Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Функциональная морфология тучных клеток 12
1.1. Морфо-функциональная характеристика тучных клеток 12
1.2. Биохимические фенотипы тучных клеток 14
1.3. Участие тучных клеток в нейроиммуноэндокринных механизмах возрастной патологии 15
1.4. Тучные клетки и информационные механизмы нарушения межклеточных взаимодействий при гиперпластических процессах 17
1.4.1. Стимуляторы опухолевого роста, продуцируемые тучными клетками 19
1.4.2. Ингибиторы опухолевого роста, продуцируемые тучными клетками 19
1.4.3. Вещества, влияющие на дегрануляцию тучных клеток. 20
1.4.4. Взаимодействие тучных клеток с лимфоцитами и макрофагами 21
1.5. Микроциркуляторное русло как эффекторное звено биологически активных веществ тучных клеток при гиперпластических процессах 22
1.5.1. Активаторы ангиогенеза 22
1.5.2. Ингибиторы ангиогенеза 24
1.6. Фиброкистозные изменения молочной железы как вариант возрастной патологии 25
1.6.1. Фиброкистозные изменения молочной железы: морфологическая характеристика, классификация 25
3.2. Возрастные изменения молочной железы 28
3.3. Гистологические варианты фиброкистозных изменений молочной железы 31
Результаты собственных исследований 36
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Характеристика исследуемого материала 35
2.2. Гистологические методы 36
2.3. Гистохимические и иммуногистохимические методы 37
2.4. Количественная оценка результатов исследования 39
2.5. Методы статистической обработки 41
Глава 3. Морфо-функциональные особенности тучных клеток при возрастных изменениях и возрастной патологии молочной железы 42
3.1. Возрастные изменения показателей функциональной активности тучных клеток молочной железы 42
3.2. Изменение функциональной активности тучных клеток при фиброкистозных изменениях молочной железы 44
3.3. Распределение лимфо-макрофагальных инфильтратов в ткани молочной железы в зависимости от функциональной активности тучных клеток у пациенток с фиброкистозны- ми изменениями 48
Глава 4. Особенности васкуляризации ткани при возрастных и фиброкистозных изменениях молочной железы 49
4.1. Гистологические и иммуногистохимические показатели кровоснабжения ткани молочной железы у женщин различного возраста 49
4.2. Кровоснабжение ткани молочной железы при различных формообразовательных процессах в ее эпителиальном компоненте 50
4.3. Гистологические показатели кровоснабжения ткани молочной железы при фиброкистозных изменениях 51
4.4. Эндотелиальный белок CD31 при различных вариантах фиброкистозных изменений молочной железы 55
4.5. Распределение тучных клеток, лимфоцитов и макрофагов в ткани в зависимости от особенностей кровоснабжения молочной железы 60
4.6. Распределение лимфо-макрофагальных инфильтратов в ткани молочной железы у женщин различного возраста 63
Глава 5. Обсуждение результатов 65
Выводы 68
Практические рекомендации 69
Указатель литературы 70
- Морфо-функциональная характеристика тучных клеток
- Возрастные изменения показателей функциональной активности тучных клеток молочной железы
- Гистологические и иммуногистохимические показатели кровоснабжения ткани молочной железы у женщин различного возраста
- Кровоснабжение ткани молочной железы при различных формообразовательных процессах в ее эпителиальном компоненте
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время проблема старения приобрела чрезвычайно важное значение, поскольку за счет увеличения средней продолжительности жизни населения в последние годы наблюдается прогрессирующее старение населения [Анисимов В.Н. и соавт. 1993; Анисимов В.Н., Соловьев М.В. 1999; Анисимов В.Н. и соавт., 2001]. При старении в организме происходят комплексные изменения с нарушением структурно-функциональной организации органов и систем. В основе этого лежит нарушение координационных связей между нервной, иммунной и эндокринной системами, которые, по современным представлениям, осуществляют регуляцию гомеостаза через единые сигнальные молекулы, координирующие межклеточные взаимодействия эндокринным, нейрокринным и паракринным путем [Пальцев М.А., Кветной И.М., 2006]. Изучение нейроиммуноэндокринных механизмов, лежащих в основе регуляции гомеостаза в процессе старения, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001].
