Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Роль гормонально-метаболических изменений в механизмах старения и канцерогенеза
1.2. Система инсулинопобного фактора роста 12
1.3. Средства нормализации гормонально-метаболических сдвигов как геропротекторы 18
1.4. Экспериментальные модели и методы оценки действия геропротекторов 24
1.5. Заключение 32
2. Материалы и методы 34
2.1. Животные -
2.2. Препараты -
2.3. Схема экспериментов и регистрируемые показатели 36
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 43
3 Результаты собственных исследований 45
3.1. Результаты опытов по изучению влияния диабенола на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей линий NMRI nHER-2/neu
3.1.1. Эксперименты на мышах NMRI
3.1.2. Эксперименты на мышах HER-2/neu 59
3.2. Результаты опытов по изучению влияния метформина на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей HER-2/neu 72
4. Обсуждение результатов исследования 81
Выводы 92
- Система инсулинопобного фактора роста
- Экспериментальные модели и методы оценки действия геропротекторов
- Схема экспериментов и регистрируемые показатели
- Результаты опытов по изучению влияния метформина на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей HER-2/neu
Система инсулинопобного фактора роста
Ранее было высказано предположение, что способность раковой клетки к автономному росту определяется аутосекрецией факторов роста (ФР), взаимодействующих с соответствующими рецепторами на поверхности мембраны той же клетки [Дильман В.М., 1983]. Результатом этого является включение/усиление программы деления клетки. Одним из основных ФР, ответственных за фазу синтеза ДНК, является инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1). Существование ИФР (соматомединов) впервые было постулировано еще в 50-е годы прошлого столетия, когда впервые был выявлен зависимый от гормона роста (ГР) сульфатный фактор. Позже [Froesch Е. et al., 1975] была обнаружена не подавляемая инсулиноподобная активность (NSILA) в нормальной сыворотке. Третья линия научных поисков привела к обнаружению мультипликационно-стимулирующей активности (MAS) - митогенного фактора, продуцируемого клетками печени у крыс и имеющего митогенные и метаболические характеристики сульфатного фактора и NSILA [Dulak N., Temin Н., 1973]. В середине 70-х годов было выделено два вида соматомединов [Van Wyk J., 1974; Hall К. et al., 1975]. Позже оказалось, что они имеют определенное сходство с проинсулином и инсулином, и их стали обозначать как ИФР. На сегодняшний день в наибольшей степени изучен первый из них, т.е. ИФР-1. Представляя собой полипептид, имеющий в составе около 70 аминокислот [Mishra L. et al., 1998], ИФР-1 обладает инсулиноподобной активностью [Yu Н., Berkel Н., 1999] и играет основную роль в клеточной пролиферации, подавлении апоптоза (программируемой гибели клеток), а также дифференцировке многих клеток человеческого организма [Jones J., Clemmons D., 1995]. Комбинация этих митогенных и антиапоптотических эффектов ведет к созданию условий для опухолевого роста [Cory S. et al., 1999]. Наибольшую важность представляет тот факт, что ИФР-1 служит в качестве эндокринного, аутокринного и паракринного стимулятора митогенеза и, как 4 следствие, отдельных этапов канцерогенеза [Grinberg A., Cohen Р., 2000]. Он рассматривается как фактор «прогрессии» или фактор прохождения по клеточному циклу. Его присутствие необходимо клеткам в Gl-фазе (интервал до синтеза ДНК), а также для вступления клеток в S-фазу (синтез ДНК) [Cascinu S. et al., 1997; Бурлев В.А. и соавт., 1998; Giovannucci Е., 1999]. Функции ИФР шире, чем только звена в передаче ростового сигнала. Подтверждением этого может быть то наблюдение, что ИФР-1, и ИФР-2 экспрессируются практически во всех известных тканях [Кушлинский Н.Е., Бабкина И.В., 1996; Ma J. et al., 1999].
