Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы старения кожи (обзор литературы) 8
1.1. Основные теории старения организма 8
1.2. Фундаментальные аспекты старения кожи 11
1.2.1. Роль УФ-излучения в механизмах старения кожи 12
1.2.2. Изменение экспрессии генов при естественном и фотоиндуцированном старении кожи 16
1.2.3. Роль апоптоза в механизмах старения кожи 17
1.2.4. Роль дисфункции эндокринной системы в механизмах старения кожи 20
1.3. Морфофункциональная характеристика некоторых структурных элементов
эпидермиса и дермы и их роль в старении кожи 22
1.3.1. Роль дермальных фибробластов в старении кожи 32
1.3.2. Клинические и морфологические признаки хронологического старения кожи 35
1.3.3. Клинические и морфологические признаки фотостарения кожи 37
1.4. Участие кератиноцитов и фибробластов в межклеточных и клеточно-стромальных взаимодействиях, их роль в механизмах старения кожи 41
Глава 2. Материал и методы исследования 49
2.1. Клиническая характеристика обследованных лиц 49
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Культивирование фибробластов дермы 52
2.2.2. Гистологическое исследование кожи 53
2.2.2.1. Окрашивание гематоксилином и эозином 54
2.2.2.2. Окрашивание гематоксилином и пикрофуксином по Ван-Гизону 55
2.2.2.3. Окрашивание орсеином по Тенцеру-Унна 55
2.2.2.4. Окрашивание альциановым синим по Steedman 55
2.2.3. Иммуногистохимическое исследование кожи 56
2.2.4. Статистический анализ результатов 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 60
3.1. Особенности культивирования эмбриональных фибробластов и фибробластов дермы пациенток различных возрастов 61
3.2. Морфологические особенности изменений кожи у пациенток в зависимости от возраста, состояния репродуктивной системы и локализации кожного биоптата 61
3.2.1. Структурные особенности биоптатов кожи у пациенток различных возрастов 61
3.2.2. Структурные особенности биоптатов кожи у пациенток в зависимости от состояния репродуктивной системы 65
3.2.3. Структурные особенности биоптатов кожи у пациенток в зависимости от локализации кожного биоптата 69
3.3. Особенности экспрессии маркёров апоптоза клетками эпидермиса кожи пациенток различных возрастов 79
Глава 4. CLASS Обсуждение результато CLASS в 85
Выводы 112
Список литературы 113
- Изменение экспрессии генов при естественном и фотоиндуцированном старении кожи
- Клинические и морфологические признаки фотостарения кожи
- Гистологическое исследование кожи
- Морфологические особенности изменений кожи у пациенток в зависимости от возраста, состояния репродуктивной системы и локализации кожного биоптата
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время прослеживается явная тенденция к увеличению в составе населения лиц пожилого и старческого возраста. Их доля в популяции во многих странах превысила 20%. Профилактика старения является одним из наиболее активно и динамично формирующихся в последнее время новых направлений медицины. Это обусловлено сложностью и социально-экономической значимостью проблемы старения населения в современном мире (Анисимов В.Н., 1999; Крутько В.А., 2000; Гончарова Н.Д. и соавт., 2002; Wulf Н.С., 2004).
Представленные в научной литературе данные в отношении различных гипотез старения организма можно объединить в несколько групп. Первая группа теорий основывается на генетических факторах (теории генетического контроля, «предела делений», митохондриальная теория старения, теломеразная теория и др.). Вторая группа теорий объясняет старение воздействием внешних факторов (теория износа систем, теория свободных радикалов, теория износа иммунной системы). Третья группа теорий, в качестве определяющих рассматривает изменения в нейроэндокринной системе, энергетический дисбаланс и др. (Fisher G.J., 2002; Турова Е.А., 2007). Но все указанные гипотезы рассматривают старение как процесс структурно-функциональных изменений организма, протекающий длительно и неравномерно, затрагивающий как внутренние органы и системы, так и ткани, определяющие внешний облик человека (Мареева Е.Б., 1995).
Важную роль в механизмах общего биологического процесса старения организма играет старение кожи. С одной стороны, механизмы старения кожных покровов определяются общими для всего организма обменными, структурными и функциональными изменениями, и состояние кожи в целом может свидетельствовать о степени старения организма. С другой стороны, кожа является органом, постоянно контактирующим с внешней средой, в результате чего признаки её старения могут появляться значительно раньше, чем в других органах (Ткаченко СБ., Потекаев Н.Н., 2003; Смирнова И.О., 2004). Таким образом, старение кожи связано с общим процессом старения организма, детерминированным генетически (естественное старение) и агрессивным
5 воздействием факторов внешней среды, среди которых наиболее разрушительным является УФ-излучение (фотостарение) (Хертель Б., 2000).
