Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 31
1.1 Основные направления и принципы разработки новых лекарственных средств 31
1.2 Современные предпосылки создания новых лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья 38
1.2.1 Общие сведения о терпенах, смоляных кислотах и их биологической активности 39
1.2.1.1 Биологическая активность дитерпеноидов, выделенных из живицы кедровой и их значение при создании новых лекарственных средств 42
1.2.1.2 Биологическая активность тритерпеноидов, выделенных из коры березы и их значение при создании новых лекарственных средств 45
1.3 Лекарственные растения и их активные компоненты, применяемые при коррекции патологий печени 50
2 Результаты собственных исследований 65
2.1 Дизайн и PASS С&Т прогноз спектра биологической активности новых производных смоляных кислот 65
2.2 Изучение параметров острой токсичности производных смоляных (абиетиновой, лево-, хино- и малеопимаровой) кислот 83
2.3 Изучение противовоспалительной активности производных смоляных кислот и композиции монометилового эфира кетотетракарбоно вой кислоты с анилокаином и полифлоксацином 99
2.3.1 Селективное противовоспалительное влияние монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты на остеоиндуктивную активность костной ткани крыс 115
2.4 Противоязвенная активность производных смоляных кислот и композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анило-каином и полифлоксацином 118
2.5 Влияние отдельных производных смоляных кислот и их композиций с анилокаином и полифлоксацином на клеточно- и не клеточно-опосредованный иммунный ответ 127
2.5.1 Изучение влияния МЭК и композиции МЭК+А+П на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и перитонеаль ных макрофагов 136
2.6 Изучение хронической токсичности монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и композиции МЭК+А+П 141
2.6.1 Изучение влияния композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином на эмбриогенез крыс 150
2.6.2 Изучение кожно-раздражающих и резорбтивных свойств производных малеопимаровой кислоты и композиции МЭК с анилокаином и полифлоксацином 154
2.7 Влияние композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином (МЭК+А+П) на течение процессов свободнорадикального окисления 156
2.8 Влияние монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и компо зиции МЭК+А+П на печень 163
2.8.1 Сравнительная лечебно-профилактическая гепатопротекторная активность МЭК и композиции МЭК+А+П на экспериментальных моделях острых гепатитогепатозов, вызванных действием тетрахлорметана и метанола 163
2.8.2 Эффективность применения композиции МЭК+А+П при коррекции токсического гепатоза собак, вызванного действием макроциклических лактонов 171
2.8.3 Терапевтическая эффективность применения композиции МЭК+А+П при лечении жирового гепатоза молодняка крупного рогатого скота 182
2.9 Терапевтическая эффективность применения композиции МЭК+А+П при лечении токсической диспепсии у телят 191
2.10 Влияния композиции МЭК+А+П на восстановление гормонального статуса коров при лечении катарально-гнойного эндометрита 207
3 Заключение 219
Рекомендации производству 221
Список сокращенных терминов 222
Список использованной литературы 224
Список иллюстрированного материала 266
Приложения 270
Приложение А Патент Российской Федерации на изобретение «Средство, представляющее собой 8-(метокси-карбонил)-4Ь,8-диметил-3-(2-метилпропаноил)-тетрадекагидрофенантрен-1,2,1 Оа-трикарбоновую кислоту, проявляющее противовоспалительную и противоязвенную активность, и способ его получения» № RUS 2426720 от 30 ноября 2009 года 271
Приложение Б Патент Российской Федерации на изобретение: «Средство, представляющее собой 13-изопропил-4,10-диметилдодекагидро-13,16-эпоксиоксирено[2,3] нафто[2,1- і][1,2]диоксицин-4-карбоновую кислоту, проявляющее противовоспалительную и противоязвенную активность» № RUS 2472787 22 августа 2011 года 273
Приложение В ЯМР-спектрограмма монометилового эфира кетотетра карбоновой кислоты 275
Приложение Г Методические рекомендации производству «Лечение жирового гепатоза у молодняка крупного рогатого скота на откорме и фармакопрофилактика лекарственных поражений печени у собак при применении макроциклических лактонов» (протокол № 2 от 2 июля 2012 г.) 277
Приложение Д Методические рекомендации производству «Лечение и профилактика эндометритов у коров» (протокол №3 от 17 марта 2009 г.) 284
Приложение Е Методические рекомендации «Применение новой композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином (МЭК+А+П) в форме внутриматочных свечей на желатиново-глицериновой основе для лечения острого послеродового катарально-гнойного эндометрита у крупного рогатого скота (протокол №2 от 10 сентября 2010 г.) 286
Приложение Ж Акты внедрения результатов научно-исследовательской работы в производство 292
Приложение И Дипломом XI Российской агропромышленной выставки «Золотая осень - 2009» за инновационную разработку высокоэффективного препарата в форме внутриматочных свечей для лечения эндометритов у коров» 300
Приложение К Карты обратной связи о внедрении научных исследований, отраженных в диссертационной работе в учебный процесс ВУЗов РФ 301
- Основные направления и принципы разработки новых лекарственных средств
- Изучение параметров острой токсичности производных смоляных (абиетиновой, лево-, хино- и малеопимаровой) кислот
- Влияние композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином (МЭК+А+П) на течение процессов свободнорадикального окисления
- Влияния композиции МЭК+А+П на восстановление гормонального статуса коров при лечении катарально-гнойного эндометрита
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из основных задач, поставленных Российской сельскохозяйственной академией, является разработка и внедрение в ветеринарную практику, и животноводство средств эффективной терапии и профилактики заболеваний животных заразной и незаразной этиологии, а также повышение естественной резистентности и устойчивости к отрицательному воздействию внешней среды [15, 41, 44, 50].
Практическая медицина и ветеринария современности использует обширный арсенал лекарственных средств для лечения различных патологических состояний организма животных и человека, а также средства, регулирующие течение обменных реакций. Однако, несмотря на подтвержденную клинической практикой эффективность большинства из этих средств, приходится осознавать, что их активность очень сильно ограничена спектром действия, и в большинстве случаев, наряду с положительным терапевтическим эффектом, сопряжена с проявлением отрицательного побочного действия, порой, превосходящего по тяжести первоначальную патологию. Немаловажное значение имеет и тот факт, что отдельные группы лекарственных средств при длительном применении способны терять свою фармакологическую активность [6, 9, 50, 56, 70].
Преимуществом лекарственных средств на основе природных компонентов перед синтетическими состоит в том, что они редко вызывают побочные реакции организма, малотоксичные, хорошо переносятся и могут быть использованы не только для лечения, но и с профилактической целью при длительных курсах. С точки зрения экологичности производства лекарственное растительное сырье остается приоритетным в связи с гораздо более быстрой возобновляемостью источников и меньшим загрязнением окружающей среды, в сравнении с производством химиотерапевтических средств [3, 4, 31, 58].