Ведущую роль в процессах старения, развивающихся в женском
организме, играют нарушения синтеза и секреции половых гормонов.
Первоначально возрастные изменения затрагивают органы
репродуктивной системы и молочные железы. В молочных железах,
наряду с атрофическими инволютивными изменениями, возрастает частота
встречаемости фиброкистозных изменений, или фиброаденоматоза.
Наличие данного процесса в молочной железе женщин
перименопаузального возраста расценивается некоторыми
исследователями как вариант возрастной нормы, другие авторы считают фиброаденоматоз заболеванием.
Фиброаденоматоз (фиброкистозная болезнь, фиброкистозные изменения) является наиболее часто встречающимся, заболеванием молочной железы у женщин позднего репродуктивного и перименопаузального возраста. По определению ВОЗ (1984), фиброаденоматоз является патологией, характеризующейся широким спектром пролиферативных и регрессивных изменений тканей молочной железы с ненормальным соотношением эпителиального и соединительнотканного компонентов. Точные статистические сведения о заболеваемости отсутствуют. Это связано со своеобразием клинической картины, отсутствием единых диагностических подходов, наличием большого количества классификаций [Коган И.Ю. и соавт., 2005]. По данным разных авторов заболеваемость фиброаденоматозом колеблется от 40 до 96% женщин указанного возрастного периода [Чумаченко П.А., Панкратова Е.С., 1996; Сайф И.Х., 2003; Marchant D J., 2002].
Изучение молекулярных и клеточных механизмов возрастных изменений молочной железы позволит дифференцировать патологические и физиологические процессы, происходящие в данном органе. Оценка морфо-функционального состояния клеток (тучных клеток, лимфоцитов, макрофагов и др.), принимающих участие в паракринной регуляции в условиях нормы и патологии, а также их взаимодействие с микроциркуляторным руслом молочной железы может способствовать расширению представлений о механизмах возрастных гиперпластических процессах в молочной железе.
В последние годы появились новые данные о роли клеток иммунной системы в гиперпластических изменениях, возникающих в молочной железе [Amini R.M., Aaltonen К., Nevanlinna Н. et al., 2007; della Rovere F., Granata A., Familiari D. et al., 2007]. Однако функция тучных клеток в молочной железе все еще мало изучена. Остается открытым вопрос о том, оказывают ли влияние тучные клетки на гиперпластические процессы, ассоциированные со старением в молочной железе. Эти и другие вопросы
регуляции функционирования клеток в ткани молочной железы в нормальных условиях и при развитии возрастной патологии требуют дальнейшего изучения.
Цель работы
Целью диссертационного исследования является изучение морфо-функциональных особенностей тучных клеток молочной железы и их взаимодействие с микроциркуляторным руслом при старении и развитии ассоциированных с возрастом гиперпластических процессов (фиброкистозных изменений молочной железы).
Задачи исследования
В рамках указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи.
Изучить особенности структурно-функциональной организации тучных клеток в ткани молочной железы у женщин различного возраста.
Выявить особенности васкуляризации молочной железы у женщин различных возрастных групп.
Описать изменения поведения тучных клеток молочной железы при развитии в ней гиперпластических процессов, ассоциированных со старением.
Изучить особенности васкуляризации молочной железы при развитии ассоциированных с возрастом нарушений (фиброкистозных изменений).
Выявить морфологические особенности сосудистого компонента молочной железы с фиброкистозными изменениями в зависимости от функциональной активности тучных клеток.
Научная новизна работы
Впервые установлено, что при старении отмечается достоверное сокращение популяции дегранулирующих тучных клеток в молочной железе. Активность дегрануляции тучных клеток зависит как от возраста пациенток, так и от варианта гиперпластического процесса в молочной железе. Впервые детально описана гистологическая и иммуногистохимическая характеристика микроциркуляторного русла молочной железы при непролиферативном, пролиферативном и атипическом вариантах фиброкистозных изменений, ассоциированных со старением. Определены возможные механизмы усиления кровоснабжения при пролиферативном и атипическом вариантах заболевания - при пролиферативном варианте фиброкистозных изменений это связано с вазодилятацией; при атипическом варианте - с новообразованием сосудов. Установлено, что количество дегранулирующих клеток в популяции тучных клеток не влияет на морфологию сосудистого русла молочной железы, а также на локализацию и распределение эндотелиального маркера CD31 в ткани.