Оказывая заметное анаболическое действие на метаболизм белков и углеводов, ИФР-1 повышает усвоение клетками аминокислот и глюкозы, стимулирует синтез белков и гликогена [Cory S. et al., 1999]. У детей ИФР-1 стимулирует рост костной ткани и развитие таких органов, как сердце, печень, почки. Следует заметить, что главным стимулирующим фактором синтеза ИФР-1 в печени является гормон роста. С учетом отмеченного выше, актуальным является вопрос о роли возрастных изменений в системе гормон роста - инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1) - инсулин - глюкоза в механизмах старения и канцерогенеза [Sonntag W.E. et al., 1999]. Эта система чрезвычайно эволюционно консервативна и ее строение и функция весьма сходны у дрожжей, нематод, дрозофил, мыши и человека [Кепуоп С. 2001; Longo V.D., Finch С.Е., 2003; Tatar М. et al., 2001]. Продуцируемый соматотропными клетками гипофиза гормон роста стимулирует мобилизацию жирных кислот, захват аминокислот, синтез ДНК, РНК и белков, участвует в регуляции деления клетки и тканевой гипертрофии. Показано, что его секреция происходит импульсами, интенсивность которых усиливается вскоре после начала сна, и регулируется двумя гипоталамическими гормонами - гормон роста-высвобождающим гормоном (GHRH), который вызывает секрецию гормона роста гипофизом, и соматостатином, который ее угнетает. Гормон роста имеет высокий аффинитет к рецепторам, которые имеются во всех тканях организма. Активация! рецепторов, гормона роста в печени и в других тканях ведет к стимуляции и секреции ИФР-1. Продукция ИФР-1 в печени усиливается при повышении-уровня соматотропного гормона (СТГ). . Циркулируя в высокой концентрации в крови, ИФР-1 стимулирует синтез ДНК, РНК и белков и пролиферацию многих тканей. Гормон роста, GHRH, соматостатин и ИФР-1 находятся в гомеостатических отношениях, функционирующих по принципу обратной связи. С возрастом ночной пик. секреции гормона роста снижается как у человека;, так и; у лабораторных грызунов, сопровождаясь снижением концентрации ИФР-1 в плазме крови: Полагают,-что возрастное снижение секреции гормонаї роста обусловлено- снижением ответа гипофиза на действие GHRH продукция которого, в свою очередь, уменьшается. Имеются также убедительные доказательства;, свидетельствующие о том, что возрастное увеличение тонической продукции соматостатина является важным:фактором в снижении;секреции гормонаїроста при старении [Sonntag WE. et all, 1999]: Кроме того,. чувствительность нейронов гипоталамуса, продуцирующих GHRH, к гомеостатическому действию гормона роста снижается с возрастом. Следует заметить, что старение гипоталамуса затрагивает и? такой важный регуляторный механизм; как контроль потребления пищи, то есть, центры аппетита ш насыщения; находящиеся в гомеостатических отношениях с другими: компонентами; системы регуляции энергии в организме [Дильман В;М., 1987; Schwartz M-W. et al.,.2000];- , . Важным звеном в возрастных нарушениях функции . этой .системы; является уменьшение индуцируемой гормоном роста продукции ИФР-1, что может быть дополнительным фактором, определяющим низкий; уровень этого фактора в плазме крови и тканях в старческом возрасте. У старых крыс отмечено двукратное увеличение концентрации рецепторов к гормону роста в тканях, что, однако, не компенсирует возрастного снижения секреции этого гормона.
Установлено также, что размеры и константа Кг, с возрастом не изменяются, а существенно снижается способность гормона роста индуцировать экспрессию гена ИФР-1. Таким образом, и у человека, и у лабораторных животных с возрастом развиваются нарушения в системе передачи сигнала рецептора гормона роста, приводящие к снижению секреции ИФР-1 [Sonntag W.E. etal., 1999]. Рецептор гормона роста принадлежит к семейству цитокиновых рецепторов. Его активация способствует образованию комплекса рецептора с белком- JAK2 с последующим их фосфорилированием. При этом, фосфорилируются и другие внутриклеточные белки, такие как МАР-киназа, S6 киназа и белок STAT - переносчик сигнала и активатор транскрипции. Результатом активации рецептора гормона роста является также увеличение экспрессии таких генов, как c-fos, c-jun, ингибитора фосфатазы серина-1 и гена ИФР-1. Было также показано, что в механизме возрастного нарушения передачи сигнала гормона роста определенную роль играет увеличение обновления рецептора гормона роста, а также точковые мутации, посттрансляционные модификации рецепторного белка и увеличение активности фосфатазы фосфотирозина [Sonntag W.E. et al., 1999]. Концентрация рецепторов ИФР-1 и уровень специфически связывающего его белка (IGFBP) в тканях с возрастом не изменяются. Полагают, что паракринная экспрессия ИФР-1 в старческом возрасте может быть важным механизмом поддержания нормальной функции тканей в ответ на специфические стимулы. В целом же, возрастное снижение уровня ИФР-1 в плазме крови играет существенную роль в снижении пролиферативной активности тканей и, соответственно, в развитии ряда ассоциированных с возрастом патологических процессов. Следует отметить, например, что поскольку как гормон роста, так и ИФР-1 стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток сосудистой стенки, образование трубок и ангиогенез в целом, снижение их продукции с возрастом является существенным фактором развивающейся при старении сосудистой недостаточности. Несмотря на то, что введение гормона роста и ИФР-1 старым животным оказывало ряд благоприятных эффектов, в частности, стимулировало внутриклеточный синтез белка, когнитивные функции, толщину кожи, массу костей, иммунную функцию и рост сосудов у животных и человека, длительное их применение может представить большую опасность для организма, стимулируя развитие неопластического процесса [Anisimov V.N., 2003].