Степень разработанности проблемы. Наибольший интерес из всех компонентов лекарственного растительного сырья во всем мире заслуживают эфирные масла, в том числе содержащиеся в коре многих деревьев доступные для полусинтеза терпеновые соединения [12, 13, 16, 19, 20, 26, 48, 51, 52, 60, 67]. Перспективную основу для дизайна новых биологически активных соединений, смоляные кислоты, представляют собой еще и потому, что даже незначительные изменения их молекул приводят к существенному изменению проявляемых видов активности [6, 21, 52, 53]. Причем, модификацией химической структуры отдельных ди- и тритерпеноидов возможно добиться одновременного присутствия множества видов фармакологической активности [46, 47, 54]. Однако, в доступной литературе нами не обнаружено описания компонентов растительного лекарственного сырья в общем, а также производных абиетиновой, хино-, малеопимаровой кислот в частности, которые могли бы проявлять одновременно хорошо выраженные противовоспалительные, противоязвенные, гепатопротекторные, антиоксидантные и иммуностимулирующие свойства, крайне необходимые при лечении и профилактике широко распространенных в животноводстве и ветеринарии патологий печени, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы и заболеваний, характеризующихся течением выраженной воспалительной реакции.
Цели и задачи. Целью исследований явилось изыскание новых биологически активных компонентов лекарственного растительного сырья, на основе полусинтеза смоляных кислот, обоснование их безопасности и терапевтической эффективности при коррекции реакций воспаления, патологий пищеварительной и репродуктивной систем животных. В соответствии с поставленными целями нами решались следующие задачи:
1. Провести скрининг, дизайн и прогноз спектра биологических видов активности новых производных смоляных кислот;
2. Изучить токсико-фармакологические свойства производных абиетиновой, хинопимаровой и малеопимаровой кислот: острую и хроническую токсичность; эмбриотоксические свойства; противовоспалительную и противоязвенную активность; раздражающие и сенсибилизирующие свойства; влияние на минеральный состав и органический матрикс костной ткани при остеоиндукции;
3. Изучить влияние монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и ее композиций на клеточный и гуморальный иммунитет;
4. Изучить влияние монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и ее композиции с анилокаином и полифлоксацином («Политрил») на течение процессов свободнорадикального окисления;
5. Изучить гепатопротекторные свойства монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и ее композиции с анилокаином и полифлоксацином при различных формах гепатозов крыс, собак и молодняка крупного рогатого скота;
6. Изучить терапевтическую эффективность применения монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и ее композиции с анилокаином и полифлоксацином при лечении токсической диспепсии телят;
7. Изучить терапевтическую эффективность монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и ее композиции с анилокаином и полифлоксацином при лечении острого катарально-гнойного эндометрита у коров и их влияние на гормональный статус.
Научная новизна. Проведен сравнительный анализ и скрининг возможностей изменения набора биологических видов активностей у новых производных смоляных кислот посредством модификации их химических структур.
Впервые изучены токсико-фармакологические свойства новых производных абиетиновой, хино- и малеопимаровой кислот, монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты индивидуально, а также в композиции с анилокаином и полифлоксацином: параметры острой и хронической токсичности; эмбриотоксические свойства; противовоспалительные и противоязвенные свойства; раздражающие и сенсибилизирующие свойства; влияние на минеральный состав и органический матрикс костной ткани при остеоиндукции.
Впервые изучены и установлены иммуностимулирующие, антиоксидантные и гепатозащитные свойства монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты в композиции с анилокаином и полифлоксацином, а также возможность их применения при профилактике и лечении различных форм гепатозов у лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных.
Впервые установлена высокая эффективность применения монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты в композиции с анилокаином и полифлоксацином при лечении токсической диспепсии у телят и гнойно-катарального эндометрита у коров. Определены дозы и схемы их применения для повышения продуктивного здоровья животных.
Новизна прикладных разработок подтверждена двумя патентами РФ на изобретения: «Средство, представляющее собой 8-(метокси-карбонил)-4b,8-диметил-3-(2-метилпропаноил)-тетрадекагидрофенантрен-1,2,10a-трикарбоновую кислоту, проявляющее противовоспалительную и противоязвенную активность, и способ его получения» № RUS2426720 от 30 ноября 2009 года; «Средство, представляющее собой 13-изопропил-4,10-диметилдодекагидро-13,16-эпоксиоксирено[2,3] нафто[2,1-d][1,2]диоксицин-4-карбоновую кислоту, проявляющее противовоспалительную и противоязвенную активность» № RUS2472787 22 августа 2011 года.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили предложить новый иммуномодулятор МЭК и его композицию для повышения общей резистентности организма животных, лечения диспепсии телят, профилактики и лечения гепатозов у лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных, а также для лечения катарально-гнойного эндометрита у коров. В результате проведенных исследований разработаны и утверждены в установленном порядке:
1. Методические рекомендации производству «Лечение и профилактика эндометритов у коров» (утверждены заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору «Россельхознадзор» Власовым Н.А., протокол №3 от 17 марта 2009 г.).
2. Методические рекомендации «Применение новой композиции монометилового эфира кетотеракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином (МЭК+А+П) в форме внутриматочных свечей на желатиново-глицериновой основе для лечения острого послеродового катарально-гнойного эндометрита у крупного рогатого скота (рассмотрены и одобрены секцией «Патология, фармакология и терапия» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №2 от 10 сентября 2010 г.).
3. Методические рекомендации производству «Лечение жирового гепатоза у молодняка крупного рогатого скота на откорме и фармакопрофилактика лекарственных поражений печени у собак при применении макроциклических лактонов» (рассмотрены и одобрены научно техническим советом при Министерстве сельского хозяйства Республики Башкортостан (протокол № 2 от 2 июля 2012 г.).
Материалы диссертационной работы существенно дополняют сведения о фармакологической активности компонентов лекарственного растительного сырья терпеноидной структуры, используются в учебном процессе на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»; в ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины»; ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный аграрный университет»; ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»; ФГБОУ ВПО «Тюменская государственная сельскохозяйственная академия» и ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет».
По материалам исследований автор награжден серебряной медалью и дипломом XI Российской агропромышленной выставки «Золотая осень – 2009» за «Инновационную разработку высокоэффективного препарата «МАОП + Анилокаин + Энрофлоксацин» в форме внутриматочных свечей для лечения эндометритов у коров».
Методология и методы исследований.
Работа выполнена на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» в период с 2002 по 2013 гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ университета (№№ государственной регистрации 01200950324, 01201058602, 01201352807). Научно-производственные исследования проведены в условиях питомника собак и в сельскохозяйственных предприятиях Республики Башкортостан. Отдельные Фрагменты работы были выполнены с участием д-ра биол. наук Исмагиловой А.Ф.; д-ра хим. наук Казаковой О.Б.; канд. биол. наук Нигматуллина Ю.М.
Материалы исследований.
1. В работе исследовались 21 новых производных смоляных кислот (абиетиновая кислота и ее озонат, хинопимаровая кислота и 5 ее производных; малеопимаровая кислота, 13 ее линейных амидов и амидов с аминокислотными остатками), синтезированных в ФГБУН «Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук» при содействии д-ра хим. наук О.Б. Казаковой; 2-метил-4-амино-6-окси-пиримидин (МАОП) и композиции МАОП и монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты (МЭК) с анилокаином, энро- и полифлоксацином («Политрил»).