Процесс старения кожи затрагивает сложный комплекс межклеточных взаимодействий в коже, опосредованный анатомическими контактами и широким спектром сигнальных молекул (Kosmadaki M.G., Gilchrest В.А., 2004; Смирнова И.О. и соавт., 2005). Хорошо известно, что основной клеткой дермы является фибробласт, ему принадлежит ключевая роль в нормальном функционировании и состоянии соединительнотканной основы кожи. Согласованная работа фибробластов с другими компонентами эпидермиса, дермы и сосудистого русла, регуляция микроокружения и клеточно-матриксных отношений в значительной степени определяют их способность поддерживать гомеостаз кожи и реагировать на воздействие внешней и внутренней среды (Серов В.В., 1981; Мартынов А.И. и соавт., 1998; Быков В.Л., 2004).
Однако особенности взаимоотношений дермальных фибробластов и эпндермальных кератиноцитов, а также динамика возрастных морфологических изменений компонентов эпидермиса и дермы остаются недостаточно изученными (Oikarinen Л., 1994; Tzaphlidou М., 2004), что обосновывает целесообразность детального рассмотрения изменений клеточно-матриксных взаимоотношений в коже при хронологическом и фотоиндуцированном старении кожи.
Цели и задачи исследования. Цель работы - установить роль нарушений клеточно-матриксных взаимоотношений в коже у женщин при её хронологическом и фотоиндуцированном старении.
Предпринятое исследование было сосредоточено на решении следующих основных задач:
Определить роль изменений пролпферативного потенциала фибробластов дермы в механизмах старения кожи.
Установить закономерности изменений структуры дермы и эпидермиса при естественном и фотоиндуцированном старении кожи у женщин.
Оценить особенности экспрессии белков-маркеров апоптоза (р53, bcl-2, Ьах) кератиноцитами при старении кожи.
4. Выявить общие закономерности и особенности клеточно-матриксных
взаимоотношений в коже у женщин при её хронологическом и фотоиндуцированном старении.
Основные положения, выносимые на защиту:
Механизмы нарушения клеточно-матриксных взаимодействий в коже при ее хронологическом и фотоиндуцированном старении сопряжены со снижением пролиферативного потенциала дермальных фибробластов.
Возрастные изменения кожи характеризуются структурно-функциональными изменениями внеклеточного матрикса — дегенерацией коллагеновых и эластиновых волокон, очаговым распределением гликозаминогликанов в дерме, степень которых наиболее значима при фотоиндуцированном старении.
При старении кожи происходит дизрегуляция программированной гибели клеток эпидермиса, проявляющаяся увеличением уровня экспрессии белков-маркеров апоптоза (р53, Ьах).
Научная новизна. Впервые с привлечением комплекса современных культуральных, гистологических и иммуногистохимических методов исследования выявлены общие закономерности и особенности нарушений клеточно-матриксных взаимоотношений в коже при хронологическом и фотоиндуцированном старении.
Показано, что признаки хронологического, гормонального и фотоиндуцированного старения кожи выражены во всех структурных компонентах эпидермиса и дермы, степень выраженности которых наиболее значима при хронической инсоляции.
Установлено, что нарушение клеточно-матриксных взаимоотношений в коже при ее старении связано со снижением пролиферативного потенциала дермальных фибробластов.
Выявлено, что степень дегенерации коллагеновых волокон дермы в большей мере зависит от влияния хронической инсоляции, чем от возраста и состояния репродуктивной системы, а эластиновых волокон дермы - от влияния хронической инсоляции и состояния репродуктивной системы пациенток, чем от возраста.
Показано, что для возрастных изменений кожи характерно увеличение содержания белков-маркёров апоптоза (р53 и Ьах) в кератиноцитах эпидермиса.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые данные фундаментального характера о комплексных изменениях структурных компонентов эпидермиса и дермы, раскрывающие новые аспекты молекулярных и клеточных механизмов старения кожи. Показано, что хроническая инсоляция является фактором риска преждевременного старения кожи, реализуемого на уровне эпидермиса и дермы. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о целесообразности разработки патогенетически обоснованных мер профилактики хронологического и фотоиндуцированного старения кожных покровов, направленных на все структурные компоненты эпидермиса и дермы.