Экспериментальные модели и методы оценки действия геропротекторов
При биотестировании важное значение имеет выбор оптимальных экспериментальных моделей. Млекопитающие - наиболее адекватная экспериментальная модель, потому что их биология в достаточной мере сходна с человеческой. Мыши - наиболее подходящие модели по уходу, затратам и длительности жизни. Одна из важных проблем - это выбор линии мышей. Существует немало серьезных аргументов в поддержку использования гибридных или аутбредных мышей [Anisimov V.N., 1987]. Чтобы иметь линию с генетическим разнообразием и признаками патологий близкими человеческой популяции, необходимо применять мышей, полученных четырехкратным скрещиванием, предложенным несколькими авторами [Warner H.R. et al., 2000]. Другой путь решения проблемы - это использование различных линий в одном исследовании. Такой подход был использован в проведенных в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова исследованиях, где комбинировались аутбредные (SHR или NMRI) мыши, инбредные мыши СВА, а также мыши с ускоренным старением SAMP -1 и трансгенные мыши HER-2/neu [Anisimov V.N. et al., 2001, 2003, 2003a]. Используемые линии должны быть хорошо характеризованы по генетике, выживаемости и патологиям. Наиболее важным аспектом является длительный собственный опыт в выборе линии. Спонтанные и индуцированные генетически изменения, гомозиготные нуль - мутации, нокаутные и трансгенные млекопитающие животные также введены в экспериментальную геронтологию [Anisimov V.N., 2003]. Следует отметить, что поскольку эффекты некоторых генетических манипуляций не экспрессируются, за исключением специфического времени жизни животных, имеются значительные ограничения в интерпретации полученных данных. С одной стороны, исчезновение активности или функции может вести к ошибочному заключению о функциях гена, потому что конечная компенсация может - заметно изменить физиологию животных. С другой стороны, гиперэкспрессия трансгена может и не влиять на продолжительность жизни или другие параметры старения животных. Тем не менее, мутантные и трансгенные мыши применяются для исследования действия некоторых препаратов на продолжительность жизни [Anisimov V.N. et al., 2001, 2003]. Пол мыши очень важен.