2. В экспериментах использованы следующие виды животных: мыши линии СВА – 105 голов; мыши линии С57Bl – 105 голов; мыши, гибриды первого поколения (F1=С57Bl CBA) – 60 голов; мыши белые беспородные – 2753 голов; крысы белые беспородные – 1219 голов; свинки морские породы «Гладкошерстная» – 144 голов; кролики породы «Серебристый» – 60 голов; собаки породы «Восточно-европейская овчарка» – 30 голов; коровы и телята породы «Черно-пестрая» – 101 голов. Лабораторные животные содержались в одинаковых условиях вивария, соответствующих требованиям СанПИН № 1045-73 «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» [37], а также ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей практики» [35], соответствующего международным стандартам GLP. Рацион лабораторных животных состоял из сбалансированного по питательности, витаминам и минеральным веществам, отдельно для каждого из видов животных (мышей, крыс, морских свинок и кроликов), гранулированного корма «ПроКорм», соответствующего ГОСТ Р 50258-92 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных» [23]. Условия кормления и содержания сельскохозяйственных животных и собак представлены в соответствующих разделах результатов собственных исследований.
3. Анализ вероятных видов биологической активности новых производных смоляных кислот и их выраженность осуществляли с использованием авторизованного доступа к международной компьютерной системе PASS C&T Ver. 1.0, разработанной в ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» РАМН () [69].
4. Для гематологических и биохимических исследований использовали консервированные и неконсервированные пробы крови крыс, собак и крупного рогатого скота. При изучении селективности противовоспалительных свойств изучаемых соединений исследовали минеральный состав и его соотношение с органическим матриксом в костной ткани крыс.
5. В исследованиях применяли стандартизированные наборы реактивов Vital Diagnostics Spb, Diatron Messtechnik GmbH, а также химические реактивы с пометкой х.ч и о.с.ч.
6. В исследованиях применяли следующее оборудование: весы лабораторные RADWAG AS 310 C (II класс точности); печь муфельная; баня водяная; центрифуга EBA 20 (Hettich, Германия); микроскоп световой; встряхиватель Вортекс V-3; камера горяева; термостат; калиброванные пипетки автоматические с переменным объемом «Ленпипет» и одноразовые наконечники для них; фотоколориметр спектрофотометрический ПЭ-5300В и борсиликатные пробирки с длиной оптического пути 10 мм; холодильник; ионометр И-500; полуавтоматический биохимический анализатор StatFax 1904+ (Awareness Technology Inc.); ИФА-анализатор Stat Fax 2100; автоматический гематологический анализатор Abacus Junior 5 Vet (Diatron Messtechnik GmbH); пробирки вакуумные «Vacuette»: для гематологических исследований – с ЭДТА-К2, для биохимических исследований сыворотки крови – без наполнителя.
Методы исследований.
1. Определение параметров токсичности исследуемых соединений осуществляли при внутрижелудочном введении, по методу Кербера [7, 10, 38, 39, 55] с последующим расчетом LD50 и коэффициента вариабельности смертельных доз (К).
2. Противовоспалительную активность изучали согласно классической методики Ф.П. Тринуса и Н.А. Мохорта [49].
3. Остеоиндуктивная активность изучали по методу А.Х. Шамсутдинова [57].
4. Противоязвенную активность изучали по методу С.В.Аничкова и И.С. Заводской [1] на моделях острых язв, вызванных внутрижелудочным введением 3%-ного раствора уксусной кислоты в дозе 100 мг/кг и раствора индометацина.
5. Изучение кожно-резорбтивных и сенсибилизирующих свойств производных малеопимаровой кислоты и их композиции с анилокаином и полифлоксацином проводили по методу Б.И. Любимова и М.И. Мироновой [27].
6. Влияние изучаемых соединений на клеточно-опосредованный и неопосредованный иммунный ответ изучали путем сенсибилизации белых мышей 1%-ным раствором динитрофторбензола и эритроцитами барана. Количество антителообразующих клеток определяли с помощью метода локального гемолиза в жидкой фазе, предложенного N.K. Jerne и A.A. Nordin, в модификации Сonningham [63]. Титр гемагглютининов в сыворотке крови экспериментальных животных определяли планшетным методом. Изменения функциональной активности перитониальных макрофагов определяли по способности восстанавливать нитросиний тетразолий и фармазан в диформазан под действием продуктов НАДФ – оксидазной реакции. Оценку количества перитониальных макрофагов, несущих Fc–рецепторы, производили методом розеткообразования с эритроцитами барана (ЕА-РОК) [14]. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу Н.В. Пучкова (2000) [36]с суспензией убитых микробных тел St.aureus (штамм 209).
7. Изучение хронической токсичности и влияния изучаемых соединений на эмбриогенез у крыс осуществляли согласно руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» [17, 18, 55].
8. Гепатопротекторные свойства МЭК и ее композиции изучены на моделях острых экспериментальных гепатитогепатозов вызванных внутрибрюшинным введением крысам 50%-ного масляного раствора тетрахлорметана и метанола [29, 32, 45, 55].
9. При определении антиоксидантных свойств изучаемых соединений и композиций учитывали содержание в крови диеновых конъюгатов [5], малонового диальдегида [68], глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, каталазы, ретинола и токоферола [24].
10. Биохимические исследования крови проводили с использованием биохимического анализатора крови StatFax 1904+ (Awareness TechnologyInc.) с применением стандартизированных реактивов Vital Diagnostics Spb.
11. Определение уровня белковых фракций крови осуществляли нефелометрическим методом [24].
12. Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) характеризовали степенью задержки прироста биомассы тест-культуры St. аureus (штамм № 209).
13. Гематологические исследования цельной крови проводили с использованием автоматического гематологического анализатора AbacusJunior 5 Vet (Diatron Messtechnik Gmb H). Определение уровня гормонов (кортизол, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, трийодтиронин, тироксин) в сыворотке крови коров определяли иммуноферментным (ИФА) методом с применением планшетного ИФА-анализатора Stat Fax 2100 и стандартизированных диагностикумов Vital Diagnostics Spb.
14. Статистическая обработка результатов. Экспериментально полученный цифровой материал подвергали обработке методом вариационной статистики с применением прикладного приложения MS Office – MS Excel [43].
Положения, выносимые на защиту.
1. Взаимосвязь вероятной биологической активности от расположения фармакофорных групп в структуре производных малеопимаровой, абиетиновой и хинопимаровой кислот;
2. Фармакологический спектр и механизмы иммуномодулирующей и гепатозащитной активностей монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты и его композиций;
3. Степень безвредности нового производного малеопимаровой кислоты МЭК и его композиций с анилокаином и полифлоксацином;
4. Возможность применения МЭК и его композиции с анилокаином и полифлоксацином при лечении токсической формы диспепсии у телят;
5. Возможность коррекции гормонального статуса коров и лечения катарально-гнойного эндометрита у коров с применением внутриматочных свечей композиции МЭК+А+П на желатиново-глицериновой основе.
Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку цифрового материала, полученного в экспериментах, проводили с использованием стандартного пакета статистической обработки данных прикладной программы MS Excel, включающую подсчет средних величин (М), средней ошибки (m), среднеквадратических отклонений выборки (), степень достоверности по Стьюденту [43].
