,60 0,1 0,2 0,1 Базофилы (109/л) 4,4±4,40 55±32,15 0±0 0,2 0,2 0,2 Лимфоциты (109/л) 3272,4±244 5098,1 ±499 4898,8±370 0,01 0,01 0,2 Моноциты (109/л) 397,2±28,14 160,3±49,57 944,5±103,0 0,005 0,001 0,001 Л/СН 6,23±0,98 1,97±0,37 1,09±0,08 0,005 0,001 0,05 СОЭ (мм/час) 1,3±0,15 1,2±0,13 1,7±0,21 0,2 0,2 0,1 Примечание. Здесь и далее в таблицах: Рз-6 - показатель достоверности разницы параметров у мышей 3-месячного и 6-месячного возраста; Р3-20 - показатель достоверности различия параметров у мышей 3-месячного и 20-месячного возраста; Рб-го - показатель достоверности различия параметров у мышей 6-месячного и 20-месячного возраста.
У зрелых животных по сравнению с молодыми мышами наблюдалось досто верное увеличение числа эритроцитов (на 16%), уровня гемоглобина (на 11 %) и показателя гематокрита (на 8,5%). У старых мышей перечисленные показатели оставались на том же уровне, что и у зрелых животных.
Количество тромбоцитов у животных в возрасте 6-ти месяцев было в 1,5 раза больше, чем у 3-х месячных мышей. У животных в возрасте 20-ти месяцев наблюдалась тенденция к снижению числа тромбоцитов, но их количество оставалось достоверно выше, чем у 3-х месячных мышей.
Число лейкоцитов с возрастом прогрессивно увеличивалось: у зрелых мышей оно было в 2 раза больше, чем у молодых животных. У старых мышей регистрировалась тенденция к дальнейшему росту количества лейкоцитов.
Подобная динамика была характерна и для сегментоядерных нейтрофилов: у зрелых животных по сравнению с молодыми животными наблюдалось их достоверное (в 5 раз) увеличение, у старых мышей регистрировалась тенденция к повышению их числа.
Количество палочкоядерных нейтрофилов у б-ти месячных мышей по сравнению с 3-х месячными имело тенденцию к увеличению. У старых мышей показатель был достоверно выше, чем у молодых мышей, однако по сравнению со зрелыми животными число палочкоядерных нейтрофилов оставалось на том же уровне.
Число эозинофилов и базофилов у зрелых мышей по сравнению с молодыми животными демонстрировало тенденцию к повышению. По мере увеличения возраста показатели приобретали тенденцию к снижению. У старых животных базофилы в периферической крови не определялись.
Количество лимфоцитов у зрелых мышей по сравнению с молодыми животными увеличивалось в 1,6 раза. У старых мышей число лимфоцитов оставались на том же уровне, что и у зрелых животных, но было достоверно выше, чем у молодых мышей.
Количество моноцитов у 6-ти месячных животных было в 2,5 раза меньше, чем у 3-х месячных мышей. У старых мышей число моноцитов достоверно увеличивалось: в 5,9 раз — по сравнению со зрелыми мышами, и в 2,4 раза - по сравнению с молодыми мышами. Индекс Гаркави (соотношение Л/СН) с возрастом прогрессивно уменьшался: у животных в возрасте 6-ти месяцев он был в 3,2 раза меньше, чем у 3-х месячных мышей. У 20-ти месячных животных индекс Гаркави был в 1,8 раз меньше, чем у 6-ти месячных мышей и в 5,7 раз меньше, чем у 3-х месячных животных.
СОЭ у зрелых мышей оставалась на том же уровне, что и у молодых животных. У мышей 20-ти месяцев при сравнении с 6-ти месячными и 3-х месячными мышами отмечалась тенденция к повышению СОЭ.
Показатели интоксикации (рис. 3.3) с возрастом прогрессивно увеличивались: у зрелых мышей лейкоцитарный индекс интоксикации Кальф-Калифа (ЛИИ) был в 3,2 раза, а гематологический показатель интоксикации Васильева (ГПИ) - в 5 раз больше, чем у молодых животных. У старых мышей показатели интоксикации продолжали достоверно повышаться: по сравнению со зрелыми животными ЛИИ вырос в 2 раза, ГПИ - в 2,3 раза; по сравнению с молодыми мышами ЛИИ увеличивался в 6,6 раза, ГПИ - в 11,4 раза.
Скорость интерстициального гуморального транспорта и лимфатического дренажа в брыжейке
Расчет коэффициента корреляции у зрелых мышей на фоне приема ан тиоксидантов (таблица 5.18) выявил прямую связь между угнетением скорости ИГТ и ЛД тканей, повышением концентрации МДА в сыворотке крови и ГПИ.