Практическая значимость работы
Впервые выявлено, что снижение активности дегрануляции тучных клеток при старении в динамике развития возрастных фиброкистозных изменений молочной железы отражает их участие в нарушении нейроиммуноэндокринных механизмов регуляции общего и локального гомеостаза при старении и может служить дополнительным признаком неблагоприятного течения заболевания.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. С возрастом в популяции тучных клеток происходит снижение их функциональной активности.
\
При атипической форме фиброкистозных изменений молочной железы, которая наиболее часто встречается у женщин старших возрастных групп, наблюдается сокращение популяции дегранулирующих тучных клеток.
У женщин разных возрастных групп с фиброкистозными изменениями молочной железы выявлены отличия в морфо-функциональной организации сосудистого русла. У пациенток с атипическим вариантом фиброкистозных изменений в ткани молочной железы наблюдается новообразование капилляров; у больных с пролиферативным вариантом фиброкистозных изменений кровоснабжение ткани усиливается за счет вазодилятации.
Локализация и распределение эндотелиального маркера CD31 в молочной железе, а также структурно-функциональная организация сосудистого русла не зависят от количества- дегранулирующих тучных клеток в ткани.
Изучение стромально-эпителиальных взаимоотношений в молочной железе показало, что пролиферация эпителиального компонента и увеличение площади экспрессии CD31 сопровождается увеличением частоты встречаемости лимфо-макрофагальных инфильтратов в молочной железе при старении.
Апробация работы и публикации.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 60-й юбилейной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, 2006), на Всероссийскокой конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), на II Российском Медицинском Форуме (Москва, 2007), на конференции «Взаимодействие медицинской науки и практики» (Новополоцк, 2007).
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них статей - 1, тезисов докладов - 4.
Практическое внедрение результатов исследования.
Результаты диссертационной работы внедрены в практику работы патологоанатомического отделения ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на кафедре акушерства и гинекологии Санкт-Петербургского государственного университета им. акад. И.П. Павлова.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 100 страницах печатного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 283 источника, из которых 56 отечественных и 227 зарубежных.
Морфо-функциональная характеристика тучных клеток
Предшественники тучных клеток мигрируют из костного мозга в ткани, где происходит их созревание под влиянием микроокружения [Шехтер А.Б., Серов В.В., 1995; Galli S.J., Geissler E.N., Wershil В.К. et al., 1993; Wilhelm M., King В., Silverman A.J., Silver R., 2004; Theoharides T.C., Conti P., 2004]. При недостатке факторов роста они вступают в апоптоз [Metcalfe D.D., Baram D., Mekori Y.A., 1997].
Незрелые тучные клетки содержат в цитоплазме гранулы с гонадотропин-рилизинг гормоном; в отличие от зрелых клеток сульфатированные протеогликаны в них отсутствуют [Zhuang X., Silverman A J., Silver R., 1997].
Зрелые тучные клетки имеют диаметр 9 — 16 мкм, овальную или округлую форму; в цитоплазме находятся метахроматически окрашивающиеся гранулы [Czarnetzki В.М., Figdor C.G., Kolde G. et al. 1984]. Эти гранулы содержат гистамин, сульфатированные гликозаминогликаны (в том числе гепарин и хондроитинсульфаты), протеазы и хемоаттрактанты [Godfrey W.A., 1987]. Ядро тучной клетки билопастное, в периферических отделах не содержит хроматина, что с одной стороны делает его сходным с ядром плазмацита, а с другой с ядром базофила. При электронномикроскопическом исследовании было обнаружено, что в этих клетках отсутствуют характерные для базофилов цитоплазматические отложения гликогена, а плазматическая мембрана более складчатая [Godfrey W.A., 1987]. На поверхности тучных клеток расположены рецепторы к иммуноглобулину Е (IgE), при активации которых происходит дегрануляция [Шмидт Р., Тевс Г., 1996].