Основные положения диссертации представлены и доложены на: международных и всероссийских научно-практических конференциях (Санкт-Петербург, 2003, 2006; Улан-Удэ, 2010; Уфа, 2010, 2012; Казань, 2010; Краснодар, 2011; Москва, 2011); научной конференции «Органическая химия для медицины «ОРХИМЕД – 2008»» (Черноголовка, Московская обл., 2008); Втором, Третьем и Четвертом съездах ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009; Санкт-Петербург, 2011; Москва, 2013). По материалам диссертации опубликовано 38 работ, в том числе 14 статей в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, 2 учебных пособий, 3 методических рекомендаций, 2 патента Российской Федерации на изобретения.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, заключение с рекомендациями производству, список сокращенных терминов, список использованной литературы (всего 354 источников, в том числе 97 зарубежных), список иллюстрированного материала и приложения. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 10 рисунками.
Основные направления и принципы разработки новых лекарственных средств
Современная практика предъявляет очень жесткие требования к внедряемым в ветеринарию и медицину лекарственным веществам. Эти требования предусматривают наличие у лекарственного средства широкого спектра биологических видов активности и возможности использования его в этиотропной и патогенетической терапии [74]. Лекарственное средство наряду с получаемым фармакологическим эффектом не должно оказывать выраженных отрицательных, побочных действий, должно быть экологически безопасным, а лекарственное средство, используемое в ветеринарии, даже при возможности попадания в организм человека с потребляемыми им продуктами животного происхождения, не должно изменять течение физиологических процессов и усугублять имеющуюся патологию. Особые требования предъявляются к химической чистоте лекарственного средства, стабильности его при хранении и высокой окупаемости при производстве наряду с доступностью для потребителя [75].
Все эти факторы определяют время жизни данного препарата среди применяемых в медицинской и ветеринарной международной практике лекарственных веществ с аналогичным фармакологическим действием [52,75]. А учитывая тот факт, что тщательный процесс доклинического и клинического изучения возможных токсических и фармакологических свойств разрабатываемых лекарственных средств сопряжен с применением множества длительных при воспроизведении методов исследований, сроки, с момента идеи, до их массового производства и применения не редко составляют от 8 до 20 лет [52, 211, 246].
Необходимость такого ужесточения требований по детальному исследованию возможных побочных эффектов потенциальных биологически активных веществ возникла в конце 60-х годов XX века [56], когда было установлено наличие эмбриотоксического и тератогенного действия талидомида при его назначении беременным и отразившееся рождением нежизнеспособного потомства, усугубленное мутациями и уродствами. Последующие исследования причин такого вида отрицательного действия талидомида показали, что его D-форма при наличии фармакологического эффекта, абсолютно безопасна с точки зрения проявления эмбриотоксических и тератогенных свойств, а Z-форма и рацемат, включающий оба энантиомера способны нарушать естественные процессы развития плода в период эмбриогенеза [52, 122, 214].
Ежегодно химики выделяют из объектов окружающей среды и подвергают полусинтезу от ста до двухсот тысяч новых соединений, которые охаракте-ризовывают как потенциально возможные средства для использования в фармакотерапии, однако лишь малая доля из них подвергается скрининговым исследованиям с целью выявления предполагаемых видов биологической активности и селективности [199, 224, 239, 243]. Выбранные для скрининга биологически активные вещества, подвергаются тщательному тестированию и сравнению с эталонами в лабораторных условиях. Исследования начинают проводить на различных тест-культурах микроорганизмов и изолированных тканях животных (in vitro), а прошедшие данный этап вещества допускаются к доклиническим испытаниям, in vivo, на здоровых или со специально индуцированной патологией животных (беспородные и высокоимбредные породы мышей, крыс, морских свинок, кроликов, собак и сельскохозяйственных животных) [246].
При этом из сотен тысяч таких веществ, после полного и всестороннего анализа, до стадии промышленного производства и внедрения в ветеринарную или медицинскую практику, допускаются лишь единицы наиболее активных компонентов [247].
В условиях, описанных выше, а также с учетом дороговизны и длительности исследований, большинство из новых биологически активных веществ, разрабатываемых химиками-синтетиками и биологами, так и остаются нереализованными. Кроме того, даже прошедшие скрининг, но по тем или иным причинам не дошедшие до клинической стадии исследований вещества, не исключают вероятности проявления ими тех видов биологической активности, которые небыли включены в разработанную для них схему исследований. Это связано еще и с тем, что испытать все новые соединения на все требуемые практике виды активности, даже с учетом современного оснащения фармацевтических предприятий оборудованием, остается нереализуемой. В таких условиях на помощь приходят современные компьютерные технологии, позволяющие заменить часть экспериментальных исследований, при первичной оценке потенциала биологической активности, заложенной в новые синтезируемые вещества, тщательным программным анализом [2, 57, 149, 159, 224].
Компьютерный анализ потенциальных видов биологической активности, заложенных в новое вещество, как правило, основывается на сопоставлении химической структуры модели исследуемого объекта с базами данных структур лекарственных веществ с уже известными и доказанными видами биологической активности [178, 179]. Существуют и такие компьютерные методы анализа, при которых возможно моделирование различных самоизменяющихся эффектов потенциального биологически активного вещества при его взаимодействии с живыми объектами, их разнообразными биологическими рецепторами в отдельных тканях, органах и даже системах. При описанных методах компьютерного моделирования у ученых отпадает необходимость в синтезе потенциального биологически активного вещества, до момента появления всей необходимой доказательной базы его преимущества в сопоставлении с имеющимися на вооружении медицинской и ветеринарной практики аналогами. Таким образом, ученые, на основании тщательного анализа результатов исследований компьютерных моделей, принимают свое решение о необходимости синтеза этого вещества, а также подбирают именно тот спектр будущих экспериментальных исследований, который был выявлен в сопоставительных изысканиях [51, 143, 175, 224, 237, 243, 264]. Описанные меры в значительной степени позволяют экономить время, средства и силы при аналоговом поиске лекарственных веществ, а также является гуманной альтернативой первичного этапа исследований [51,52]. Однако, учитывая тот факт, что все существующие компьютерные модели работают лишь по принципу сравнения с известными биологически активными веществами, выявление принципиально новых видов активностей или новых видов фармакофорных групп в составе разрабатываемых лекарственных веществе еще долгое время будет основываться на экспериментах с исследованиями на животных, даже на первичных этапах скрининга [52].
