Введение к работе
Актуальность темы. Важной задачей ветеринарной фармакологии и токсикологии является разработка и изучение действия лекарственных веществ на организм животных, стимуляция продуктивности и воспроизводственной способности, профилактика и лечение животных (Антипов В.А. и др., 2007; 2009; Иванов А.В. и др., 2006; Дорожкин В.И., Смирнов А.М.,2008). Важное народнохозяйственное значение приобретает разработка теоретических основ и практических приемов безопасных и экономически оправданных методов стимуляции роста сельскохозяйственных и промысловых животных (Тремасов М.Я., Иванов А.В. и др., 2006; Тремасов М.Я., Папуниди К.Х. и др., 2012). В качестве средств стимуляторов роста в недавнем прошлом в нашей стране и за рубежом использовался паприн и его различные добавки в составе комбикормов, в виде автолизата в составе регенирированного молока и т.д. (Яцко Н.А. и др., 1993; Кузнечик В.И., 1994).
Перспективным объектом, позволяющим добиться прогресса в решении этой задачи являются дрожжи Yarrowia lipolytica, что обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных биохимических особенностей (Barth G., Gaillardin C., 1997). За счет наличия пероксисом она способна расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая парафины нефти, коммунальные и промышленные стоки. Обладая мощным аэробным метаболизмом, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, эффективно разрушает ксенобиотики и токсины. В отличие от других видов дрожжей, Y. lipolytica обладает высокой алкало - и галотолерантностью, с высокой эффективностью секретирует белки во внешнюю среду. В течение 10 лет Y. lipolytica использовалась в СССР в качестве биореактора для производства кормового белка для животноводства в качестве субстрата парафинов нефти (паприн или белково-витаминный концентрат, БВК) в результате чего накоплены данные, подтверждающие безопасность и высокую кормовую ценность ее биомассы (Выслоух В.А. и др., 1987; Ибрагимов Ф.Б., Сычев А.Е. и др., 1995). В 2000 г надзорный орган США - Food and Drug Administration включил Y. lipolytica в список заведомо безопасных видов (GRAS), без ограничений пригодных для производства кормовых и пищевых ингредиентов. По данным (Guerzoni M.E. et al., 2001; Suzzi G. et al., 2001), живые клетки Y. lipolytica присутствуют в традиционных продуктах из регионов Италии. Для Y. lipolytica разработаны удобные генетические маркеры и методы трансформации, полностью определена последовательность генома типового штамма этого организма. В совокупности, все это позволяет применять для исследования Y. lipolytica современные методы транскриптомного и протеомного анализа, конструи-ровать на ее основе рекомбинантные штаммы.
Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин (GHRH), который оказывает положительное влияние на продуктивность сельскохозяйственных животных, в частности, способствует повышению скорости роста и при этом обладает высокой устойчивостью к протеолизу. До начала работы были получены данные о возможности достижения анаболического эффекта в отношении мышей и поросят соматолиберина свиньи, перорально доставляемого с помощью живых пробиотических штаммов мезофильных бацилл.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилась разработка нового метода получения безопасной кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма Y. lipolytica, служащей источником полноценного белка для кормления животных и обеспечивающей ускоренный рост животных за счет анаболического эффекта соматолиберина.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить метаболический потенциал Y. lipolytica для создания эффективной в питательном отношении, дешевой в производстве кормовой добавки, оценив ее способность к детоксификации ингредиентов комби-кормов.
2. Изучить фармакологические и токсикологические свойства разрабо-танной кормовой добавки на основе биомассы Y. Lipolytica.
3. Разработать новую интегративную генетическую систему на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка VDAC, позволяющую экспрессировать в клетках Y. lipolytica гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.
4. Получить опытный образец кормовой добавки на основе рекомбинантного штамма Y. lipolytica, несущего ген соматолиберина, и провести его испытания на животной модели.
Научная новизна работы. Впервые показана кормовая эффективность и отсутствие острой и субхронической токсичности, а также раздражающих и аллергизирующих свойств кормовой добавки на основе биомассы Y. lipolytica, выращенной в условиях активации аэробного метаболизма: метаболический потенциал Y. lipolytica обеспечивает детоксикацию низкосортного сырья и повышение его биохимической полноценности. Разработана оригинальная система рекомбинантной экспрессии на основе промотора потенциал–зависимого митохондриального порина VDAC. Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе рекомбинантного штамма Y. lipolytica. На модели мышей впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении вегетативных цельных клеток Y. lipolytica, содержащих зрелую форму GHRH. Доказано, что эти клетки могут рассматриваться в качестве эффективного микроконтейнера для пероральной доставки широкого круга белков и пептидов животным, обеспечивающих их сохранность в условиях высокой протеолитической активности дуоденального и кишечного химуса.
Практическая ценность работы. На примере Y. lipolytica продемон-стрирован универсальный принцип адаптации к стрессам, позволяющей ей эффективно распознавать и метаболизировать ксенобиотики и другие нежелательные компоненты кормовых ингредиентов.
Вновь обнаруженная особенность Y. lipolytica использована для решения практической задачи: конструирования новой системы доставки биологически активных пептидов животным. В результате проведенных исследований создана экономически эффективная и безопасная для человека альтернативная к синтетическим стероидным гормонам система на основе живых продуцентов белковых ростовых факторов на базе безопасных микроорганизмов Y. lipolytica. Дешевое производство биомассы этого вида дрожжей позволяет обеспечить доступность препарата для массового использования.
Результаты работы могут быть положены в основу новой технологии производства и применения кормовых добавок, обладающих анаболическим эффектом. Кроме того, разработанная технология может быть использована при создании продуцентов других биологически активных соединений на основе Y. lipolytica, в частности, антигенов вакцинного назначения для пероральной иммунизации сельскохозяйственных животных, различных лекарственных средств.
Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», 2006; II съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России»; Bari Intern. Symposium on «Мitochondrial. physiology and pathology» IUDMB Sympos. S1 Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты способности кормовой добавки на основе биомассы Y. lipolytica к детоксикации ингредиентов комбикормов.
- Фармакотоксикологическая оценка кормовой добавки на основе биомассы Y.lipolytica.
- Эффективность новой интегративной генетической системы на основе впервые предложенного промотора стресс-индуцибельного белка VDAC, позволяющего экспрессировать в клетках Y. lipolytica гетерологичные гены в условиях промышленного производства кормовой добавки.
- Эффективность Y.lipolytica в качестве микроконтейнера для пероральной доставки соматолиберина животным.
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 125 страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 26 рисунками. Список использованной литературы содержит 170 библиографических источников, из них 125 иностранных.