Предпочтительно использовать в опытах самок мышей, которые не так агрессивны, как самцы. Другое преимущество самок -это возможность оценки эстральной функции и более широкий спектр опухолей, чем у самцов. Длительные исследования должны начинаться в возрасте двух месяцев, сразу после созревания самок. Непосредственно перед началом эксперимента животные должны быть рандомизированно разделены на контрольную и экспериментальную группы. Число животных должно быть достаточным для дальнейшего статистического анализа (обычно 30-50 мышей на группу). Все мыши должны быть индивидуально помечены. Контрольные мыши могут быть оставлены интактными и/или подвергаться воздействию растворителя с применением таких же доз и режимов как в экспериментальной группе. Лучший путь введения - это введение препарата с питьевой водой или добавление в пищу. Дозы должны быть не выше, чем МПД (максимально переносимая дозировка). В случае введения препарата с питьевой водой или пищей, рекомендуется его применение 5 или 7 дней в неделю. Лучший режим - это длительное постоянное введение вплоть до естественной смерти животных. Режим исследования должен быть не токсичным, простым, без стресса и соответствующим применению у человека. Животные должны наблюдаться до их естественной смерти и забиваться только в состоянии крайней слабости. Дата каждой смерти регистрируется и рассчитывается продолжительность жизни. Критический анализ имеющихся данных об эффективности лекарств, продлевающих жизнь, показывает, что с точки зрения современных требований значительная часть исследований недостаточно качественна. Прошедшие испытания .лекарства часто давались малому количеству животных (от 10 до 20); введение начиналось у животных старого возраста, когда значительная часть более слабых животных погибала, а более крепкие выживали; наблюдение заканчивалось в возрасте 50% смертности или в любое другое произвольное время, но не естественной гибели последнего выжившего; аутопсия и надлежащая патоморфологическая проверка иногда не выполнялись; прибавка веса тела и потребление корма не проверялись и т.д. Необходимо отметить, что использование трансгенных животных в исследованиях канцерогенеза и старения еще не получило широкого распространения, а известные эксперименты имеют ряд недостатков. Прежде всего, это небольшое количество животных в группах, что весьма существенно для статистической оценки результатов. Многие авторы не приводят сведений о наличии патологических процессов, в том числе опухолей у используемых в экспериментах животных. В последние годы об эффективности средств профилактики преждевременного старения предлагают судить не только по конечному результату, например по средней и максимальной продолжительности жизни, суммарной частоте опухолей, но и по динамике так называемых биомаркеров старения. Значение проблемы биомаркеров старения состоит в выявлении факторов, способствующих преждевременному и/или ускоренному старению. Это важно, в особенности, для более быстрой предварительной оценки опытов на долгоживущих видах животных (например, обезьянах) и при применении в гериатрической практике. Для того, чтобы оценить эффективность замедления старения, необходимо по возможности точно измерять биологический возраст и скорость старения. Биологический возраст (иногда его определяют, как физиологический или функциональный возраст) является объективной оценкой статуса здоровья человека [Dean W., 1998]. Тем не менее, можно встретить людей, которые выглядят старше или моложе своего хронологического возраста. Результаты различных измерений биологического возраста показывают, что большинство людей, "выглядящих старше", оказываются биологически старше своего хронологического возраста. Это же относится и к людям, имеющим гипертензию, сахарный диабет или другие хронические заболевания, связанные с возрастом.
Напротив, те, кто молодо выглядят, обычно действительно моложе в биологическом значении возраста. В геронтологической литературе обсуждаются критерии, которым должны удовлетворять биомаркеры старения [Arking R., 1991; Ingram D.K. et al., 2001; Дильман B.M., 1987; Белозерова Л.М, 1998; Коркушко О.В. и др., 2002]. В настоящее время биологический возраст рассматривается как своеобразная математическая модель возрастных структурных и функциональных изменений организма. Тем не менее, единой общепризнанной методики определения биологического возраста пока не выработано [Белозерова Л.М., 1999]. Точная система возрастного определения у людей должна включать в себя оценку параметров, которые претерпевают изменения с возрастом. При этом нужно оценивать одновременно статус здоровья, скорость старения и те возрастные изменения организма, которые могут быть как положительными, так и отрицательными. В различных исследованиях биомаркеров старения используют широкий диапазон тестов, куда входят, в частности, осмотр щелевой лампой на предмет катаракты, оценка когнитивной функции (спутанность сознания), биомаркеры оксидативного стресса (диеновые коныогаты, основания Шиффа, малоновый диальдегид, СОД (супероксиддисмутаза), каталаза, глютатион-пироксидаза и т. д.), гормоны (глюкокортикоиды, половые гормоны, гонадотропины, пролактин, инсулин, ИФР-1, гормон роста, лептин, тироксин, трийдтиронин), параметры метаболизма (глюкоза крови, холестерин, Р-липопротеиды, триглицериды, свободные жирные кислоты), профиль экспрессии генов с микрочиповой технологией и т.д. Однако некоторые методы исследования очень дороги и трудоемки. Следует отметить, что набор применяемых тестов в разных возрастах может- быть различен и должен включать в себя оценку функциональной активности органов и систем органов в состоянии покоя и тесты на адаптацию. В период зрелости биологический возраст определяется по состоянию кожи, зубов, степени окостенения скелета, величине жизненной емкости легких, мышечной силе, остроте зрения и др.