Тем не менее, все шире используемые компьютерные методы моделирования в первичном анализе при создании новых лекарственных веществ привели к существенному изменению базисных основ и стратегий этого процесса [2, 13, 19, 143, 178, 179, 184, 315], при котором выделяют следующие принципиальные составляющие:
Первым принципом такой стратегии является сопоставительная модификация химической структуры известных биологически активных веществ синтетического происхождения, а также компонентами живой природы (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, животных и компонентов лекарственного растительного сырья). Использование данного принципа позволяет осуществить: коррекцию уже выявленного вида биологической активности у известного химического вещества; получить новые виды биологической активности, нехарактерные для аналога; совместить несколько видов биологической активности в одном веществе; сократить или даже исключить вероятность проявления побочных видов активности у этого химического вещества при усилении выраженности имеющихся положительных свойств и т.д. При этом ключевым звено является попытка включения в состав известной химической структуры, так называемых фармакофорных фрагментов и групп в различные участки молекулы, а также изменение их положения и последовательностей. Яркими примерами таких модификаций могут явиться многие представители /?-лактамов (пеницил-лины и цефалоспорины) и фторхинолонов [6, 118, 160, 172, 256, 257]. В качестве доказательства эффективности такого принципа, так же, можно привести примеры модификации класса сульфамидных диуретиков, разработанных на основе коррекции химической структуры сульфаниламидных химиотерапевти-ческих средств с побочным мочегонным эффектом [58, 64, 87, 114, 115, 119, 149], а также ряда антибластомных препаратов, полученных путем введения ІУ,Л -дихлордизтиламинного или азиридинового фрагментов в структуру азотистого иприта [124, 125, 224, 326, 337, 338].
Вторым принципом стратегии создания новых лекарственных средств может явиться использование революционного в технологии органического синтеза метода комбинаторной химии. Благодаря указанной технологии реализуется возможность испытания большого количества химических соединений посредствам формирования в растворах или на твердых подложках от сотен до нескольких тысяч новых биологически активных компонентов в сутки и быстро их тестировать в виде смесей [153, 176, 213, 266]. В сочетании с программным методом анализа вероятных видов биологической активности этот использование этого принципа позволяет в значительной мере уменьшить расход химических реагентов, а также увеличить скорость проводимых экспериментов и их результативность. Примером такого подхода может явиться твердофазный синтез новых антибактериальных препаратов на основе 1,3-оксазолидин-2-онов [64, 123, 224, 267].
В настоящее время при создании новых лекарственных средств большое значение отводится сопоставлению связей пространственной структуры химического вещества с проявляемой им биологической активности. Таким образом, третий принцип стратегии создания новых биологически активных веществ преследует своей целью изучение физико-химических свойств лекарственных веществ с учетом возможных путей их активного транспорта и биотрансформации в организме животных при назначении [152, 275, 279].
Изучение параметров острой токсичности производных смоляных (абиетиновой, лево-, хино- и малеопимаровой) кислот
Определение острой токсичности новых производных смоляных кислот и их композиций осуществлено в двух сериях опытов.
В первой серии опытов, с целью определения параметров острой токсичности абиетиновой кислоты (соединение XX), аддуктов левопимаровой кислоты: хинопимаровая кислота (соединение I), ее производные - дигидрохимаровая кислота (соединение II), метиловый эфир дигидрохинопимаровой кислоты (соединение III), производные дигидрохимаровой кислоты (соединения VII и VIII) и метиловый эфир 1/?-гидроксидигидрохинопимаровой кислоты (соединение VI); малеопимаровая кислота (соединение IV), ее метиловый эфир (соединение V), монометиловый эфир кетотетракарбоновой кислоты (соединение XIX), линейные амиды и амиды малеопимаровой кислоты с аминокислотными остатками (соединения IX-XVIII), а также озоната метилового эфира абиетиновой кислоты (соединение XXI), после предварительного пробитанализа, нами было сформировано 147 групп белых беспородных мышей обоего пола, по 7 животных в каждой и по 7 групп для каждого из соединений. Определение параметров токсичности исследуемых соединений осуществляли при внутрижелудочном введении, по методу Кербера [62, 71, 191, 192, 246], не требующему однородности интервалов смежных доз. Интервалы между LD0 и LDm дозами составляли: для соединения I - от 5000 мг/кг до 12000 мг/кг с суммой множеств половин опытных животных погибающих от смежных доз (Z) и разницы числовых значений смежных доз (d) - X Zxd = 23250; для соединения II - от 4000 мг/кг до 12500 мг/кг с X Z d = 25250; для соединений III и XII - от 4000 мг/кг до 10000 мг/кг с X Z d равной соответственно 16750 и 19500; для соединений IV, IX и XVII - от 5000 мг/кг до 13000 мг/кг с XZxd равной соответственно30750, 27750 и 26250; для соединений V и VII - от 2500 мг/кг до 7500 мг/кг с X Zxd равной 13250 и 17000 соответственно; для соединения VI - от 6500 мг/кг до 15500 мг/кг с XZxd=34500; для соединения VIII - от 7000 мг/кг до 16000 мг/кг с 27Zxflf=33750; Для соединения X от 6000 мг/кг до 12500 мг/кг с X Zxd=\9750; для соединения XI - от 5000 мг/кг до 11500 мг/кг с X Z d=18000; для соединения XIII - от 4000 мг/кг до 9000 мг/кг с X Zxd=\ 8250; для соединения XIV - от 6000 мг/кг до 10500 мг/кг с X Zxc/=17000; для соединения XV - от 3800 мг/кг до 10500 мг/кг с X Zxd=l6550; для соединения XVI - от 5000 мг/кг до 10000 мг/кг с X Zx =18000; для соединения XVIII - от 4500 мг/кг до 12000 мг/кг с X Zx i=27750; для соединения XIX - от 9000 мг/кг до 13000 мг/кг с X Zxd=l2250; для соединения XX - от 3000 мг/кг до 20000 мг/кг с X Zxd=45000; для соединения XXI - от 7000 мг/кг до 22000 мг/кг с XZxd=47500.
Во второй серии опытов с целью определения параметров острой токсичности пиримидина - 2-метил-4-амино-6-оксипиримидин (МАОП), терпеноида -монометиловый эфир кетотетракарбоновой кислоты (МЭК), а также их композиций с анилокаином, энро- и полифлоксацином, нами было сформировано по 49 групп белых беспородных мышей с живой массой 18-20 г и белых беспородных крыс обоего пола с живой массой 200-210 г, по 7 животных в каждой и по 7 групп для каждого из испытуемых соединений, либо их композиций. Определение параметров токсичности соединений осуществляли при внутрижелудочном введении, по методу Кербера [62, 71, 191, 192, 246], с интервалами между LD0 и LDioo дозами: для энрофлоксацина - от 1000 мг/кг до 4000 мг/кг с Z d=\ 1250 в опытах на белых мышах и с Z Z J=47500 в опытах на белых крысах; для поли-флоксацина - от 1500 мг/кг до 2900 мг/кг с 27 ZX6N12125 в опытах на белых мышах и от 2000 мг/кг до 3300 мг/кг с 27Zx i=13500 в опытах на белых крысах; для анилокаина - от 1200 мг/кг до 3300 мг/кг с 27Zx i=7150 в опытах на белых мышах и от 1800 мг/кг до 4200 мг/кг с 27Zx i=8350 в опытах на белых крысах; для МАОП - от 3100 мг/кг до 8500 мг/кг с 2"ZxJ=21500 в опытах на белых мышах и от 2900 мг/кг до 9600 мг/кг с 27Zxd?=24300 в опытах на белых крысах; для композиции МАОП+А+Э - от 1100 мг/кг до 7200 мг/кг с I ZxJ=16550 в опытах на белых мышах и от 2400 мг/кг до 10700 мг/кг с Z Zxd=29750 в опытах на белых крысах; для композиции МЭК+А+П - от 8000 мг/кг до 20000 мг/кг с Е ZxJ=43000 в опытах на белых мышах и с 27Zx i=41500 в опытах на белых крысах.