Тучные клетки обнаружены в соединительной ткани практически всех органов. Зрелые тучные клетки располагаются, как правило, периваскулярно и периневрально [Heath D., Lowe P., Smith P., 1987; Metcalfe D.D., Baram D., Mekori Y.A., 1997]. В зависимости от органной и тканевой локализации они имеют различные функции [Godfrey W.A., 1987] и могут синтезировать определенный спектр биологически активных веществ. В 1994 году Н. Akasu и О. Kawanami описали тучные клетки слизистых оболочек (ММС - mucosal mast cells) и тучные клетки соединительной ткани (СТМС - connective tissue mast cells), физиологическая роль которых была различна.
В работе М. Wilhelm и соавторов (2000) приведена морфологическая классификация тучных клеток, в соответствии с которой выделяют пять типов клеток.
1) Покоящиеся (resting mast cells) - содержат ядро и округлые темные гранулы в цитоплазме, часть из которых имеет полулунное просветление на периферии.
2) Начинающие дегранулировать (initiation of degranulation) - эти клетки утрачивают гранулярность цитоплазмы; на этой стадии происходит инициация экзоцитоза.
3) Полностью дегранулировавшие (fully degranulated) - содержат диффузно расположенные, сливающиеся друг с другом гранулы. После слияния, первого экзоцитозного пузырька (гранулы) с плазмалеммой, образуется пора, через которую из клетки выхолят все, оставшиеся в цитоплазме, гранулы.
4) Частично секретирующие (piecemeal secretion) - эти клетки характеризуются особым типом секреции, при котором не происходит классической дегрануляции. R. Letourneau и соавторы (1996) назвали такой тип секреции «избирательной» (differential release); синонимами являются также термины «внутрижелезистая активация» (intraglandular activation) и «частичная дегрануляция» (piecemeal degratulation). Фенотипически частично секретирующие тучные клетки отличаются наличием светлых гранул с темной сердцевиной. M.S. Kaminer и соавторы (1995) указывали на наличие таких клеток при буллезном пемфигоиде. J.W. Coleman (2002) описал тучные клетки с данным типом секреции при склеродермии и интерстициальном цистите и назвал их «фантомными тучными клетками» (phantom mast cells). Механизм избирательной секреции связан с транспортом микровезикул, которые после слияния с различными участками празматической мембраны клетки, высвобождают, содержащиеся в них вещества (Kaminer M.S., Murphy G.F., Zweiman В., Lavker R.M., 1995).
5) Ресинтезирующие тучные клетки (resynthesizing mast cells) - имеют развитый аппарат Гольджи.
По биохимическому составу выделяют два типа тучных клеток: первый содержит ферменты триптазу и химазу, это так называемые ТС тучные клетки, которые располагаются в соединительной ткани; второй только триптазу - Т-тучные клетки, которые локализованы в слизистых оболочках [Theoharides Т.С., Conti P., 2004]. Эти два типа клеток отличаются по количеству и качественному составу цитоплазматических секреторных гранул, а также по способности реагировать на различные стимулы. ТС-тучные клетки, в отличие от Т-тучных клеток, содержат большее количество гепарина и чувствительны к действию нейропептидов. Т-тучные клетки более богаты хондроитинсульфатами и резистентны к действию нейропептидов.
Возрастные изменения показателей функциональной активности тучных клеток молочной железы
Анализ проведенных нами исследований по изучению морфо-функциональных особенностей тучных клеток молочной железы и их взаимодействию с микроциркуляторным руслом у женщин различного возраста и при развитии ассоциированных с возрастом нарушений (фиброкистозных изменений молочной железы) позволил определить ряд факторов, играющих значительную роль в механизмах возрастных изменений и возрастной патологии молочной железы.
Нами установлено, что с возрастом происходит снижение доли дегранулирующих клеток в общей популяции тучных клеток, находящихся в соединительнотканном компоненте молочной железы. Подобные изменения отмечаются и при появлении признаков атипической пролиферации эпителия при фиброкистозных изменениях. Выброс биологически активных веществ без классической дегрануляции происходит путем микровезикулярного транспорта [Kaminer M.S., Murphy G.F., Zweiman В., Lavker R.M., 1995]. Отсутствие дегрануляции не обязательно сопровождается снижением функциональной активности тучных клеток, напротив, это может свидетельствовать об активном участии тучных клеток, как в физиологических, так и в патологических процессах, разворачивающихся в тканях. В связи с этим представляется интересным изучение взаимодействия сигнальных молекул, высвобождающихся из тучных клеток путем «избирательной секреции», с клетками стромы и эпителием молочной железы.
