Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Методы взятия спермы у баранов 6
1.2 Физиологические условия, необходимые для выделения спермы в искусственную вагину 12
1.3 Микробная загрязненность семени баранов и ее профилактика 13
1.4 Методы выявления половой охоты у овец 17
1.5 Совершенствование парацервикального (влагалищного) способа искусственного осеменения овец 19
1.6 Особенности сохранения спермы баранов при различных температурных режимах 21
1.7 Особенности конструирования синтетических сред для замораживания спермы баранов 31
2. Методика исследований 34
3. Результаты исследований 41
3.1 Усовершенствование инструментов для взятия спермы от баранов, ее обработки и введения в половые пути овец 41
3.1.1 Усовершенствование искусственной вагины для взятия спермы от баранов 41
3.1.2 Совершенствование нагревательного столика к микроскопу 53
3.1.3 Совершенствование биологического-термостата оттаивателя 54
3.1.4 Совершенствование инструмента для парацервикального введения спермы овцам 55
3.2 Совершенствование выборки овец в охоте и способа их осеменения 59
3.2.1 Модернизация способа выборки овец в охоте 59
3.2.2 Совершенствование способа искусственного осеменения овец 63
3.3 Разработка синтетической среды для хранения семени при варьирующих плюсовых температурах 70
3.4 Влияние различных санирующих препаратов в среде на результативность искусственного осеменения овец 73
3.5 Изучение защитного действия солей янтарной кислоты на устойчивость спермы баранов к глубокому замораживанию 75
3.6 Влияние оптимальноой дозы сукцината натрия в составе среды на криоустойчивость спермы баранов 79
4. Обсуждение результатов исследований 82
5. Выводы 91
6. Предложения производству 92
7. Список использованной литературы
- Физиологические условия, необходимые для выделения спермы в искусственную вагину
- Совершенствование парацервикального (влагалищного) способа искусственного осеменения овец
- Усовершенствование искусственной вагины для взятия спермы от баранов
- Разработка синтетической среды для хранения семени при варьирующих плюсовых температурах
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Искусственное осеменение животных — это высокоэффективный метод улучшения породных и продуктивных качеств животных путем использования семени высокоценных племенных производителей. Для дальнейшего совершенствования искусственного осеменения животных, кроме теоретических исследований, большое значение следует уделять поиску путей эффективного выхода в практику. Одним из направлений должно стать усовершенствование существующих инструментариев, функциональное значение которых должно быть сопряжено с анатомическими и биологическими особенностями репродуктивной системы животных.
Одной из причин низкой оплодотворяемости овец являются сопутствующие факторы, связанные с использованием некоторых технологических приемов и инструментария для искусственного осеменения, оказывающих отрицательное влияние на оплодотворяемость (А.И. Лопырин, 1971; Н.Н. Полянцев, 1999; СМ. Сулейманов, 2000; A.M. Селиванов, 2000; З.К. Копытин, 2001).
Результативность искусственного осеменения овец спермой, сохраняемой в условиях 0+2С, а также в глубокозамороженном состоянии, все еще остается недостаточно высокой.
В связи с этим, необходимы дальнейшие исследования в области совершенствования синтетических сред для хранения спермы как в условиях плюсовых температур, так и в замороженном состоянии. Повышения результативности искусственного осеменения овец возможно добиться с помощью использования в средах различных биологически активных соединений.
1.2. Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось повышение результативности воспроизводства овец за счет внедрения в практику искусственного осеменения усовершенствованных инструментов, а также синтетических сред для криоконсервации спермы баранов.
Для достижения этой цели ставили следующие задачи: усовершенствовать инструменты для взятия спермы от баранов и введения ее в половые пути овец; модернизировать выборку овец в охоте и способы их осеменения; - усовершенствовать синтетическую среду для хранения семени баранов при варьирующих плюсовых температурах; исследовать влияние санирующих препаратов в составе синтетической среды на результативность искусственного осеменения овец; - провести сравнительное изучение криозащитных свойств солей янтарной кислоты и на сперматозоиды баранов при глубоком замораживании; - усовершенствовать синтетическую среду для замораживания спермы баранов.
1.3. Научная новизна исследований. На основе проведения комплексных исследований усовершенствованы инструменты для искусственного осеменения овец.
Разработана оригинальная конструкция ловчего комплекса для выборки маток в охоте, в котором использован принцип влечения самок в охоте к самцам. Усовершенствована синтетическая среда для хранения спермы баранов при плюсовых варьирующих температурах.
Установлено действие нового санирующего препарата Апрэрем на результативность искусственного осеменения овец охлажденным семенем.