Во всех сериях опытов за животными вели наблюдение в течение 30-и суток. На основании данных гибели животных от применения разных доз исследуемых соединений методом интегрирования по Беренсу [30] устанавливали абсолютную смертельную дозу (XDioo) и максимально переносимую дозу (LD0). Значения LD\(, и LD&4, найденные по характеристическим кривым, построенных на основании интегрированных данных, использованы для определения коэффициентов вариабельности смертельных доз.
Результаты первой серии (таблица 3, рисунок 4) проведенных исследований показали, что все изучаемые терпеноиды обладают токсичностью, находящейся на уровне от 4571,43±303,57 мг/кг (соединение VII) до 15214,3±542,9 мг/кг (соединение XXI). При введении мышам производных смоляных кислот в дозах близких к LD\ отмечалось незначительное угнетение опытных животных, проявляющееся понижением двигательной активности («застывание» на месте), однако данные признаки исчезали уже через 1-2 часа с последующим и полным восстановлением физиологической активности. При внутрижелудоч-ном введении производных смоляных кислот дозах приближающихся к LD5o в течение 20-30 минут у мышей отмечалось незначительное повышение двигательной активности с последующим угнетением, сохраняющимся в течение до 6-12 часов. В серии опытов по определению острой токсичности малеопимаровой кислоты синтетической (IV), введение среднетоксических и более высоких доз сопровождалось гастроэнтерическими явлениями, по-видимому, связанными с образованием метаболитов, под действием желудочного сока, обладающих раздражающими свойствами. При вскрытии вынужденно убитых животных с признаками гастроэнтерита нами отмечена неравномерная гиперемия и складчатость слизистых оболочек тонкого и толстого отделов кишечника с явлениями набухания и разрыхления. Содержимое желудка и кишечника имело слизистую консистенцию в смеси с уплотненными сгустками.
Абсолютно смертельные дозы производных смоляных кислот после введения мышам внутрижелудочно вызывали быстро наступающее (в течение 5-10 минут) угнетение, с последующим летальным исходом в течение от 12 часов (малеопимаровая кислота - соединение IV; метиловый эфир малеопимаровой кислоты - соединение V; метиловые эфиры малеопимаровой кислоты с фрагментами а- и /?-аланина, Z-метионина, L- и .DZ-валина, L-лейцина, L-фенилаланина — соединения IX-XV; метиловые эфиры малеопимаровой кислоты с фрагментами 1//-имидазола и JV-метилпиперазина - соединения XVI-XVII) до 48 часов (хинопимаровая кислота - соединение I; дигидрохинопимаровая кислота и ее метиловый эфир - соединения II и III; монометиловый эфир кетотетракарбоновой кислоты, абиетиновая кислота и ее озонат - соединения XIX-XXI).
При вскрытии грудной клетки, произведенной непосредственно после остановки дыхания, у опытных животных, получавших абсолютно летальные дозы исследуемых соединений, нами не было отмечено каких либо признаков сердечного автоматизма в ответ на механическое раздражение сердечной мышцы пинцетом. При вскрытии сердца отмечено отсутствие крови в предсердиях при переполнении кровью желудочков. При гистологических исследованиях сердца нами отмечено, что заметного изменения общей численности кардиомиоцитов не происходило, однако отмечено одновременно-параллелыю-зависимое появление атрофичных, гипотрофированных и гипертрофированных кардиомиоцитов. Со стороны сердца нами также отмечены гемодииамические нарушения, сопровождавшиеся умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами.
Появление кардиомиоцитов гипотрофированного и гипертрофированного характеров указывает на возможность как потенцирования кардиоцитотропного эффекта производными смоляных кислот, так и индуцирования внутриклеточных регенераторных механизмов в миокарде.
Печень у животных, погибших в результате острой интоксикации, вызванной аддуктами левопимаровой кислоты, характеризовалась венозным застоем крови. При гистологическом исследовании структуры печени у мышей, павших от абсолютно токсичных доз исследуемых производных смоляных кислот, отмечена умеренная субплазмалеммальная липидная инфильтрация и некроз отдельных гепатоцитов, неравномерное полнокровие сосудов с более выраженным синусоидальным полнокровием, особенно выраженной при острой летальной интоксикации линейными амидами и амидами малеопимаровой кислоты с аминокислотным остатком (соединения IX-XVIII).
Влияние композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлоксацином (МЭК+А+П) на течение процессов свободнорадикального окисления
Одним из важнейших механизмов нормальной деятельности клеточных структур тканей организма животных является поддержание баланса процессов свободнорадикалыюго и перекисного окисления различных биохимических субстратов и состояния антиоксидантной защиты [3, 189, 210, 343].
Свободнорадикальное окисление реализуется цепным, «порочным» процессом переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, альдегидов и кетонов. В связи с уникальностью электронной структуры кислорода, его восстановление способствует образованию активных форм (супероксидных анионов, гидроксильных радикалов, водорода пероксида). С участием этих форм кислорода свободнорадикальному окислению подвергаются аминокислоты, белки, углеводы, но решающее для организма значение имеет окисление фосфолипидов и неэтерифицированных жирных кислот [3, 121].
Дивинилметановая структура неэтерифицированных жирных кислот сравнительно легко вступает в реакции отрыва водорода от двойной связи атома углерода в а-положении с образованием диеновых конъюгатов в присутствии кислорода [55, 173]. Гидроперекисные радикалы и гидроперекиси липидов запускают новые цепи свободнорадикальных реакций, что замыкает «порочный круг» выхода защитных гомеостатических систем из под контроля. Будучи нестабильными компонентами, первичные продукты перекисного окисления липидов подвергаются дальнейшему окислению, дающему жизнь более стабильным продуктам, представленными альдегидами, кетонами, спиртами и нйзкомолекулярными кислотами (уксусной, масляной, муравьиной и т.п.). Ключевое же значение из всех продуктов вторичного окисления занимает малоновый диальдегид [48].
Учитывая то, что основной субстрат липидной пероксидации - неэтерифи-цированная жирная кислота — является обязательным компонентом любых биологических мембран, негативные последствия стимуляции перекисного окисления липидов отражаются на клетках всего организма. Считается, что цепь преобразований, ведущая к цитолизу, становится неуправляемой уже в том случае, когда реакциям перекисного окисления липидов подвергается лишь 2-5% фосфо-липидов, содержащихся в мембранах клеток.
Дополнительными звеньями повышения активности перекисного окисления липидов могут служить гипоксические процессы, характеризующие энергетический дефицит в клеточных структурах органов и тканей, подавление активности ферментов тканевого дыхания и фосфорилирования, прямое действие ядовитых веществ, вызывающих алкилирование сукцинатдегидрогеназы и АТФ-синтетазы. Особого внимания заслуживает и такой фактор, как недостаточно полноценные рационы, дефицитные по макро-, микро- и ультра-микроэлементам, витаминам и другим веществам, необходимым для нормального функционирования организма животных и качества получаемой от них продукции [3, 24, 25, 26].