Схема экспериментов и регистрируемые показатели
В.экспериментах с диабенолом как мыши NMRI, так и мыши HER-2/neu в возрасте 2 мес. были рандомизированы по массе тела и подразделены на две сходные по этому параметру группы: 1. Контрольные мыши (50 самок NMRI и 29 самок HER-2/neu), получавшие водопроводную воду и не подвергавшиеся никаким дополнительным воздействиям на протяжении всей жизни. 2. Подопытные животные (50 самок NMRI и 28 самок HER-2/neu) получавшие диабенол с питьевой водой 5 раз в неделю в концентрации 0,1 мг/мл, что соответствовало терапевтической дозе 10 мг/кг массы ." тела. В опыте с метформином трансгенные мыши аналогичным образом были разделены на следующие группы: 1. Контрольные интактные животные (44 мыши). 2. Подопытные животные, получавшие метформин с питьевой водой 5 раз в неделю в концентрации 1200 мг/л, что соответствует суточной дозе 100 мг/кг веса тела (42 мыши). У животных оценивали показатели гомеостаза и старения, а также динамику выживаемости и канцерогенеза. Всех мышей ежемесячно взвешивали на электронных весах. В каждой группе находили среднее значение массы животных и ошибки среднего. Один раз в месяц, одновременно с взвешиванием мышей, производили определение суточного количества потребляемого корма из расчета массы съеденного корма в граммах на одну мышь. В кормушку помещалось 100 граммов предварительно взвешенного корма, ровно через сутки оставшийся в кормушке корм взвешивался. Также изучали количество выпитой воды из расчета объема выпитой жидкости в миллилитрах на одну мышь в сутки. В поилки наливалось 100 мл воды или разведенного препарата, через сутки объем оставшейся жидкости измерялся, путем переливания в мерную колбу. Один раз в три месяца у животных, начиная с возраста 2-3 месяцев, в течение 2 недель ежедневно цитологически исследовали содержимое влагалищных мазков. Мазки готовились по общепринятой методике [Кабак 51.М., 1968] из влагалищного содержимого, полученного всегда утром в одно и то же время посредством введения во влагалище мышей ватного тампончика. Свежеприготовленные мазки без фиксации и окраски микроскопировали при увеличении в 70 раз (об. 10, ок. 7) и с опущенным конденсором микроскопа.
Определение фазы эстрального цикла проводили в соответствии с общепринятыми критериями (табл. 1; рис. 3 - 6). Результаты исследования вагинального содержимого фиксировали в журнале, регистрируя дату взятия мазка. Оценивались следующие параметры эстральной функции: длительность эстрального цикла (ЭЦ), соотношение фаз эстрального цикла, рассчитывалось относительное число коротких (менее 5 дней) и длинных (более 7 дней) эстральных циклов, а также относительное число животных с регулярными циклами, персистирующим эструсом и анэструсом. Измерение температуры тела производили с помощью медицинского электротермометра (ТПЭМ-1), электрод которого вводили в прямую кишку мышей. Электрод помещался в емкость с водой до стабилизации температуры, наконечник электрода смазывали глицерином. Регистрация температуры проводилась 1 раз в 3 месяца. Поскольку температура тела может зависеть от фазы эстрального цикла, параллельно производилась оценка эстрального цикла с помощью влагалищных мазков. В рамках опыта с метформином проведено исследование экспрессии матричной РНК (мРНК) цитолитических лимфоцит-ассоциированных белков перфорина и гранзима В. Оценка выполнена методом ОТ-ПЦР с препаратами тотальной РНК, выделенными из опухолей молочной железы мышей, получавших и не получавших метформин. Исследовались опухоли молочной железы трансгенных мышей HER-2/neu в возрасте 9 мес. После гомогенизации образца ткани, выделяли РНК с использованием TRI-REAGENT в соответствии с инструкциями производителя (Sigma Chemical Co., USA). После обработки ДНК-зой (InvitroGen) определяли концентрацию РНК по поглощению при волне 260 нм, используя спектрофотометр. Для синтеза кДНК использовали 1 мкг тРНК. При ПЦР инкубация осуществлялась в течение 35 циклов в режиме 1 мин 94С (отжиг), 1 мин 60С (денатурация), 1 мин 72С (синтез). Оценка интенсивности и специфичности ОТ-ПЦР проводилась при использовании в качестве стандарта (3-актина. Частоту хромосомных аберраций (ХА) в клетках костного мозга изучали в возрасте 6 мес. у трансгенных мышей, получавших метформин, и у интактных животных. Фиксацию и обработку материала для цитогенетического анализа проводили по модифицированной методике Форда [Ford С.Е., Hamerton I.D., 1956]. У получавших и не получавших метформин трансгенных мышей HER-2/neu в возрасте 5 и 9 мес. изучали уровень в крови инсулина и показателей жиро-углеводного обмена; содержание тироксина и трийодтиронина исследовали в возрасте 9 мес. Животных выводили из опыта путем декапитации, кровь собирали и после центрифугирования сыворотку хранили при -20С.