Усовершенствована синтетическая ГЖУК-трис-буферная среда для замораживания спермы баранов.
1.4. Практическая значимость. Усовершенствованные инструменты для взятия спермы у баранов, ее технологической обработки и введения в половые пути овец способствуют снижению стрессовых ситуаций при взятии спермы у баранов и искусственном осеменении овец, что способствует повышению воспроизводства стада.
Предложена усовершенствованная синтетическая среда для глубокого замораживания спермы баранов, в состав которой входят новый санирующий препарат и сукцинат натрия, повышает биологическую полноценность криоконсервированной спермы и способствующие повышению ее оплодотворяющую способность.
1.5. Апробация результатов исследований. Оснвные положения диссертационной работы внедрены в овцеводческих хозяйствах Белгородской, Ростовской, Читинской, Челябинской областей, в республиках Калмыкия, Хакасия. Результаты исследований были доложены на конференции отдела биологии воспроизведения животных и лаборатории селекционно-племенной работы в овцеводстве ВНИИплем (2007).
Изготовление приборов для оттаивания спермы, нагревательных столиков к микроскопу и опытной партии устройства для парацервикального способа осеменения организовано в ООО «Венера-Вет», г. Москва.
Публикации. Основные результаты научных исследований, изложенных в диссертации, опубликованы в 5-х научных работах, в том числе в 2-х журналах, утвержденных ВАК. Получен патент по заявке №2006118741 от 3 октября 2007 г. «Синтетическая среда для замораживания спермы баранов»
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов и практических предложений производству. Диссертация включает 23 таблицы и 6 рисунков. Список литературы состоит из 167 источников, в том числе 58 иностранных.
Физиологические условия, необходимые для выделения спермы в искусственную вагину
Принцип искусственной вагины заключается в использовании температурных и механических раздражителей, на соответствующие специализированные нервные окончания, имеющиеся на головке пениса самца (В.К Милованов , 1934). Одни из этих нервных окончаний - Пачиниевы тельца - воспринимают давление, другие, -«генитальные» тельца - холод , третьи - Мейснеровы окончания, обладают тактильной чувствительностью. Эякуляция при наличии эрекции происходит в том случае, если Пачиниевы нервные окончания возбуждаются, а генитальные и Мейснеровы тельца не подвергаются раздражению.
При естественном спаривании, необходимое для эякуляции возбуждение нервных окончаний, воспринимающих давление, создается мускулатурой влагалища, слизистая оболочка которого устраняет тормозящие ощущения (осязательные и холодовые). Таким образом, в искусственной вагине должно быть обеспечено достаточное давление на головку пениса и, одновременно, устранена возможность возбуждения тормозящих холодочувствительных и осязательных нервных окончаний (Милованов В.К., 1934). Поэтому в искусственном влагалище необходима определенная температура, давление и гладкая поверхность внутренней трубки прибора. Нагревание искусственной вагины производится теплой водой, наливаемой в межстенное пространство, а давление - нагнетанием воздуха в ту же полость.
Родин И.И. (1934) в опытах с баранами и хряками установил, что эякуляция в искусственную вагину может происходить только при определенной температуре, близкой к нормальной температуре их тела. Недостаточная температура тормозит эякуляцию, а при температуре 20С -эякуляция у баранов не происходит. При температуре в 40-45С эякуляция происходит более интенсивно. Дальнейшее повышение температуры до 65 не задерживает эякуляцию и не нарушает выделение нормального объема спермы и концентрации сперматозоидов. Однако, получение спермы при высоких температурах опасно из-за перегревания спермиев. Кроме того, применение высоких температур приводит к изменению порога возбудимости нервных окончаний пениса, в результате чего для семяизвержения будет требоваться все более высокая температура. Оптимальной температурой, необходимой для проявления рефлекса эякуляции и получения нормального количества и качества спермы у всех, самцов, является 40-42С. Также ранее было установлено, что оптимальное давление в искусственной вагине для барана должно быть в пределах 40-60 мм ртутного или 30-50 см водного столба. Для создания в искусственной вагине оптимального давления следует нагнетать воздух в таком количестве, чтобы входное отверстие внутренней трубки было полностью закрыто спавшимися стенками и входная часть прибора представляла бы собой упругую надутую поверхность.
При недостаточном давлении семяизвержение, как правило, бывает вялым, при более сильном - энергичным. Однако при чрезмерном давлении, когда оно затрудняет введение пениса в искусственную вагину, наступает торможение семяизвержения.
Чтобы устранить раздражение тормозящих осязательных нервных окончаний, нужно применять достаточно эластичную внутреннюю трубку искусственной вагины с гладкой поверхностью.