Коэффициент корреляции между угнетением скорости ИГТ и ЛД тканей, повышением концентрации МДА в сыворотке крови и ГПИ у зрелых мышей на фоне применения антиоксидантов Показатели МДА Угнетение ИГТ и ЛД Мексидол ГПИ +0,91 +0,96 МДА - +0,9 Эмоксипин ГПИ +0,9 +0,89 МДА - +0,6 Цитохром С ГПИ +0,88 +0,93 МДА - +0,98 Янтарная кислота ГПИ +0,83 +0,95 МДА - +0,89 Хофитол ГПИ +0,75 +0,68 МДА - +0,8 Селен-актив ГПИ +0,93 +0,93 МДА - +0,87 Резюме. Все изученные препараты обладают антиоксидантной активностью, о чем свидетельствует их способность снижать в сыворотке крови зрелых мышей уровень МДА. Одновременно они усиливают ИГТ и ЛД тканей, однако выраженность антиоксидантного и лимфостимулирующего действия у изученных лекарственных средств совпадает не всегда. Влияние препаратов на различные показатели крови также неоднозначно.
Мексидол оказывает самое значительное из всех изученных препаратов ан-тиоксидантное и стимулирующее ИГТ и ЛД тканей действие. Кроме этого, в крови зрелых мышей он уменьшает количество эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, и наиболее значительно, эозинофилов. Препарат вызывает тенденцию к уменьшению числа тромбоцитов, моноцитов и базофилов, и тенденцию к повышению индекса Гаркави. Мексидол не влияет на СОЭ, ЛИИ и ГПИ.
Вторым по выраженности антиоксидантного действия среди изученных препаратов является селен-актив. Между тем по способности усиливать ИГТ и ЛД тканей в наших исследованиях он стоит на последнем, шестом месте. Одновременно препарат уменьшает количество тромбоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, показатель гематокрита, уровень гемоглобина и ГПИ. Селен-актив вызывает тенденцию к снижению числа эозинофилов, базофилов, моноцитов крови и ЛИИ, и тенденцию к повышению индекса Гаркави. Он не влияет на количество эритроцитов и СОЭ в крови зрелых мышей.
Третье место по антиоксидантной активности занимает хофитол, тогда как по лимфостимулирующей способности среди изученных препаратов он стоит на четвертом месте. Между тем, препарат более других снижает ЛИИ и ГПИ. Хофитол уменьшает количество эритроцитов, тромбоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, уровень гемоглобина и показатель гематокрита. Препарат значительно повышает число эозинофилов и индекс Гаркави. Количество лейкоцитов и СОЭ имеют тенденцию к снижению. Хофитол не влияет на число лимфоцитов, палочкоядерных нейтрофилов, базофилов и моноцитов крови.
Четвертым по антиоксидантным свойствам из изученных препаратов является янтарная кислота. По способности усиливать ИГТ и ЛД тканей она занимает третье место. Препарат повышает количество лейкоцитов, моноцитов крови, индекс Гаркави и уменьшает число тромбоцитов, уровень гемоглобина, ЛИИ и ГПИ. Янтарная кислота вызывает тенденцию к снижению количества эритроцитов, сегментоядерных нейтрофилов, базофилов и показателя гематокрита и тенденцию к повышению СОЭ. Препарат не влияет на число лимфоцитов, эозинофилов и моноцитов в крови зрелых мышей. Пятое место по антиоксидантной активности занимает эмоксипин. При этом он проявляет значительные лимфостимулирующие свойства, уступая только мексидолу. Из всех изученных препаратов эмоксипин меньше всего влияет на показатели периферической крови. Так после его воздействия в крови зрелых мышей количество лейкоцитов, лимфоцитов, эозинофилов, моноцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, индекс Гаркави, СОЭ, ЛИИ и ГПИ не меняются. Показатель гематокрита, число тромбоцитов и базофилов имеют тенденцию к снижению, а количество эритроцитов и уровень гемоглобина уменьшаются.
Влияние Цитохрома С на уровень МДА в сыворотке крови зрелых мышей приближается к действию эмоксипина, однако лимфостимулирующее действие препарата менее значительно (пятое место из всех изученных препаратов). В отличие от предыдущего эмоксипина, цитохром С изменяет большинство показателей периферической крови. Он снижает количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, уровень гемоглобина крови и повышает число моноцитов и СОЭ. Препарат вызывает тенденцию к уменьшению количества палочкоядерных нейтрофилов и базофилов и не влияет на индекс Гаркави, ЛИИ и ГПИ.
У зрелых мышей, получавших различные препараты с антиоксидантной активностью, сохраняется прямая корреляционная связь между угнетением скорости ИГТ и ЛД тканей, повышением концентрации МДА в сыворотке крови и ГПИ, выявляемая у зрелых животных контрольной группы.