Реализация и апробации диссертации. Результаты исследований используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Общая патология клетки», «Механизмы старения», «Роль апоптоза в норме и при патологии»), дерматовенерологии (разделы «Фотодерматиты», «Экраны от солнца и профилактика рака кожи», «Фотостарение кожи»). Основные положения диссертации представлены на V Сибирском физиологическом съезде (г. Томск, 2005) и на Всероссийской конференции «Первые результаты реформы здравоохранения и задачи кожно-венерологических учреждений на переходный период» (г. Екатеринбург, 2005).
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 248 источников (105 -отечественных и 143 - иностранных).
Изменение экспрессии генов при естественном и фотоиндуцированном старении кожи
При исследовании культур кератиноцитов людей различных возрастов было показано, что хроно- и фотоиндуцированное старение вызывает изменение экспрессии генов, отвечающих за процессы роста и дифференцировки клеток кожи, иммунный ответ и устойчивость кожи к различным видам повреждения (Garmyn М. et al., 1992). Доказано, что молодые клетки кожи более чувствительны к различным видам внешних сигналов, которые через активацию мембранных рецепторов и/или пути передачи сигналов запускают сложный каскад реакций, ведущих к включению или подавлению определённых генов, в результате чего клетка отвечает на сигнал специфическим образом. Напротив, старые клетки і обладают прогрессирующей нечувствительностью к действию внешних факторов, что, в конечном счете, может привести клетку к гибели (Хертель Б., 2000).
Факторы естественного и фотоиндуцированного старения могут подавлять или, наоборот, активизировать экспрессию генов, кодирующих как белки-супрессоры, так и белки-промоторы развития опухолей, что неизбежно влияет на размножение и дифференцировку клеток и может привести к злокачественному перерождению клетки (Bigler C.F. et al., 1992).
Исследования последних лет установили, что при фотостарении происходят разнонаправленные изменения экспрессии генов кератина К1, протеина, подобного кальмодулину, некоторых интегринов, а также генов, связанных с угнетением клеточного цикла и репарацией ДНК - GADD 153 и MSH-2, протоонкогенов - c-mys, c-fos и c-jun. Следствием этого являются нарушения структуры десмоплакинов, выстилающих клеточную мембрану кератиноцитов и изменения по соотношению различных кератинов, что приводит к ослаблению адгезивных свойств кератиноцитов и повышению их пролиферативной активности (Смирнова И.О., Кветной И.М., 2004). По данным некоторых исследователей, УФ-излучение типа А ведёт к усилению экспрессии гена c-fos и внутриядерной аккумуляции фосфорилированного протеина c-fos, в связи с чем степень его специфического иммунноокрашивания при фотостарении повышается почти в 4 раза, а при хронологическом старении — снижается. Фотоповреждение эпидермиса может приводить к формированию активированного комплекса АР-1, действие которого связано с активацией рецепторов к факторам роста и цитокинам, а также с усилением клеточной пролиферации. Транскрипционный фактор АР-1 играет важную роль в регуляции экспрессии и продуцировании фактора роста кератиноцитов фибробластами (Fisher G.J., Voorhees J J., 1998).
Установлено, что УФ-излучение типа В индуцирует специфические мутации в гене, кодирующем белок р53, который регулирует репарацию повреждённой ДНК и апоптоз повреждённых клеток. Обнаружено, что УФ инициирует синтез этого белка, который блокирует репликацию ДНК в повреждённых кератиноцитах, что сводит к минимуму проявление генетических мутаций в следующем поколении клеток. При повреждении гена, кодирующего этот белок, блокирования деления клеток не происходит. При этом увеличивается вероятность выживания мутантных клеток, что и является причиной развития рака кожи. По этой причине мутации гена р53 были выбраны как основной маркер канцерогенного действия УФ (Тимофеев Г., 2005)
В настоящее время не вызывает сомнения существенная роль, которую играет апоптоз в старении организма в целом, а также в развитии возрастной патологии (Nunez G. et al., 1998). Как известно, апоптоз - программированная гибель клетки, выполняющая ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза (Lane D.P., 1992).