Дальнейший поиск оптимального конструкторского решения устройства для взятия спермы от баранов является одной из важных задач совершенствования технологии искусственного осеменения овец.
Известно, что сперма создает благоприятные условия для размножения микрофлоры, главные источники которой - антисанитарные условия содержания производителей, нарушения санитарных требований при взятии семени, его обработки и хранения.
Присутствие микроорганизмов в семени, используемом для искусственного осеменения, в количествах от нескольких тысяч до нескольких миллиардов в 1мл, было давно известно, отечественным и зарубежным исследователям и считалось неизбежным и безвредным.
Вильяме В.В. и Кингсбери В.В. (1920), Виллет Р.(1939) и др. собирали семя из влагалища коров после естественного спаривания и установили, что сперма быков с нормальной оплодотворяющей способностью содержала незначительное количество микробов или совсем их не содержала. У быков бесплодных или малоплодных, в семени содержалось большое количество микробов.
При взятии спермы на искусственную вагину без специальных мер антибактериальной защиты, в нее попадает большое количество микроорганизмов. Захарова М.И. (1950) в 1 мл семени барана обнаружила 55 млн. микробов. В одном миллилитре семени быка Маринов П;И. (1959) обнаружил 58 млн. микробов, а Касумов М.Ф. (1963) - 15 видов микробов, из них 11 сапрофитных и 4 условно-патогенных.
По данным профессора Соколовской И.И. (1962), в 1 мл семени баранов может находиться от 280 тысяч до 120 и более миллионов микроорганизмов. Ряд исследователей считают, что сапрофитная микрофлора, распространенная в воздухе помещений, в кормах, и неизбежно попадающая в семя во время его получения в обычных условиях, является безвредной и даже в некоторых случаях полезной.
Совершенствование парацервикального (влагалищного) способа искусственного осеменения овец
В современных условиях рыночных отношений, сложившихся в аграрном секторе России, основное количество овцепоголовья - 10,1 млн. голов сосредоточено в частном секторе и представляет собой товарное поголовье.
В сельхозпредприятиях имеется 5,4 млн. голов. Эти животные принадлежат, в основном, племзаводам и племрепродукторам, главной задачей которых является выращивание и реализация племенного молодняка. Эти хозяйства должны заниматься вопросами совершенствования пород, улучшением продуктивности товарных стад, а в конечном итоге -повышением рентабельности и конкурентоспособности отрасли.
Максимально использовать генофонд племенных заводов, в которых содержится более 90% всех выдающихся производителей, возможно лишь при внедрении в частном секторе метода искусственного осеменения животных.
Все применяемые в настоящее время способы искусственного осеменения овец предполагают наличие специальных пунктов, оборудованных необходимым инвентарем и укомплектованных штатом специалистов и подсобных рабочих (Инструкция по искусственному осеменению овец и коз, 1970).
Наиболее распространенная технология искусственного осеменения включает выборку маток в охоте с помощью баранов-пробников, фиксацию овец в станке и введение спермы в шейку матки шприцом-катетером, с использованием влагалищного зеркала.
Однако известно, что во время случного сезона должны быть исключены любые формы стресса, который подавляет окситоциновый рефлекс и отрицательно влияет на воспроизводительную функцию овцематок (Милованов В.К., 1963; Лопырин А.И., 1971; Doney J.M, Smith W.F., Gann R.G., 1976). К таким стресс-факторам относятся: страх, вызванный отделением овцы от стада при выборке в охоте и физическое воздействие человека на животное при загоне в пункт и фиксации в станке, болевые ощущения, нервное потрясение, резкая смена температуры окружающей среды и т.д.
Учитывая, что стресс у овец вызывает не только сам процесс искусственного осеменения, но и сопутствующие ему факторы, было бы желательно усовершенствовать некоторые звенья традиционной технологии осеменения в овцеводстве.
Для достижения этой цели необходимо усовершенствовать катетер для осеменения, позволяющий производить искусственное осеменение в расколе парацервикальным (влагалищным) методом, не прибегая к индивидуальной фиксации каждой овцы в станке.
При анализе результатов опытов по данной проблеме других исследователей, можно отметить, что при искусственном осеменении овец парацервикальным (влагалищным) способом, они применяли стандартный шприц-катетер, предназначенный для цервикального способа осеменения. При этом острый конец катетера обрезали. Опыты Тюпич М.М. (1959), Казакова В.М. (1963), Гладышевой А.А. (1963) показали, что при влагалищном способе искусственного осеменения овец таким инструментом можно получать оплодотворяемость в пределах 75%, при содержании в дозе 250 млн. активных сперматозоидов. При этом было отмечено, что объем вводимой во влагалище разбавленной спермы (в пределах 0,5-1,0 мл) не оказывает влияния на результативность осеменения. Но отмечалась тенденция повышения оплодотворяемости овец при уменьшении степени разбавления и увеличении числа спермиев в дозе.