Данные вещества могут обладать ангиогенными свойствами, что, возможно, обусловливает появление большого количества новообразованных сосудов при атипическом варианте фиброкистозных изменений.
Нами было показано отсутствие зависимости между степенью васкуляризации ткани молочной железы и количеством дегранулирующих тучных клеток. Таким образом, можно предположить, что изменение площади сосудов при пролиферативном варианте фиброкистозных изменений, связанное с вазодилатацией, является следствием выброса гистамина из дегранулирующих тучных клеток. Атипический вариант фиброкистозных изменений, скорее всего, связан с переходом тучных клеток на другой тип секреции с выделением в окружающее пространство совершенно нового спектра биологически активных веществ, изменяющих метаболические процессы в тканях.
Сигналы, регулирующие межклеточные взаимодействия, поступают, не только от тучных клеток, но также от эпителиальных, стромальных, иммунных клеток [Dragovich Т., Rudin СМ., Thompson СВ., 1998; Wiseman B.S., Werb Z., 2002]. В результате проведенных исследований, было установлено, что частота встречаемости перидуктальных, перилобулярных и периваскулярных лимфо-макрофагальных инфильтратов в ткани молочной железы с усилением активности пролиферации эпителия возрастет. В литературе нет единого мнения, о роли лимфоцитов и макрофагов в регуляции гиперпластических, в том числе опухолевых процессов. Некоторые исследователи считают, что мононуклеарная инфильтрация в опухолях молочной железы способствуют улучшению течения болезни [Dobrzanski M.J., Reome J.B., Hylind J.C. et al., 2006; Loughlin P.M., Cooke T.G., George W.D. et al., 2007], другие утверждают обратное [Almholt К. et al., 2003].
В пользу участия лимфоцитов и макрофагов в супрессии опухолевой пролиферации свидетельствует участие клеточных и гуморальных механизмов в реализации противоопухолевого иммунитета [Петров Р.В., 1987]. Кроме того, на молекулярном уровне было показано наличие в ядрах лимфоцитов р эстрогеновых рецепторов (PER). PER рассматриваются как возможные туморсупрессоры, регулирующие функцию миоэпителиальных клеток [McDonnell D.P., Norris J.D., 2002; Carder P.J., Murphy C.E., DervanP., 2005; Mussi P., Liao L., Park S.E., Ciana P. et al., 2006]. Аргументом в пользу стимуляции опухолевой прогрессии являются наблюдения A.Noel и J.M. Foidart (1998), в исследовании которых было показано ухудшение прогноза у пациенток раком молочной железы с большим содержанием в опухолевой ткани клеток воспалительного ряда.
Источником лимфоцитов и макрофагов является сосудистое русло. Клетки мигрируют из кровотока в ткань молочной железы в ответ на появление хемоаттрактантов, которые выделяются тучными, эндотелиальными, эпителиальными клетками и фибробластами [Godfrey W.A., 1987]. Данный факт наглядно иллюстрируется результатами нашего исследования: при увеличении площади СОЗІ-иммунопозитивного эндотелия молочной железы было обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости лимфо-макрофагальных инфильтратов.
Спорным является вопрос о причине появления лимфо-макрофагальных инфильтратов в ткани молочной железы прш фиброкистозных изменениях. Еще в 1893 году P. Koning описал данную патологию как «хронический кистозный мастит». В исследованиях последних лет обсуждается роль воспалительных процессов в развитии фиброкистозных изменений молочной железы [Сайф И.Х., 2003]. Логичным является предположение о том, что появление клеток, макрофагального ряда и лимфоцитов в ткани железы свидетельствуют о. течении хронического воспалительного процесса [Cheatle G.L., Culter В.М., 1928]. Однако наблюдаемая воспалительная реакция не является следствием ранее перенесенного острого мастита, поскольку зависимости между наличием лимфо-макрофагальных инфильтратов в ткани молочной железы и маститом в анамнезе пациенток обнаружено не было. Возможно, появление признаков воспаления связано с изменением антигенного состава клеток при гиперпластических процессах.