На клеточном уровне важным эффектом является прогрессирующая утрата способности адекватно отвечать на сигнал апоптоза, что приводит к накоплению повреждённых клеток в организме. Таким образом, полом механизма регуляции апоптоза является одной из составляющих естественного старения организма (Жижина Г.П., 2002). В живых клетках организма, включая клетки кожи человека, содержится протеин р53, кодируемый геном Р53. Получая сигналы о клеточном повреждении, белок р53 либо останавливает клеточный цикл для репарации генома, либо индуцирует апоптотическую гибель клетки. Активированный белок р53 одновременно осуществляет индукцию белков-промоторов апоптоза bax, bak и bad, а также репрессию белков-ингибиторов апоптоза bcl-2 и ЬСІ-XL (Adams J.M. et al., 1998; Chao D.T. et al., 1998; Reed J.S., 1998). Таким образом, дисбаланс между экспрессией генов белков, отвечающих за выживаемость клеток, и семейства белков, ответственных за гибель клеток (Nakagawa К. et al., 1994; Jost М. et al., 1999), является механизмом, контролирующим апоптоз клеток кожи.
Доказано, что одной из функций гена р53 является контроль репликативного старения клеток. В старых клетках наблюдается активация этого гена с включением механизма апоптоза с последующей элиминацией повреждённой клетки. Напротив, инактивация р53 приводит к тому, что клетки продолжают неограниченно пролиферировать (Green D.R. et al., 2000).
Как видно, апоптоз имеет прямое отношение к регуляции состояния кожных покровов человека. Жизнеспособность клеток эпидермиса зависит от баланса факторов выживания и источников апоптотических сигналов. Наиболее важным фактором выживания кератиноцитов является инсулиноподобный фактор роста IGF-1, который поддерживает жизнеспособность клеток эпидермиса, вызывая внутриклеточный синтез белка с98, родственного факторам семейства bcl-2 (Ярилин А.А., 2004).
Апоптоз является ведущим механизмом, определяющим пролиферацию кератиноцитов с целью поддержания постоянного уровня толщины эпидермиса. Программированная клеточная гибель кератиноцитов развивается по рецепторному Fas-зависимому механизму: Fas-рецептор (специализированный рецептор, передающий сигнал к развитию апоптоза) появляется на них по мере перемещения в наружные слои эпидермиса, а источником Fas-лиганда служат активированные эпидермальные Т-клетки (Ярилин А.А., 2004; Прохоренков В.И. и соавт., 2005). От преждевременной гибели по этому механизму кератиноциты защищаются, благодаря высокой экспрессии противоапоптотических факторов bcl-2 и ЬСІ-XL. Среди естественных индукторов апоптоза клеток кожи основным является УФ-излучение. Основным механизмом включения апоптоза при этом служат активные формы оксида азота, выработка которого усиливается благодаря активации индуцибельной NO-синтетазы (Weller R., 2003). Кроме этого, под влиянием ультрафиолета происходит кластеризация Fas-рецептора на поверхности эпидермальных клеток, что приводит к генерации апоптотического сигнала без связывания Fas-лиганда.
Многие исследователи указывают на накопление в дерме с возрастом стареющих фибробластов, отличающихся устойчивостью по отношению к пролиферативным и проапоптотическим сигналам (Wang Е., 1995). Причём, последний эффект обусловлен, в первую очередь, повышением экспрессии bcl-2 и репрессией генов Gi фазы. Резистентность фибробластов к апоптозу может являться одним из факторов, способствующих накоплению клеток с повреждениями ядерной и митохондриальной ДНК, являющихся маркёрами хроно-и фотостарения (Balajee A.S. et al., 1998).
Клинические и морфологические признаки фотостарения кожи
Кожа, в отличие от других органов, существующих в сбалансированной внутренней среде организма, находится в особом положении, поскольку представляет собой «линию первого контакта» с внешней средой. Поэтому в коже, непосредственно подверженной многочисленным внешним влияниям, регрессивные изменения обнаруживаются раньше, чем в других органах (Benedetto A.V., 1998; Yin L. et al., 2001). Наиболее значимым экзогенным фактором является УФО. Фотостарение кожи является комплексным биологическим процессом, разворачивающимся в различных слоях кожи с наибольшим повреждением соединительной ткани дермы (Wulf Н.С. et al., 2004).