В собранной сыворотке крови определяли: - уровень инсулина - иммуноферментным методом (ELISA) с помощью наборов фирмы Diagnostic Systems Lab. Inc., США; результаты выражали в мкЕд/мл; - уровни тироксина (Т4) и трийодтиронина (ТЗ) - иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы ХЕМА-Медика, Россия; результаты выражали в нг/мл; - уровень холестерина - энзимоколориметрическим методом с помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург; результаты выражали в мМ/л; - уровень триглицеридов - энзимоколориметрическим методом с помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург; результаты выражали в мМ/л; - уровень р-липопротеидов и суммарных липопротеидов (сумма бета- и пребета- липопротеидов) - турбидиметрическим методом [Ледвина М., 1960], результаты выражали в единицах экстинкции; - уровень глюкозы - энзимоколориметрическим (глюкозоксидазным) методом с помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург; результаты выражали в мМ/л. За животными вели постоянное наблюдение на протяжении всей жизни. Появление опухолей молочных желез и других видимых новообразований у мышей, а также патологических изменений регистрировали (отмечали срок обнаружения в сутках). Обнаруженную опухоль измеряли по максимальному диаметру, раз в неделю, штангенциркулем и отмечали максимальный диаметр (в см) на специальной схеме (рис. 7). За ростом опухолей и другими патологическими изменениями следили до естественной гибели животных. При оценке динамики выживаемости рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) всех животных, а также 10% максимально проживших мышей, медиану и максимальную продолжительность жизни. При расчете кинетических параметров популяцио иного старения использовали модель Гомперца для функции выживания: S(x) = expj - —[ехр(ох) -1] , где параметры аир связаны с популяционнои скоростью старения и начальной силой смертности, соответственно. Параметр а часто характеризуется также величиной времени удвоения силы смертности (mortality rate doubling time, MRDT), рассчитываемой как In (2)/a. Для анализа выживаемости использовали метод Кокса [Сох D.R., Oakes D., 1996]. Всех павших или забитых в состоянии крайней слабости мышей вскрывали. На аутопсии осматривали кожу, молочные железы и все внутренние органы. Выявленные новообразования классифицировали согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака (МАИР) как "фатальные" (то есть, послужившие непосредственной причиной гибели животных) или как «случайные» (в случаях, когда животное погибло от других причин) [Gait J.J., etal., 1986]. Все опухоли у мышей, а также другие патологические изменения и основные внутренние органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, вырезали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки ткани заливали в парафин.