Задачей наших исследований явилось изучение влияния композиции монометилового эфира кетотетракарбоновой кислоты с анилокаином и полифлок-сацином (МЭК+А+П) на течение процессов свободнорадикального окисления в организме кроликов.
Исследования проведены с использованием шестидесяти клинически здоровых кроликов двухмесячного возраста, обоего пола, породы «Серебристый». Опытные животные были распределены на 12 групп по 5 кроликов в каждой. До начала исследований, а также на 14 и 30 сутки исследований осуществляли забор крови и определение в ней основных показателей, характеризующих качество течения реакций перекисного окисления липидов (глутатионпероксидазы, глутати-онредуктазы, каталазы, витаминов А и Е, малонового диальдегида и диеновых конъюгатов). Животные 12 группы служили контролем, и не подвергались действию лекарственных веществ, животным с 1 по 11 группы ежесуточно, на протяжении 7-й суток назначали: в 1 группе - 2-метил-4-амино-6-окси-пиримидин (МАОП) в дозе 25мг/кг; во 2 группе - Анилокаин (А) в дозе 50 мг/кг; в 3 группе -Полифлоксацин (П) в дозе 5 мг/кг; в 4 группе - Энрофлоксацин (Э) в дозе 5 мг/кг; в 5-7 группах - монометиловый эфир кетотетракарбоновой кислоты (МЭК) в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг соответственно; в 8 группе гг композицию МА-ОП+А+Э (1:2:0,2) в дозе 25 мг/кг; в 9-11 группах - композицию МЭК+А+П (1:2:0,2) в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг соответственно.
В результате проведенных исследований нами установлено, что наибольшую степень антиоксидантной защиты, из всех испытанных веществ и их сочетаний, обладает композиция полусинтетического тритерпеноида монометиловый эфир кетотетракарбоновой кислоты (МЭК) с анилокаином (А) и фторхинолоном полифлоксацин (П) в соотношении 1:2:0,2 при назначении ее внутрь с кормом в дозе 25 мг/кг один раз в сутки 7 суток подряд (таблица15).
В первую очередь антиоксидантные свойства композиции МЭК+А+П (1:2:0,2) отразились в увеличении уровня глутатионзависимых антиоксидантных ферментов:
- гемотетрамерного селенопротеина глутатионпероксидаза, принимающего активное участие в регуляции тиолдисульфидного равновесия в тканях за счет катализа процесса восстановления перекисей липидов в соответствующие спирты, а также процесса восстановления водорода пероксида и водорастворимых органических гидроперекисей (алифатических и циклических углеводородов, полиненасыщенных жирных кислот, глицерина, холестерина, прогестерона и простагландинов);
- глутатионредуктазы, являющейся классическим цитозольным ферментом класса оксиредуктаз, катализирующим восстановление дисульфидных связей окисленного глутатиона до его восстановленной сульфгидрильной формы.
Так, на четырнадцатые сутки исследований, уровень глутатионпероксида-зы в эритроцитах кроликов, получавших композицию МЭК+А+П (1:2:0,2) в дозе 25 мг/кг на протяжении 7-й суток, повысился до 18,51+0,29 мкмоль/мл/мин, что на 24,73% больше в сравнении с показателем в начале исследований (14,84+0,42 мкмоль/мл/мин) и на 40,12% больше в сравнении с значением этого показателя у животных контрольной группы (13,21+0,11 мкмоль/мл/мин). При этом активность глутатионредуктазы составил 2,54+0,01 мкмоль/мл/мин, что на 40,33% больше значения этого показателя в контрольной группе (1,81+0,04 мкмоль/мл/мин) и на 13,39% выше в сравнении со значением в начале исследований (2,24+0,02 мкмоль/мл/мин).
Помимо повышения уровня глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в эритроцитарных клетках крови кроликов, получавших композицию МЭК+А+П (1:2:0,2) в дозе 25 мг/кг, к четырнадцатым суткам исследований нами также установлено и повышение активности их синергиста в реакциях обезвреживания водорода пероксида - каталазы. Активность каталазы при этом составила 37,03+0,28 ммоль HiOJn, тогда как в эритроцитах крови кроликов контрольной группы она составила лишь 34,57+0,28 ммоль HiOJn, что на 6,64% ниже сравниваемого значения.
Достоверное (Р 0,05) повышение уровня токоферола и ретинола в сыворотке крови кроликов, получавших композицию МЭК+А+П (1:2:0,2) в дозе 25 мг/кг, с 1,88+0,02 мкг/мл до 2,24+0,02 мкг/мл (на 19,15% больше в сравнении с начальным значением показателя и на 23,76%) больше в сравнении с значением показателя животных контрольной группы) и с 0,23+0,01 мкг/мл до 0,43+0,02 мкг/мл (на 86,96% больше в сравнении с начальным значением показателя и на 95,46% больше в сравнении с значением показателя животных контрольной группы) соответственно, к четырнадцатым суткам исследований, нами связано с уменьшением их затрат в системе антиоксидантной защиты на фоне активации ферментативного звена и сопряженного с этим понижения уровня маркеров пе-рекисного окисления жиров и оксидативного стресса, представленных как диеновыми конъюгатами, так и малоновым диальдегидом, образующимися в организме животных в результате дегидратации полиненасыщенных жиров активными формами кислорода. Так уровень малонового диальдегида к четырнадцатым суткам исследований понизился с 1,08+0,01 нмоль/мл до 0,74±0,02 нмоль/мл (на 31,48% меньше исходного значения показателя и значения в контрольной группе), уровень диеновых конъюгатов, к тому же сроку исследований, понизился с 1,68±0,01 нмоль/мл до 1,36+0,01 нмоль/мл (на 19,05% меньше значения начального показателя и на 20,47% меньше значения показателя в контрольной группе).
Влияния композиции МЭК+А+П на восстановление гормонального статуса коров при лечении катарально-гнойного эндометрита
Увеличение производства животноводческой продукции, наряду с совершенствованием породных и продуктивных качеств животных, тесно связано с состоянием воспроизводства стада. По мнению многих специалистов, сдерживающим его фактором в значительной мере являются различные гинекологические заболевания, такие, как послеродовые эндометриты [50, 60, 65, 88, 98, 167,177,206,231,252,253].
Воспаление слизистой оболочки матки у крупного рогатого скота в послеродовой период - одна из самых распространенных патологий в большинстве животноводческих хозяйств. Клинической формой заболевания болеет каждая третья корова, в высокопродуктивных стадах диагностируют заболевание у 70-80% животных. Выбраковка и убой бесплодных животных вследствие эндометрита достигают 50% заболевших животных. Данная патология наносит ощутимый экономический урон, который складывается из снижения репродуктивной способности животного, молочной продуктивности и качества молока, и повышения затрат на лечение [206, 317, 354].