Клинически фотостарение характеризуется потерей эластичности кожи, её грубым, подчёркнутым рисунком, желтоватым цветом, повышенной шершавостью и сухостью, неравномерной гиперпигментацией, глубокой морщинистостью, телеангиэктазиями (Kligman A.M., 1986). В роговом слое обнаруживаются признаки гиперкератоза, в результате чего он утолщается. Изменения в эпидермисе могут варьироваться от гипертрофии до атрофии, появляются атипичные кератиноциты (Хертель Б., 1999; Акилов О., 2002). Отмечается, что кератиноциты участков кожи, подверженных хронической инсоляции, характеризуются высокой пролиферативной активностью (Lee J.H. et al., 2002) и повышенной чувствительностью к действию некоторых биологических факторов (Фитцпатрик Д.Е., 1999). Это связано с особенностями экспрессии генов, вовлечённых в процессы роста и дифференцировки клеток и отвечающих за устойчивость кожи к УФО (Garrayn М. et al., 1995).
В целом, вследствие хронической стимуляции кожи УФ-излучением отмечается утолщение эпидермиса, и только в конечной стадии фотостарения кожи наблюдается атрофия эпидермиса. Кроме того, под воздействием УФ-излучением, как нарушается процесс созревания кератиноцитов, клинически проявляющийся сухостью и шелушением - ксерозом (Калюжная Л.Д., Дзюбак В.Е., 2002). При фотостарении кожи происходит утолщение базалыюй мембраны, отмечается неравномерное распределение вдоль неё различных по размерам, накоплению пигмента и количеству отростков меланоцитов (Gilchrest В.А. et al., 1979), наблюдается значительное увеличение количества этих клеток. Признаками активации меланоцитов служат частые контакты их отростков с повреждёнными кератиноцитами и клетками Лангерганса. Эумелапин - коричневый пигмент меланоцитов — высоко устойчив к действию солнечного света, однако, хроническое облучение кожи может приводить к частичному просветлению пигмента за счёт деструкции хромофоров и деполимеризации меланиновых макромолекул (Коржова Л.П. и соавт., 1999). При этом молекулярная масса и удельная оптическая плотность полимеров пигмента снижается. Кроме того, длительное воздействие ультрафиолета ведёт к появлению в составе ДОПА-меланина слабоокрашенных или бесцветных соединений с низкой молекулярной массой, являющихся, возможно, продуктами фотодеструкции основных субъединиц пигмента (Смирнова И.О. и соавт., 2005). Таким образом, накопление дефектного меланина при фотостарении эпидермиса может приводить к нарушению пролиферативного гомеостаза меланоцитов, в результате чего на коже образуются коричневые пятна -старческие лентиго.
При сравнительном анализе числа и ультраструктуры клеток Лангерганса закрытых и открытых участков кожи выявлены более значительное снижение их количества в фотоповреждённой коже, агрегация вокруг фотоповреждённых вакуолизированных кератиноцитов, в непосредственной близости с лимфоцитами, прямые контакты с меланоцитами (Toyoda М., Brawan J., 1997). Установлена обратная зависимость между плотностью распределения клеток в эпидермисе и тяжестью фотоповреждения. При фотостарении количество гранул Бирбека в клетках и число дендритных отростков уменьшается, преобладают недифференцированные клетки, снижается их функциональная активность (GilchrestBA. etal., 1982).
В эпидермисе кожи, подверженной хроническому УФО, число клеток Меркеля превышает таковое на закрытых участках практически в 2 раза (Moll I. et al., 1990). Роль УФО в их гиперплазии представляется особенно важной в свете данных об излюбленной локализации рака из клеток Меркеля. Известным фактом является превалирование апудомы на открытых участках кожного покрова - более 90% опухолей возникает на коже лица и верхних конечностей.