Результаты опытов по изучению влияния метформина на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей HER-2/neu
У животных 1-й группы с возрастом наблюдалось отчетливое увеличение веса тела, и к 9 месяцам самки весили на 66% больше, чем в 3 мес. возрасте. Под воздействием метформина мыши так же набирали вес, который к 9 мес. возрасту на 64% превысил вес 3-месячных животных. Статистически достоверных различий между контрольной и подопытной группами не наблюдалось на всем протяжении опыта, хотя можно отметить некоторую тенденцию к возрастному снижению веса тела мышей под влиянием метформина, по сравнению с контрольной группой. При оценке параметров потребления корма животными 1-й и 2-й групп не отмечено существенных возрастных изменений, как внутри каждой отдельно взятой группы, так и при сравнении между собой (табл. 8). Однако, выявлена тенденция к уменьшению количества поглощенного корма под воздействием метформина. Таким образом, длительное введение метформина трансгенным мышам HER-2/neu существенно не влияло на возрастное изменение массы тела, количества потребляемого корма и жидкости. При введении метформина трансгенным мышам отмечено увеличение продолжительности ЭЦ (с 5,5 ± 0,47 сут. у 5 мес. контрольных мышей, до 8,8 ± 0,83 сут. у подопытных животных того же возраста), при этом частота иррегулярных циклов по сравнению с контролем практически не менялась (42% и 52% соответственно). При изучении возрастного изменения температуры тела мышей оказалось, что у 7 мес. животных этот показатель был снижен по сравнению с 2 мес. самками (табл. 10). У мышей, получавших метформин, значительных различий по сравнению с контролем выявить не удалось. Таким образом, хроническое введение метформина существенно не влияло на возрастные изменения эстральной функции и температуры тела трансгенных мышей. В опухолевой ткани контрольных и получавших метформин мышей исследовали экспрессию мРНК, кодирующей лимфоцит-ассоциированные белки гранзим В и перфорин. Экспрессия мРНК этих цитолитических молекул не была обнаружена в контроле, но была существенно увеличена у 4 из 5 мышей получавших метформин (рис. 20). При сравнении денситометрическим методом экспрессии гена перфорина или гранзима В в материале из опухолей молочной железы у мышей, получавших метформин, исследуемые показатели составили 0,2 ±0,1 и 0,4 ± 0,3 усл. ед. соответственно.
Введение метформина сопровождалось замедлением возрастного увеличения уровня глюкозы в крови. У 9-месячных подопытных мышей содержание глюкозы в крови было меньшим, чем в контроле (р 0,05). Под влиянием препарата отмечено также некоторое уменьшение уровня триглицеридов у животных в возрасте 5 и 9 мес. У 5-месячных мышей, получавших метформин, снижалось и содержание суммарных липопротеидов по сравнению с контролем (табл. 12). Средний латентный период развития ОМЖ у подопытных мышей был статистически достоверно увеличен по сравнению с контролем (табл. 14). Частота развития аденокарцином молочной железы у мышей, несущих ген HER-2/neu, составила 100% в обеих группах. Не различались существенно между группами количество и множественность новообразований, а также частота метастазирования опухолей молочной железы в легкие. Число мышей, у которых развилось от 4 до 6 опухолей молочной железы, в группе, получавшей метформин, не отличалось от контроля (8,9% и 9,3%, соответственно), тогда как доля мышей, имевших 9 или 10 опухолей, под влиянием метформина снизилась в 2 раза по сравнению с контролем (с 46,9% до 23,5%, р 0,05). Размеры аденокарцином молочной железы при введении препарата были также достоверно меньшими (р 0,05). В целом, полученные данные свидетельствуют о замедлении под влиянием метформина старения и развития опухолей молочных желез у трансгенных мышей с инкорпорированным геном HER/2-neu. В связи с тем, что данное исследование посвящено изучению влияния антидиабетических препаратов диабенола и метформина на возрастную динамику показателей биологического возраста, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у мышей, целесообразно начинать обсуждение результатов с последовательного анализа эффектов изученных препаратов. При длительном введении нового антидиабетического средства диабенола с питьевой водой аутбредным и генетически модифицированным мышам показано, что препарат существенно не влиял на изменение веса животных линии NMRI, а у трансгенных мышей отмечалась тенденция к снижению веса под воздействием диабенола (см., в частности, рис. 8). Диабенол также не оказывал влияния на потребление корма у мышей NMRI, тогда как у самок HER-2/neu отмечалась тенденция к уменьшению этого показателя (см. рис. 9, табл. 4). В опытах с диабенолом был проведен также анализ количества жидкости, выпиваемой животными обеих линий. Необходимо было изучить, влияет ли этот препарат на потребление жидкости, и определить, поглощают ли мыши диабенол и в какой дозе. В обоих экспериментах (на мышах NMRI и HER-2/neu) не выявлено существенных различий в потреблении жидкости животными подопытной и контрольной групп изученных линий животных (см., в частности, рис. 15). Одним из важных параметров старения являются изменения эстрального цикла. Характерной для возрастных нарушений эстральной функции у мышей являлось снижение числа животных с регулярными эстральными циклами. Диабенол препятствовал этим изменениям, увеличивая процент животных с регулярными эстральными циклами по сравнению с контролем. Подобный эффект отмечен у мышей обеих линий, что наглядно демонстрируется на рис.