Гистологические и иммуногистохимические показатели кровоснабжения ткани молочной железы у женщин различного возраста
Изучение количества и функциональной активности тучных клеток выполнено с помощью гистохимической окраски толуидиновым синим, позволяющей выявлять гистаминсодержащие гранулы.
Для изучения сосудистого компонента молочной железы был использован маркер эндотелиальных клеток CD31 (РЕСАМ-1 -platelet/endothelial cells adhesion molecule).
Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma). Первичными антителами были моноклональные мышиные антитела к CD - 31, Clone JC70A (1:20, Dako). В качестве вторых антител использовали универсальный набор фирмы «Dako», содержащий биотинилированные анти-мышиные и антикроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от фирмы «Dako»). В качестве позитивного контроля использована ткань почки. Негативный контроль выполнен с применением блокирующей сыворотки (DAKO LSAB 2 kit).
Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапныи протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 7.6.
Методика для визуализации экспрессии CD31 выполнялась по следующей схеме [Петров СВ., Райхлин Н.Т., 2004]. 1. Стекла со срезами помещали в термостат (+56 С) на 30 мин. 2. Для депарафинизации и дегидратации стекла последовательно помещали в следующие жидкости: ксилол, ксилол, спирт 96%, спирт 96%, спирт 96%, спирт 75% (по 3 мин. в каждом растворителе). 3. Промывка в дистиллированной воде 3 мин. 4. Кипячение в 0,01 М нитратном буфере рН 6.0. Контейнер со стеклами помещали в скороварку с кипящим буфером так, чтобы стекла полностью были покрыты буфером. Кипятили срезы под давлением (0,34 атм.) в течение 1,5-2 мин. 5. Остывание и промывка срезов. После кипячения скороварку помещали под струю холодной воды. После падения давления и температуры контейнер со стеклами ставили в дистиллированную воду на 1 мин., после этого - в рабочий TpHC-NaCl-буфер на 15 мин. 6. Блокада эндогенной пероксидазы: контейнер со стеклами помещали в 3% водный раствор перекиси водорода на 10 мин. при комнатной температуре. 7. Промывка в дистиллированной воде по 5 мин. 2 раза 8. Промывка в TpHC-NaCl-буфере рН 7.6 по 5 мин. 2 раза 9. Инкубация с нормальной неиммунной сывороткой в течение 30 мин. при комнатной температуре. Наносили 50 мкл нормальной блокирующей сыворотки и помещали во влажную камеру. 10. Инкубация с первыми (специфичными) антителами во влажной камере в течение 1 часа в термостате при +37 С. Со стекол стряхивали нормальную сыворотку и наносили 50 мкл первых (специфичных) антител. 11.Промывка в TpHC-NaCl-буфере рН 7.6 по 5 мин. 2 раза 12. Инкубация со вторыми биотинилированными антителами в течение 30 мин. при комнатной температуре. 13. Промывка в TpHC-NaCl-буфере рН 7.6 по 5 мин. 2 раза 14. Инкубация с ABC-kit 30 мин. при комнатной температуре. 15. Промывка в TpHC-NaCl-буфере рН 7.6 по 5 мин. 2 раза 16. Выявление пероксидазы хрена диаминобензидином (раствор готовили непосредственно перед употреблением по инструкции, прилагающейся к набору). Проявление реакции контролировали под микроскопом. 17. Промывка в дистиллированной воде по 5 мин. 2 раза 18. Докрашивание срезов гематоксилином Майера в течение 1 мин. 19. Промывка водой - 15 мин. 20. Дегидратация - 12 мин. Стекла последовательно помещали в следующие жидкости: спирт 96%, спирт 96%, ксилол, ксилол. В каждом растворителе по 3 мин. 21. Заключение в синтетическую среду (Novomount Permanent Slide, Novocastra) .