При фотостарении кожи увеличивается количество фотоповреждённых фибробластов, однако, их функция резко нарушается, снижается пролиферативная активность и способность к синтезу коллагена (Varani J. et al., 2001). Снижение продукции коллагеновых волокон сопровождается дегенерацией коллагеновой сети (Uitto J., 1998). При фотостарении кожи коллагеновые волокна укорачиваются, истончаются и теряют организацию (Varani J. et al., 2001). На коже, подверженной хронической инсоляции, интенсивность иммуноокрашивания коллагена снижается с 82,5 до 80,4% уже на первой и до 44,1% - на девятой декаде жизни, а значительные нарушения архитектоники коллагеновых волокон на лице определяются в возрасте 40 лет (Basker СМ. et al., 1998). Вероятно, это связано с подавлением экспрессии гена коллагена, опосредованным через транскрипционный фактор АР-1, содержание которого повышается в клетках дермы при УФО (Uitto J., Peeknstein E.F., 1998). Более того, содержание интактного пропептидного остатка проколлагена III в фотоповреждённой коже снижается на 40%, что является результатом частичной дегенерации коллагеновых волокон дермы (Тедеско Ф., 1998). Образованию ковалентных связей коллагеновых волокон способствуют свободные радикалы, продукция которых усиливается при УФО. При этом гликилированные белки активно участвуют в свободнорадикальных реакциях, а свободные радикалы, в свою очередь, способствуют конформационным перестройкам белка, делая его молекулы более доступными для атаки Сахаров (Kristal B.S., Yu В.Р., 1992; Ryu A. et al, 1997; Бержицкая B.B. и соавт., 2002). Коллагеновые димеры недоступны для действия металлопротеиназ и накапливаются в коже. «Сшитый» коллаген не только менее эластичен по сравнению с нормальным, но и плохо связывает воду, что способствует дегидратации дермы (Марголина А.А., Эрнандес Е.И., 1999).
Гистологическое исследование кожи
С целью выявления изменения толщины эпидермиса, состояния границы между эпидермисом и сосочковым слоем дермы, степени кератинизации рогового слоя эпидермиса, количества меланоцитов в базальном слое эпидермиса, степени атрофии волосяных фолликулов, количества фибробластов и сосудов в дерме срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Меркулов Г.А., 1969).
Депарафинированные срезы в течение 3 мин окрашивали в квасцовом гематоксилине Эрлиха, затем образцы промывали в водопроводной воде в течение 2-3 мин. Далее дифференцировали в 0,5% солянокислом спирте в течение 4-5 сек и промывали в водопроводной воде в течение 5 мин. После этого окрашивали 0,5% водным раствором эозина в течение 15 сек и вновь промывали в водопроводной воде в течение 1 мин. Затем образцы проводили через 3 порции 96 спирта в течение 5-6 мин, просветляли в 3-х порциях О-ксилола в течение 5-6 мин и заключали в канадский бальзам.
Для выявления и определения степени дегенерации коллагеновых волокон дермы использовали окрашивание срезов гематоксилином и пикрофуксином (Вайль С.С., 1947).
Депарафинированные срезы прокрашивали в свежеприготовленном гематоксилине Вейгерта, выдерживая в нем 3-5 мин, после чего прополаскивали в двух порциях водопроводной воды. Затем образцы окрашивали в пикрофуксине в течение 2-3 мин и промывали в водопроводной воде в течение 10-15 сек. Далее срезы проводили через 3 порции 96 спирта в течение 5-6 мин, после этого -просветляли в 3-х порциях О-ксилола в течение 5-6 мин и заключали в канадский бальзам.
Для выявления и определения степени дегенерации эластических волокон проводили окрашивание срезов орсеином (Ромейс Б., 1954).
Депарафинированные срезы помещали в красящий раствор орсеина на 24 ч при комнатной температуре, после чего промывали в дистиллированной воде в течение 10 сек. Далее дифференцировали 1% солянокислым спиртом 2-3 мин под контролем микроскопа до момента, пока отчетливо не выявлялись эластические волокна. Затем промывали в водопроводной воде в течение 10-15 сек и проводили через 3 порции 96 спирта в течение 5-6 мин. После этого образцы просветляли в 3-х порциях О-ксилола в течение 5-6 мин и заключали в канадский бальзам.
С целью выявления гликозаминогликанов в дерме использовали окрашивание альциановым синим по Steedman (Лилли Р.Д., 1969). Для этого депарафинированные срезы помещали в красящий раствор альцианового синего (рН=1,0) на 40 сек при комнатной температуре, после чего промывали в дистиллированной воде в течение 10 сек. Затем образцы докрашивали в квасцовом гематоксилине Эрлиха в течение 5 мин. Далее дифференцировали в 1%-ном растворе 96 спирта 1-2 мин и промывали в водопроводной воде в течение 10-15 сек. После этого срезы проводили через 3 порции 96 спирта в течение 5-6 мин и просветляли в 3-х порциях О-ксилола в течение 5-6 мин. Готовый материал заключали в канадский бальзам.