Использование такого инструмента все- же не разрешало до конца задачу максимального упрощения влагалищного метода осеменения.
Для радикального решения этого вопроса необходимо дальнейшее совершенствование влагалищного способа осеменения овец посредством применения новых инструментов. Это позволяет освободить овцеводов от затрат труда на проведение таких операцийкак: использование влагалищного зеркала, дозирование семени, фиксация матки в случном станке.
Ввиду того, что техника введения семени в шейку матки требует высококвалифицированных техников-осеменаторов, этот способ осеменения не получил широкого распространения на мелких овцефермах. Там преобладает, в основном, ручная или вольная случка. При такой технологии особо ценные производители не могут быть использованы с максимальной нагрузкой.
Усовершенствование искусственной вагины для взятия спермы от баранов
Известно, что искусственная вагина для взятия спермы от баранов состоящая из эбонитового цилиндра, резиновой внутренней трубки, стеклянного семяприемника и краника с пробкой не полностью удовлетворяет современным практическим требованиям.
В ней не обеспечено автоматическое нагнетание воздуха и возможность осуществления постоянного контроля давления и температуры внутри этого устройства.. Эбонитовый корпус имеет узкое горло для наполнения водой, что создает необходимость пользоваться воронкой.
Перед взятием спермы для придания скользящей поверхности, резиновую трубку вагины необходимо смазывать вазелином или синтетической средой. От воздействия вазелина резиновая трубка быстро приходит в негодность. Поэтому мы решили усовершенствовать искусственную вагину для взятия спермы от баранов. Приступая к совершенствованию искусственной вагины для баранов, предварительно мы уточнили анатомо-топографические особенности строения гениталий у овец и баранов.
На основании этих исследований пришли к заключению, что при создании ранее используемых образцов искусственных вагин, авторы не полностью учли некоторые особенности анатомии полового аппарата данного вида животных.
Известно, что длина влагалища у овец разных пород коррелирует с их живой массой и равна 8-10 см. Преддверие влагалища переходит в довольно узкую половую щель, основой которой является кольцевой поперечнополосатый мускул. Основной функцией этого мышечного кольцевого сжимателя является активизация половых рефлексов самца при садке путем создания оптимального давления на нервные окончания, заложенные в коже пениса (Фатер-Пачиниевы тельца), необходимого для эякуляции. Одновременно они служат также барьером для проникновения пыли, грязи и слизи из препуция во время коитуса.
Собственно влагалище формируют слои продольной и кольцевой гладкой мускулатуры. Часть мышечных волокон имеет спиральное направление (А. Лопырин, 1971). Важным является то обстоятельство, что влагалище овцы в краниальной своей части завершается расширенным конусом, в который выдается наружный зев шейки матки.
Этот анатомический феномен неслучаен, а создан естественным отбором для нормального функционирования уретрального отростка пениса барана, способствующего разбрызгиванию спермы по поверхности краниальной части влагалища овцы, увеличивая тем самым вероятность попадания определенной части эякулята в цервикальный канал.
Очевидно, что во время спаривания у овец продольные и спиралевидные мышечные слои стенки влагалища сокращаются, образуя тем самым баллонообразное расширение вокруг шейки матки, обеспечивая этим свободную вибрацию отростка пениса и полноценную садку.
Но при этом давление в разных участках влагалища овцы неравномерное. В преддверии влагалища давление создается кольцевым мускулом вульвы и достигает 50-55 см водяного столба. Это способствует оптимальному раздражению во время коитуса чувствительных к давлению нервных окончаний, заложенный в слизистой пениса. Этим раздражением стимулируется процесс эякуляции.
В краниальной части влагалища овцы образуется баллонообразная полость с меньшим давлением - 35-40 см водяного столба, которая не препятствует разбрызгиванию спермы из уретрального отростка головки пениса на задний свод влагалища при эякуляции.
Учитывая вышеизложенное, можно заключить, что существующие конструкции искусственных вагин (в т.ч. и рекомендованная инструкцией) имеют следующие существенные недостатки: — их корпус на 50 % длиннее влагалища овцы и на 18-20 % длиннее пениса барана; — на всем протяжении эластичной внутренней трубки вагины давление составляет 50-55 см водяного столба; — вследствие этого при взятии спермы мочеполовой отросток головки пениса барана отгибается назад и сжимается стенками эластичной трубки.