Кровоснабжение ткани молочной железы при различных формообразовательных процессах в ее эпителиальном компоненте
Количественную оценку результатов исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4, программного обеспечения «АСТ-1» (версия 2.12) и «Видеотест-Морфология» (версия 4.0).
Определение количества и площади сосудов, в зависимости от возраста пациенток и формы доброкачественной гиперплазии, а также наличие лимфо-макрофагальных инфильтратов, выполнено на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином при увеличении хЮО. Площадь сосудистого русла молочной железы рассчитывали как отношение площади поперечных срезов сосудов к площади поля зрения препарата в процентах. Этот показатель определяли в пяти наиболее представительных полях зрения с последующим выведением среднего значения.
Площадь и показатель «интенсивности» окрашивания продуктов иммуногистохимической реакции с антителами к эндотелиальному белку CD31 и гистохимической реакции гистамина тучных клеток с толуидиновым синим определяли при увеличении 600х также в пяти наиболее представительных полях зрения с последующим выведением среднего значения. Фотосъемку производили с открытием апертурной диафрагмы - 0,3, при поднятом конденсоре, в режиме - Photo, позиция освещения - II. Фотографирование осуществляли в программе АСТ-1, версия 2.12: время экспозиции - 1/100 с; чувствительность камеры — максимальная; баланс цветов - красный (R)=0, зеленый (G)=0, синий (В)=0. Устанавливали размер изображения 1280x1024, что дает разрешение 1,3 миллиона пикселей. Изображения сохраняли с расширением Jpeg (Fine).
Количественный анализ полученных цифровых микрофотографий, осуществляли в программе «Видеотест-Морфология 4.0», используя f методику «Подсчет и измерения», в режиме обработки черно-белого изображения (режим «Gray»). Все абсолютные показатели были измерены в пикселях.
Площадь СВ31-иммунопозитивного эндотелия (S, %) вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата.
Показатель «интенсивности» окрашивания продуктов гистохимической и иммуногистохимической реакций определяли по следующим формулам: локальная «интенсивность» окрашивания рассчитывалась по формуле: Вл = 1ё(1фЛо)" , і ] где: Бл — локальная «интенсивность» окрашивания; 1ф - средняя яркость , фона микрофотографии; 1о - яркость объекта в точке; интегральная «интенсивность» окрашивания рассчитывалась по формуле:
Би = Е л Л CD31 и гистохимической реакции гистамина тучных клеток с толуидиновым синим определяли при увеличении 600х также в пяти наиболее представительных полях зрения с последующим выведением среднего значения. Фотосъемку производили с открытием апертурной диафрагмы - 0,3, при поднятом конденсоре, в режиме - Photo, позиция освещения - II. Фотографирование осуществляли в программе АСТ-1, версия 2.12: время экспозиции - 1/100 с; чувствительность камеры -максимальная; баланс цветов - красный (R)=0, зеленый (G)=0, синий (В)=0. Устанавливали размер изображения 1280x1024, что дает разрешение 1,3 миллиона пикселей. Изображения сохраняли с расширением Jpeg (Fine).
Количественный анализ полученных цифровых микрофотографий, осуществляли в программе «Видеотест-Морфология 4.0», используя методику «Подсчет и измерения», в режиме обработки черно-белого изображения (режим «Gray»). Все абсолютные показатели были измерены в пикселях.
Площадь СБ31-иммунопозитивного эндотелия (S, %) вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата.
Показатель «интенсивности» окрашивания продуктов гистохимической и иммуногистохимической реакций определяли по следующим формулам: локальная «интенсивность» окрашивания рассчитывалась по формуле: Бл = 1ё(1ф/1о) -\ где: Бл - локальная «интенсивность» окрашивания; 1ф - средняя яркость фона микрофотографии; 1о - яркость объекта в точке; интегральная «интенсивность» окрашивания рассчитывалась по формуле: Би = 2Рл _1, где: DH - интегральная «интенсивность» окрашивания, которая обратно пропорциональна сумме локальных плотностей всех точек (пикселей) объекта; средняя «интенсивность» окрашивания рассчитывалась по формуле: DC = DH/N-\ где: Dc - средняя «интенсивность» окрашивания; N - количество точек изображения (пикселей), принадлежащих объекту (клетке).