Микроскопическое исследование и фотографирование гистологических препаратов кожи, окрашенных в соответствии с п.п. 2.2.2.1-2.2.2.4, проводили с помощью светового микроскопа «МБИ-6» при увеличении - об. 10х, 20х; ок. 5х, 10х, дополнительное увеличение микроскопа - 2,5х. Фотографировали срезы кожи цифровой фотокамерой «OLYMPUS С-310 ZOOM».
При морфологическом описании в коже отмечали следующие признаки:
1) изменение толщины эпидермиса;
2) сглаженность границы между эпидермисом и сосочковым слоем дермы;
3) кератинизация рогового слоя;
4) атрофия волосяных фолликулов;
5) количество сосудов дермы;
6) дегенерация коллагеновых волокон;
7) увеличение толщины и/или количества эластических волокон дермы (эластоз);
8) распределение меланоцитов в базальном слое эпидермиса;
9) количество фибробластов в дерме;
10) распределение гликозаминогликанов в дерме.
Морфологическую оценку полученных результатов проводили полуколичественным способом. Результаты выражали в баллах по следующей шкале: 1 - отсутствие признака; 2 - слабая выраженность признака; 3 - средняя степень выраженности признака; 4 - сильная выраженность признака.
С целью выявления и оценки степени экспрессии маркеров апоптоза клетками эпидермиса при старении кожи проводили иммуногистохимическое исследование. Исследование осуществляли на парафиновых срезах кожи с помощью двухэтапного авидин-биотинового метода, включавшего демаскировку антигенов высокотемпературной обработкой ткани с использованием антител к р53, bcl-2, Ьах и визуализирующей системы фирмы «DakoCytomation» (США) (Эллиниди В.Н. и соавт., 2002).
На первом этапе исследования стекла со срезами размещали в штативе и прогревали в термостате (+56С) в течение 30 мин. Далее осуществляли депарафинизацию и дегидратацию срезов, проводя их через батарею в следующей последовательности: ксилол № 1 - ксилол № 2 - ксилол № 3 (при 37С); спирт 96% - спирт 96% - спирт 96%. В каждом растворе образцы выдерживали по 10 мин, при этом при перенесении из одного раствора в другой стекла хорошо стряхивали, чтобы не загрязнять последующие растворы. После этого срезы промывали в двух сменах дистиллированной воды по 5 мин и проводили кипячение в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) в СВЧ-печи. Для этого штатив со стеклами помещали в контейнер с цитратным буфером так, чтобы стекла были полностью покрыты буфером. СВЧ-печь устанавливали на мощность 360 Вт (время - 5 мин 30 сек), затем при открытой дверце, не вынимая из СВЧ-печи, контейнер со стеклами охлаждали в течение 1 мин. По истечении указанного времени СВЧ-печь устанавливали в режим «разморозка» (время - 4 мин 30 сек). Температура буфера по окончании процесса не превышала 95 С. После кипячения из СВЧ-печи доставали контейнер со стеклами и, не вынимая из буфера, оставляли остывать до 37-40С (15-20 мин). Остывшие таким образом стекла промывали в двух сменах фосфатного буфера в течение 5 мин. Стекла со срезами по одному вынимали из штатива, аккуратно вытирали вокруг срезов, оставляя срез влажным. Наносили по 50 мкл PEROXIDASE BLOCK (3% hydrogen peroxide in water) с целью блокирования эндогенной пероксидазы и помещали во влажную камеру на 10 мин при комнатной температуре. После этого срезы промывали в дистиллированной воде в течение 5 мин, затем в фосфатном буфере (5 мин). Далее проводили инкубацию с первыми (специфичными) антителами (р53, bcl-2, Ьах) при температуре +4С. Для этого аккуратно вытирали вокруг срезов, оставляя срез влажным, и наносили по 50 мкл первых (специфичных) антител (р53, bcl-2, Ьах).
Морфологические особенности изменений кожи у пациенток в зависимости от возраста, состояния репродуктивной системы и локализации кожного биоптата
На первом этапе анализа полученных данных было проведено сравнение особенностей структуры кожи у пациенток в зависимости от возраста (табл. 4). Проводился сравнительный анализ результатов исследования у пациенток в возрасте от 16 до 44 лет (средний возраст - 35,7 лет) и пациенток от 45 до 74 лет (средний возраст - 52,6 лет) (в виду того, что группа «пожилых» включала всего 2 человека, в ходе исследования пациентки П-ой и Ш-ей групп были объединены в одну - «пожилого и среднего возраста»).