Все это приводит к тому, что при использовании таких вагин у баранов могут возникать болевые ощущения при эякуляции, что приводит к снижению объема получаемой спермы.
Для изготовления опытных образцов усовершенствованной искусственной вагины мы выбрали материалы, которые производятся нашей промышленностью и могут заменить эбонит. Для дальнейших лабораторных исследований из их числа были отобраны: полиэтилен низкого и высокого давлений марки П-4070-І и П-2070-П; полипропилен - АК 60/40; полистирол аморфный и кристаллический, а также винипласт без пластификаторов.
Разработка синтетической среды для хранения семени при варьирующих плюсовых температурах
В клетках и тканях животных имеется достаточный уровень природных антиоксидантов, предохраняющих их от окисления липидов. Это фосфолипиды, токоферолы, убихинон, коэнзим, цистин, глутатион и др. (Суслов Т. Б., Владимиров Ю. А., 1983). Кроме этих веществ в клетках имеются специфические ферменты, защищающие от перекисного окисления липидов (ПОЛ), это, прежде всего, глутатионпероксидазная система. Ингибирующее действие плазмы спермы баранов на перекисное окисление липидов было установлено в 1976 году Т. Манном и Р. Джонсоном.
Однако, при разбавлении нативной спермы синтетическими средами, концентрация различных веществ плазмы существенно уменьшается, оказывая этим отрицательное воздействие на сохранность биологической полноценности сперматозоидов. Учитывая подверженность спермы баранов при хранении процессу перекисного окисления липидов, отрицательно действующего на сохранность биологической полноценности сперматозоидов, отечественные и зарубежные ученые предлагают вводить в состав сред для разбавления спермы различные антиоксиданты (бутилокситолуол, таурин, гликотаурин, ифган-3 и др.).
Известно, что при высоком содержании кислорода в среде самым активно окисляющимся субстратом цикла Кребса, является янтарная кислота (Кондрашова М. Н., Маевский Е. И., и др., 1973). Установлено также, что в условиях гипоксии окисление янтарной кислоты значительно усиливается, и она становится основным субстратом энергообеспечения клеток (Кондрашова М.Н., 1989.).
Кроме того, янтарная кислота обладает определенным антиоксидантным действием. Она может предотвращать нарастание метаболических нарушений, приводящих к бурному перекисному окислению и необратимому повреждению мембран клеток. Это свойство янтарной кислоты способствует сохранению структуры клеток (Треттер Л. и др. 1987; Рокутан К., КаварК. 1987).
В технологии глубокого замораживания спермы баранов большое значение отводится дальнейшему совершенствованию синтетических сред для криоконсервации спермы баранов путем использования различных криопротекторов. Поэтому нами были проведены опыты по изучению действия различных солей янтарной кислоты в составе ГЖУК-трис-буферной среды на устойчивость сперматозоидов барана к глубокому замораживанию (табл.20).
Результаты этих экспериментов показали, что из всех изученных препаратов лишь сукцинат натрия в концентрациях 0,20 - 0,40 мг/мл оказывает заметное криозащитное действие. Так, если в контрольной группе подвижность сперматозоидов после дефростации была равна 4,0 баллам, а абсолютный показатель выживаемости - 293 условных единиц, то при включении в состав среды сукцината натрия в концентрации 0,40 мг/мл эти показатели увеличились, соответственно, на 12,5 и 20%.
Другие изученные соли янтарной кислоты при включении их в состав среды оказали отрицательное влияние на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов барана.
Менее заметное отрицательное действие на сперматозоиды оказали сукцинат аммония и сукцинат магния. Подвижность сперматозоидов после дефростации в первом случае была равна 4,0 балла, а абсолютный показатель живучести -220 условных единиц. В группе с сукцинатом магния подвижность после оттаивания составила 3,5 балла, а живучесть сперматозоидов - 130 условных единиц.
Использование сукцината натрия и гидросукцината кальция в составе среды оказало более заметное отрицательное воздействие на подвижность и живучесть сперматозоидов. Подвижность сперматозоидов после оттаивания была в пределах 3-2,2 балла и абсолютный показатель живучести даже при концентрации 0,20 мг/мл составил, соответственно, 90 и 20 усл. единиц. По мере повышения концентрации этих препаратов в среде происходило увеличение концентрации водородных ионов в разбавителе. Если при начальной дозе (0,20 мг/мл) кислотность среды была в пределах рН=6,3-5,9, то при 1,2 мг/мл - рН= 5,1-5,3. Повышение концентрации водородных ионов несомненно явилось причиной снижения качественных показателей спермы после дефростации.