Актуальной задачей современных подходов лечения эндометритов у коров является комплексное воздействие на организм. Определяющим фактором высокой эффективности разрабатываемых фармакотерапевтических воздействий на организм больных животных должен предусматривать наряду с активизацией регенеративных процессов, удаление скопившегося экссудата и подавление патогенной микрофлоры, стимулирующую терапию в отношении клеточного и гуморального иммунных ответов, а также поддержание гормонального статуса и восстановление течения нормальных обменных реакций [35, 102]. В этом отношении большой интерес представляют лекарственные препараты, получаемые путем синтетических трансформаций веществ, выделяемых из дикорастущих и культивируемых растений, отличающиеся высокой фармакологической активностью и биодоступностью, многонаправленностыо вызываемых эффектов при низкой токсичности [102].
Исходя из мировой практики наиболее перспективными в этом направлении являются производные пиримидина и аддукты лево- и малеопимаровой кислот с дополнительным включением в их терпеноидную структуры фармако-форных групп [36, 39, 317].
Задачей наших исследований явился поиск новых более эффективных и безопасных, в сравнении с существующими аналогами, способов фармакологического воздействия на этиопатогенез при лечении катарально-гнойного эндометрита у коров. Задачами исследований явилось научное обоснование влияния композиции полусинтетического терпеноида, представленного монометиловым эфиром кетотетракарбоновой кислоты, с анальгезирующим, противовоспалительным средством «Анилокаин», и антибактериальным препаратом фторхи-нолоновой структуры - «Полифлоксацин», на организм коров при лечении катарально-гнойного эндометрита, с учетом возможного синергидного эффекта.
Исследования проведены на коровах черно-пестрой породы с признаками катарально-гнойного послеродового эндометрита. После клинического исследования, 36 животных с признаками эндометрита объединили в группы по принципу аналогов. Лечение коров проводили, применяя следующие терапевтические приемы:
1.Полость матки промывали теплым раствором фурациллина в разведении 1:5000; 2. После промывания в полость матки вводили свечи на желатиново-глицериновой основе: животным 1-й и 2-й опытных групп с композициями МЭК+А+П и МАОП+А+Э в дозах 4 мг/кг соответственно, а, животным контрольной группы фармакопейные свечи с фуразолидоном;
3. Внутримышечно назначали окситоцин (в зависимости от живой массы и тонуса мускулатуры матки);
4. Возместительную витаминизацию осуществляли внутримышечным введением масляного раствора комплекса жирорастворимых витаминов -«Тетрамаг».
О течении патологического процесса родовых путей коров опытных групп судили на основании клинических исследований, предшествующих терапевтическому воздействию на организм животных с использованием предлагаемых схем, а также на основании ректальных исследований, проводимых 1 раз в 5 суток, а при снижении интенсивности патологического процесса — 1 раз в 2-е суток.
При анализе результатов исследования крови здоровых коров (фоновые показатели) существенных изменений и отклонений от физиологической нормы нами не установлено, тогда как при исследовании крови коров с острым течением катарально-гнойного эндометрита отмечено значительное увеличение в ней количества лейкоцитов (на 43,49% больше чем у здоровых), при этом в лейкограмме преобладали лимфоциты - 61,03±0,63 (на 37,33% больше по сравнению со здоровыми) с одновременным снижение количества сегментоядерных нейтрофилов до 24,65±1,25 (на 31,47% меньше по сравнению со здоровыми). При морфологическом исследовании крови коров с острым послеродовым эндометритом нами установлена нейтропения и моноцитопения, а биохимические показатели сыворотки крови характеризовались понижением уровня общего белка и бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК), свидетельствующих о выраженном течении воспалительной реакции и об истощении иммунного ответа.
Проведенными исследованиями было установлено, что применение композиций МЭК+А+П (1:2:0,2) и МАОП+А+Э (1:2:0,2) в дозах 4 мг/кг (по ДВ) при лечении острого катарально-гнойного эндометрита у коров способствовало более быстрому восстановлению общего состояния по сравнению с контрольной группой. Так на 2-4-е сутки у коров опытных групп отмечено улучшение аппетита, положение тела в пространстве становилось естественным. На 7-е сутки лечения с применением композиции МЭК+А+П и на 8-9-е сутки лечения с применением композиции МАОП+А+Э исчезали отечность и гиперемия слизистых оболочек, шейка матки закрывалась, истечения отсутствовали. Рога матки при ректальном исследовании были упругими с хорошо сформированной межрого-вой бороздой. При ректальном исследовании также отсутствовали признаки накопления экссудата в полости матки, а бактериологическими исследованиями влагалищной слизи не обнаруживалось наличие в ней патогенной микрофлоры.
После применения в составе фармакотерапии внутриматочных свечей с композицией МЭК+А+П, на седьмые-восьмые сутки, наряду с признаками клинического выздоровления морфологические и биохимические показатели крови опытных коров восстанавливались до фоновых значений. При этом количество Т-лимфоцитов (таблица 24) в крови коров первой опытной группы превышало фоновые значения в 1,4 раз при одновременном усилении фагоцитарной активности (в -4,1 раз больше в сравнении с фоновым значением и значением 2-й опытной группы; в 1,3 раз больше в сравнении с показателями контрольной группы). Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК), уровень лизоцима и концентрация /?-лизина в крови коров 1-й опытной группы на 7-8-е сутки превышали фоновые значения в 1,2; 1,1 и 1,1 раз, тогда как во 2-й опытной группе эти показатели были сравнимыми с фоновыми, при учете референтности и достоверности в пределах Р 0,05. В контрольной группе коров, лечение острого катарально-гнойного эндометрита которых включало назначение свечей фу-разолидона, нами напротив отмечено понижение иммунологических показателей, не только в сравнении с фоновыми значениями, но и со значениями, установленными терапевтического воздействия.
Анализируя изменения состава белков в крови коров, нами было отмечено, что у животных контрольной группы (лечение по общей схеме) к тридцатым суткам послеродового периода показатели соответствовали исходному уровню, тогда как у животных обеих опытных групп отмечалось повышение уровня а-, /?-и у-глобулинов. К 14-м суткам исследований со стороны у-глобулинов в крови коров опытных групп отмечалось некоторое снижение концентрации по отношению к уровню альбуминов, что указывало на усиление регенеративных процессов, при которых альбумины выполняют пластическую функцию. В период с четырнадцатые по тридцатые сутки исследований уровень у-глобулинов в крови опытных животных имел стабильную тенденцию к повышению но не выходил за пределы физиологической нормы. Указанные изменения морфо-биохимического состава крови коров, подвергнутых лечению острого катараль-но-гнойного эндометрита с применением композиций МЭК+А+П и МАОП+А+Э в дозах 4 мг/кг (по ДВ) также указывают на улучшение регуляторной и бело-ксинтезирующей функций печени, связанное с вероятным восстановлением гормонального гомеостаза.
Анализируя динамику изменения гормонального гомеостаза у коров, нами отмечено стимулирующее влияние композиции МЭК+А+П (1:2:0,2) в дозе 4 мг/кг (по ДВ) на синтез и метаболизм кортикостероидов, что отражалось увеличением в плазме крови коров гормона кортизола на 21,41% (с 18,64+0,21 нг/мл до 22,63+0,48 нг/мл) к 14-м суткам исследований и последующим выравниванием этого показателя до фоновых значений - 13,27+0,68 нг/мл к 30-м суткам наблюдений (таблица 25).