При оценке структурных особенностей кожи у пациенток 16-44 лет были получены следующие результаты (табл. 4). Было выявлено, что толщина эпидермиса у представителей этой группы оставалась постоянной в 100% случаев. Граница между эпидермисом и сосочковым слоем дермы была неизмененной у 84,6%, сглаженной - у 15,4% обследованных пациенток. Слабая» степень кератинизации рогового слоя эпидермиса была в 7,7%, умеренной - в 84,6% и выраженной в - 7,7% случаев.
В 69,2% случаев коллагеновые волокона дермы не претерпевали никаких изменений, слабая степень их дегенерации выявлялась у 23,1% обследованных, умеренная - у 7,7%.
У 53,8%о представителей данной группы в препаратах кожи морфологическое строение эластиновых волокон соответствовало норме, у 38,5% -эластоз был слабо выраженным, у 7,7% - умеренно выраженным. При подсчёте количества меланоцитов в базальном слое эпидермиса в 46,2% случаев их было до 5 в поле зрения, в 53,8% - от 5 до 10 в поле зрения.
При анализе показателя распределения гликозаминогликанов в дерме их равномерное распределение отмечалось у 23,1% обследованных пациенток, очаговое - у 76,9%.
При анализе морфологических особенностей кожи у пациенток возраста 45-74 лет были получены следующие результаты (табл. 4). Толщина эпидермиса оставалась постоянной у 70,6%) пациенток, истончение эпидермиса выявлялось у 23,5%, утолщение - у 5,9% пациенток. Граница между эпидермисом и сосочковым слоем дермы была нормальной в 88,2%, сглаженной - в 11,8% случаев. Слабая кератинпзация рогового слоя эпидермиса определялась у 11,8% представителей этой возрастной группы, умеренная - у 82,4% и выраженная - у 5,8%. Структура коллагеновых волокон дермы соответствовала норме у 70,6% пациенток; у 29,4% обследованных женщин выявлялась слабая степень дегенерации коллагеновых волокон.
Эластиновые волокна оставались без изменений в 52,9% случаев, слабый эластоз выявлялся в 11,8%, умеренный - в 35,3% случаев.
Количество меланоцитов в базальном слое эпидермиса было до 5 в поле зрения у 35,3% представителей данной группы и от 5 до 10 - у 64,7%.
Ни у кого из представителей группы среднего и пожилого возраста в препаратах кожи не отмечалось равномерного распределения гликозаминогликанов - в 100% случаев оно было очаговым.
Далее нами был проведен сравнительный анализ полученных данных у пациенток обеих клинических групп. В результате исследования статистически значимых различий по встречаемости каких-либо изменений толщины эпидермиса у представителей обеих групп выявлено не было (р=0,113). Однако у молодых пациенток в 100% случаев толщина эпидермиса не изменялась (рис. 2), у пациенток группы среднего и пожилого возраста истончение эпидермиса выявлялось в 23,5% (рис. 3), утолщение - в 5,9% случаев (рис. 4).
По показателю «состояние границы между эпидермисом и сосочковым слоем дермы» статистических значимых различий между представителями обеих групп также не было выявлено (р=0,999). Сглаженной граница была у 15,4% пациенток первой группы и у 11,8% пациенток второй группы, граница между эпидермисом и дермой соответствовала норме у 84,6%) и 88,2% обследованных, соответственно. По степени кератинизации рогового слоя достоверно значимые различия между группами не обнаруживались (р=0,999) (табл. 4).
Коллагеновые волокна дермы не претерпевали никаких изменений почти у 70% обследованных пациенток обеих групп. Однако слабая степень дегенерации коллагеновых волокон у женщин 45-74 лет выявлялась в 29,4% случаев, что на 6,3% было больше, чем данный результат у лиц 16-44 лет. Умеренная дегенерация коллагеновых дермы волокон определялась у 7,7% пациенток молодого возраста, тогда как у пациенток среднего и пожилого возраста умеренная степень дегенерации коллагеновых волокон не определялась ни в одном из случаев
![Особенности изменений микробиоценоза кишечника при нарушении липидного обмена у летного состава [Электронный ресурс]](/i/i/4434/209019.png "Особенности изменений микробиоценоза кишечника при нарушении липидного обмена у летного состава [Электронный ресурс] Матюшенко Константин Витальевич")